人胎视网膜色素上皮细胞的冻存和复苏

目的：冻存和复苏人胎视网膜色素上皮细胞，为视网膜色素上皮移植治疗视网膜色素变性提供组织来源。 方法：取第3代胰酶消化法获取的人胎儿视网膜色素上皮细胞进行冻存，复苏后经台盼蓝染色测定细胞存活率，角蛋白抗体免疫细胞化学染色鉴定细胞。 结果：复苏后的视网膜色素上皮细胞在体外生长良好，抗角蛋白反应阳性，细胞具有较高的存活率［(84.9%±3.2)%］。 结论：冻存和培养RPE细胞为细胞移植提供了一个良好的来源。     

人胚虹膜色素上皮细胞的初步培养和鉴定

目的:建立人胚虹膜色素上皮细胞(IPE)分离、纯化培养体系并进行鉴定,为进一步研究IPE提供实验基础.方法:取胎龄为15周左右新鲜水囊引产的人胚眼球,取下虹膜组织,用胰蛋白酶消化,将虹膜色素上皮细胞置于培养瓶中,2周后传代,倒置相差显微镜观察,并取对数生长期细胞分别用透射电镜和扫描电镜检查,用单克隆鼠抗角蛋白抗体(AE1/AE3)标记培养细胞进行鉴定.结果:用胰酶分离消化法,人胚虹膜色素上皮细胞易分离和贴壁.细胞形态与视网膜色素上皮细胞形态极为相似,表现为多边形和梭形两种形态,胞质内含色素颗粒,传代细胞内的色素颗粒比原代细胞的色素颗粒少.免疫细胞化学染色阳性,胞质内见棕黄色染色.结论:人胚虹膜色素上皮细胞分离、纯化的实现为IPE细胞生理功能和IPE移植的深入研究提供了可能.     

牛眼视网膜和虹膜色素上皮细胞体外培养的生物学特性比较

目的分离、培养和纯化牛原代视网膜色素上皮细胞(RPE)和虹膜色素上皮细胞(IPE),比较体外培养的RPE与IPE的生物学特性。方法采用酶辅助显微分离牛眼RPE和IPE,进行体外培养,密度梯度离心法纯化并采用免疫组化法进行鉴定。透射电镜观察体外培养RPE、IPE的超微结构,比较两种细胞体外培养下的生长状况。结果纯化后体外培养牛RPE和IPE的角蛋白表达强阳性,细胞阳性率分别达到94%和88.7%。原代培养的牛RPE和IPE外形类似,为多角形,具有相似的生长曲线。电镜显示两种细胞都具有细胞极性,顶端有大量微绒毛,原代细胞内含有大量色素颗粒和内质网,RPE含有较多与其吞噬功能相适应的溶酶体。结论通过酶辅助显微分离色素上皮细胞,结合密度梯度离心的方法可以获得较纯的牛RPE和IPE,该方法同样适用于周切虹膜材料。两种色素上皮细胞具有相似的形态和生物学性状,但仍然存在与功能相适应的超微结构差异。     

牛眼视网膜和虹膜色素上皮细胞体外培养的生物学特性比较

目的 分离、培养和纯化牛原代视网膜色素上皮细胞(RPE)和虹膜色素上皮细胞(IPE),比较体外培养的RPE与IPE的生物学特性.方法 采用酶辅助显微分离牛眼RPE和IPE,进行体外培养,密度梯度离心法纯化并采用免疫组化法进行鉴定.透射电镜观察体外培养RPE、IPE的超微结构,比较两种细胞体外培养下的生长状况.结果 纯化后体外培养牛RPE和IPE的角蛋白表达强阳性,细胞阳性率分别达到94%和88.7%.原代培养的牛RPE和IPE外形类似,为多角形,具有相似的生长曲线.电镜显示两种细胞都具有细胞极性,顶端有大量微绒毛,原代细胞内含有大量色素颗粒和内质网,RPE含有较多与其吞噬功能相适应的溶酶体.结论 通过酶辅助显微分离色素上皮细胞,结合密度梯度离心的方法可以获得较纯的牛RPE和IPE,该方法同样适用于周切虹膜材料.两种色素上皮细胞具有相似的形态和生物学性状,但仍然存在与功能相适应的超微结构差异.     

异体恒河猴视网膜色素上皮细胞移植探讨

目的 观察供体视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)在视网膜下腔生长情况,为视网膜色素上皮细胞移植的临床应用提供实验基础.方法 体外获取恒河猴视网膜色素上皮细胞经传代培养至第3代,用5-溴脱氧尿嘧啶标记后经外路将供体色素上皮细胞移植到受体恒河猴视网膜下腔,用光镜和电镜观察移植细胞的存活情况.结果 供体细胞在受体视网膜下腔形成有极性的单细胞层,贴附于Brueh膜上,并形成微绒毛和基底内褶,细胞内可见吞噬体.结论 外路法是一种切实可行的视网膜色素上皮移植方法,移植后的细胞可存活并恢复正常的结构和功能.     

视网膜色素上皮细胞培养及移植进展

视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞的代谢障碍与许多眼底疾病的发病有着密切的关系。将体外分离、培养的视网膜色素上皮细胞移植入患眼治疗眼底疾病是当今眼科研究的热点之一。现将目前有关于RPE细胞体外分离、培养及移植的研究进展进行综述。     

家兔虹膜色素上皮细胞移植的实验研究

目的比较直接分离和体外培养的继二代有色素家兔虹膜色素上皮(IPE)细胞移植于无色素家兔视网膜下间隙后的存活状况。方法分别选用经酶-显微解剖-酶分离法直接分离的有色素家兔虹膜色素上皮细胞,和经过体外培养至继二代的有色素家兔虹膜色素上皮细胞,制成相同密度的IPE细胞悬液。采用术中检眼镜定位的外路移植法将其植入无色素家兔视网膜下间隙。术后每日直接检眼镜观察眼底,并分别于术后的第1、2、4、8、12、16周对兔眼移植区作光镜检查。结果两种不同方式制备的有色素家兔虹膜色素上皮细胞均可在无色素家兔视网膜下间隙存活。其中,经体外培养的虹膜色素上皮细胞移植后呈较均匀的单层排列。植入的虹膜色素上皮细胞在观察期内均未见明显炎症和排斥反应。结论检眼镜定位的外路法可以将供体家兔IPE细胞成功移植在受体眼视网膜下间隙,经体外培养的继二代家兔虹膜色素上皮细胞存活形态好于直接分离的家兔虹膜色素上皮细胞。     

人羊膜上皮细胞的分离、纯化和其生物学特性研究

目的 体外分离人羊膜上皮细胞并纯化,对体外培养的人羊膜上皮细胞的生物学特性进行相关研究。方法 取足月剖宫产的人羊膜组织,经胰蛋白酶、胶原酶和Dnase酶消化后,采用差异黏附法获得纯度高的羊膜上皮细胞,接种于含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养,用HE染色法对培养细胞进行形态学观察,并采用免疫组化法检测细胞角蛋白CK7、CK8、CK18在体外培养的人羊膜上皮细胞中的表达。结果 经不同的消化酶消化和差异黏附法筛选后能获得纯度较高的人羊膜上皮细胞,在体外培养条件下人羊膜上皮细胞呈上皮细胞特有的铺路石样外观,并能连续传代8-10次,细胞角蛋白CK7、CK8、CK18在其胞浆中呈阳性表达。结论 人羊膜上皮细胞能在体外成功分离、纯化、培养并增殖,为人羊膜上皮细胞的进一步研究及其在细胞移植和组织工程中的应用奠定了实验基础。     

人羊膜上皮细胞的分离、纯化及其生物学特性研究

目的 体外分离人羊膜上皮细胞并纯化,对体外培养的人羊膜上皮细胞的生物学特性进行相关研究.方法 取足月剖宫产的人羊膜组织,经胰蛋白酶、胶原酶和Dnase酶消化后,采用差异黏附法获得纯度高的羊膜上皮细胞,接种于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养,用HE染色法对培养细胞进行形态学观察,并采用免疫组化法检测细胞角蛋白CK7、CK8、CK18在体外培养的人羊膜上皮细胞中的表达.结果 经不同的消化酶消化和差异黏附法筛选后能获得纯度较高的人羊膜上皮细胞,在体外培养条件下人羊膜上皮细胞呈上皮细胞特有的铺路石样外观,并能连续传代8～10次,细胞角蛋白CK7、CK8、CK18在其胞浆中呈阳性表达.结论 人羊膜上皮细胞能在体外成功分离、纯化、培养并增殖,为人羊膜上皮细胞的进一步研究及其在细胞移植和组织工程中的应用奠定了实验基础.     

色素上皮细胞移植的研究现状

目前,视网膜变性疾病还没有一种真正有效的治疗方法,色素上皮细胞移植取得了初步成效,对此进行综述。1色素上皮细胞移植手术方法目前主要限于动物实验,临床只有小样本的实验报告。细胞来源包括视网膜色素上皮细胞(retinalpigmentepithe lium,RPE)和虹膜色素上皮细胞(irispigmentepithelium,IPE)。移植方法主要有两种[1]:(1)外路法:分离并剪断上直肌,暴露近黄斑区的后巩膜,作厚近全层的巩膜瓣,用特制针头刺破其下的脉络膜约4mm,将RPE细胞注入视网膜下腔。(2)内路法:经睫状体扁平部作切口,先行玻璃体切割,再用特制针头刺破中央凹颞上方的视网膜,注入平衡液造成小范围的网脱,然后植入RPE细胞。2色素上皮细胞移植结果2.1视网膜色素上皮细胞的移植动物实验:运用上述方法将RPE细胞移植于视网膜下,10天后感光细胞内节变长,14天后外节变长,21天后大多数RPE细胞贴附于Bruch膜上,28天后移植区视网膜外核层增厚,感光细胞数目增加。RPE细胞和宿主感光细胞外节紧密接触,具有顶部和基底部的极性特征,且能吞噬感光细胞脱落的外节膜盘。临床实验:Algvere[2]将人胚胎视网膜色...     

猪视网膜色素上皮细胞的体外培养

目的：将猪视网膜色素上皮(RPE)细胞进行体外培养，为研究RPE细胞的功能及治疗有关眼底疾病提供细胞来源。方法：采用胰酶2次消化法分离猪RPE细胞，15％DMEM培养液培养，每天倒置显微镜观察细胞生长情况，并作流式细胞仪分析培养细胞的细胞周期。以免疫组织化学法鉴定培养细胞的来源。结果：离体培养细胞初期呈圆形，富含黑色素，12～24h贴壁呈圆形、梭形及不规则形。传代后细胞渐趋透明。免疫组化证实RPE细胞均为鼠抗人角蛋白染色阳性。细胞周期分析提示体外培养的RPE细胞保持正常的繁殖能力。结论：培养的细胞可作为体外猪RPE细胞的来源。     

兔视网膜色素上皮细胞培养和鉴定

目的：进行兔视网膜色素上皮细胞(RPE)细胞的体外培养，探讨RPE培养与鉴定方法，为研究其生理功能、生化特征和病理过程提供细胞模型。方法：用改良的眼杯固定法，将其固定在眼球托上，用胰酶直接消化视网膜色素上皮面，收取RPE细胞。作细胞形态学、免疫组织化学、免疫荧光鉴定。结果：RPE细胞培养早期生长活跃、胞核透明、胞浆含丰富黑色素颗粒，多巴氧化酶呈阳性反应．免疫组织化学染色和免疫荧光染色提示角蛋白表达强阳性。结论：培养的大量细胞可用于RPE的体外实验研究，多巴染色是鉴定RPE细胞一种较好的方法。     

兔视网膜色素上皮细胞的体外培养及超微结构研究

目的：将兔视网膜色素上皮（ＲＰＥ）细胞进行体外培养,观察其超微结构。方法：用胰酶消化法培养兔ＲＰＥ细胞并传代。扫描电镜和透射电镜观察其超微结构。结果：原代培养的ＲＰＥ细胞含大量色素呈多角形,传代的细胞透明呈梭形。电镜显示它们具有细胞极性,含黑色素颗粒、各种细胞器、细胞间连接复合体,与体内一致。结论：培养的大量细胞可用于ＲＰＥ的体外实验研究。     

微囊化牛视网膜色素上皮细胞体外BDNF及GDNF分泌特性的研究

目的检测体外培养的牛视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE）脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）及胶质源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）分泌特点，并观察微囊包裹对细胞存活率及BDNF和GDNF分泌的影响。方法原代培养牛RPE，用高压静电成囊装置制备海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化细胞，台盼兰染色法检测囊内细胞活性，ELISA法检测BDNF及GDNF分泌量。结果原代及传代后RPE上清液中在基础状态下就能够检测到BDNF和GDNF，传代后两者的分泌量较原代无显著差异。微囊化细胞BDNF和GDNF分泌量在1-5 d与未微囊化细胞相比显著降低（P〈0.01），而6-8 d两组无显著差异。囊内活细胞数及BDNF和GDNF分泌量在体外培养的第14天至第21天趋于稳定。结论RPE基础状态下就能够分泌少量BDNF和GDNF，且不受传代及微囊包裹的影响。体外培养21 d后仍检测到囊内细胞的存活及BDNF和GDNF的分泌。牛RPE是一种具有一定前景的帕金森病细胞移植的供体。     

条件培养液对人视网膜前体细胞分化的诱导

目的:研究各种培养液对人视网膜前体细胞(RPC)的诱导分化作用.方法:分离培养3～5个月人胚胎RPC,分别用胎牛血清(FBS组)、视网膜组织培养上清(RE组)、视网膜色素上皮培养上清(RPE组)诱导分化.采用免疫组化SP法检测细胞诱导前后Nestin、微管相关蛋白-2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、视紫红质(Rho-dopsin)及蛋白激酶C(PKC)和钙结合蛋白(Calbindin)的表达情况,流式细胞术检测诱导后MAP-2、GFAP及Rhodopsin阳性细胞数.结果:原代及传代培养的RPC表达Nestin,能分裂增殖,形成子代细胞团.RE组和FBS组细胞诱导分化后形态多样,连接广泛;RPE组细胞呈圆形,不贴壁.诱导分化后RE组细胞MAP-2的表达高于RPE组和FBS组(P＜0.01),而Rhodopsin的表达低于RPE组(P＜0.01);GFAP的表达在RPE组最低,RE组较高,FBS组最高(P＜0.05).结论:不同培养基诱导可使人RPC的分化产生差异.     

人胚胎RPE细胞在微孔聚酰胺纳米纤维膜和蚀刻多孔聚酯膜上生长的比较研究

目的: 比较观察人胚胎视网膜色素上皮(RPE)细胞在微孔聚酰胺纳米纤维膜(EPN)和蚀刻多孔聚酯膜(EPP)上的生长情况,为理想Bruch’s 膜替代物的研究奠定实验基础。方法: 人胚胎RPE细胞培养在底分别为EPN(EPN组)、EPP(EPP组)的Transwell 小室以及常规Transwell小室(对照组)。在第2,4,8 h和第1,4,8天分别评估3组细胞的贴壁和增殖情况。对比观察细胞生长形态及两种替代物的表面结构;免疫荧光染色观察RPE细胞ZO-1的表达。通过组织病理切片观察EPN和EPP植入21天龄(P21) RCS大鼠视网膜下间隙2周后的生物学反应。结果: 接种8 h(密度为4×10⁵/cm²)后,EPN组, EPP组和对照组RPE细胞贴壁生长数量分别为1.23×10⁵/cm²,1.70×10⁵/cm²和1.64×10⁵/cm²,其中EPN组细胞数量明显少于EPP组及对照组(P<0.05);以2.5×10⁵/cm²的密度接种后第1天,EPN组细胞密度明显低于EPP组和对照组(P<0.05),但在接种后第8天,EPN组细胞数量显著多于EPP组和对照组(P<0.05)。EPN 和EPP均支持RPE 单细胞层形成,前者纤维排列类似Bruch’s 膜内胶原层;与对照组比,EPN和EPP组RPE细胞均呈现较强的ZO-1表达,较好地保持了原代RPE细胞表型;EPP和EPN植入视网膜下间隙后出现纤维包裹和光感受器层破坏、丢失,但在移植物附近未见明显毒性或排斥等其他异常反应。结论: EPN和EPP均支持人胚胎RPE细胞生长,二者植入P21 RCS大鼠视网膜下间隙后存在大体生物相容性。EPN的纤维排列与Bruch’s膜内胶原层相近,可能是一种具有广阔发展前途的Bruch’s 膜替代物。     

培养人视网膜色素上皮细胞的免疫细胞化学特征

目的：观察体外培养人视网膜色素上皮细胞（ＲＰＥ）免疫组化特征．方法：取第１代、第３￣６代ＲＰＥ,以间接免疫荧光方法比较角蛋白、波形蛋白、肌动蛋白、ＶⅢ因子和ＧＦＡＰ,ＨＡＭ４５等６种蛋白表达的特征．结果：与对照组相比,传代培养的人ＲＰＥ角蛋白、波形蛋白表达呈阳性;随传代次数增多,角蛋白表达强度无明显变化,波形蛋白表达逐渐增强;肌动蛋白、ＶⅢ因子、神经纤维酸性蛋白（ＧＦＡＰ）、ＨＭＢ４５呈阴性．结论     

胎鼠听囊细胞体外培养研究

目的:了解哺乳动物听觉细胞的来源,探索听觉细胞前体细胞体外增殖和分化. 方法:取孕鼠胚胎听囊细胞进行体外培养,用免疫细胞化学方法,分别对培养的细胞进行细胞角蛋白、F-肌动蛋白和calretinin染色观察细胞特征;BrdU染色观察细胞增殖. 结果:培养的细胞在体外进行分化和增殖,细胞形态主要有上皮细胞形态、成纤维细胞形态和神经细胞形态3种. 对细胞角蛋白和F-肌动蛋白这两种上皮细胞的标志染色呈阳性. 在原代培养就出现calretinin染色明显阳性的细胞. 传代后结果仍为阳性着染,但强度减弱. BrdU染色显示培养细胞具有明显的增殖活性. 本研究共传8代,历时4 mo,细胞形态维持稳定. 结论:胎鼠听囊细胞在体外自然培养条件下可以分化或者增殖为未成熟毛细胞. 本研究为探索刺激听觉毛细胞再生的治疗方法提供研究思路和方法.     

人羊膜上皮细胞的原代及传代培养

目的 建立体外培养人羊膜上皮细胞的方法,观察体外培养的羊膜上皮细胞的生物学特性.方法 取足月剖宫产术后羊膜,经胶原酶和胰蛋白酶消化后,获取的羊膜上皮细胞接种于含10%胎牛血清培养基中进行原代和传代培养,探索其合适的培养条件,用倒置显微镜观察培养的人羊膜上皮细胞体外生长的特征.用苏木精-伊红染色、扫描电镜和细胞角蛋白免疫组织化学染色的方法对培养细胞进行形态学观察和鉴定.结果 人羊膜上皮细胞可以在体外成功的培养传代,体外可连续传8～10代.体外培养细胞呈多角形,长满后呈上皮细胞特有的铺路石样外观.扫描电镜观察细胞表面有丰富的微绒毛.细胞角蛋白keratin单克隆抗体染色阳性.结论 人羊膜上皮细胞在体外可成功进行原代和传代培养,体外培养的人羊膜上皮细胞在一定时间内可维持增殖能力.     

高糖刺激人视网膜色素上皮细胞诱导型一氧化氮合酶表达及与p38 MAPK信号通路关系

目的:观察高糖刺激体外培养的人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,RPE)细胞表达诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的作用及其与p38信号通路(p38 mitogen activated protein kinase,p38 MAPK)的关系,从而进一步探讨糖尿病视网膜病变的发病机制.方法:培养人RPE细胞,分为对照组、高糖组、高糖 SB203580组和甘露醇组,采用四甲基氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力,免疫荧光染色法观察RPE细胞中磷酸化p38 MAPK和iNOS的蛋白表达.结果:①MTT检测结果:高糖可以抑制RPE细胞增殖,加入特异性p38 MAPK抑制剂SB203580预处理后,抑制作用减弱;②免疫荧光法检测结果:与对照组相比,高糖组磷酸化p38 MAPK,iNOS蛋白表达明显增高;加入SB203580预处理后,iNOS表达被显著抑制.结论:高糖能够抑制RPE细胞增殖,通过活化p38 MAPK信号通路刺激RPE细胞iNOS的表达,在糖尿病视网膜病变的发生发展中起重要作用.