耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因序列研究

目的研究杭州地区结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)对利福平(RFP)的耐受与rpoB基因突变的关系.方法随机挑选了90例结核杆菌感染的病例,选择了利福平作为主要的药物进行药敏实验,PCR扩增39株耐RFP结核分支杆菌的rpoB基因片段(580bp);测定扩增片段的序列,并与美国国立生物信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide)检索获得结核杆菌野生株(利福平敏感株)序列(登陆号:AJ749948)作对比分析.结果结果显示PCR结核测序方法得到了39例结核杆菌耐药株,51例敏感株,与药敏实验的方法检测的结果完全一致.测定的11株临床分离的耐药株中,526位或531位有突变,其中526位有突变的有7株,占耐药测定株63.6%,531位突变的有4株,占耐药测定株36.4%,未见两位点同时突变.检测的11株敏感株,未见526位或531位有突变.结论杭州地区结核分支杆菌耐利福平的发生与rpoB基因的526位或531位突变密切相关,与国外的报告基本相似.但526位突变占耐药测定株高达63.6%,如此高比例目前国内外未见相似报道.PCR扩增和产物测序将是临床检测结核分支杆菌耐利福平和耐多药的一种迅速、准确的方法.     

结核分杆杆菌rpoB基因突变的顺序研究

目的 了解南通地区耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变特征。方法 对36株临床分离菌株rpoB基因502-533位点进行序列测定。结果 耐利福平（RFP）分离株93．3％（28／30）存在rpoB基因突变，531位突变率53．3％（16／30），526位23．3％（7／30），526位23．3％（7／30），516位6．7％（2／30），联合突变3．3％（1／30），敏感菌株均无突变。结论 rpoB基因突变与利福平耐药密切相关，以531位突变为主。     

中国部分地区结核分支杆菌耐利福平、异烟肼和链酶素耐药基因的检测

目的研究我国部分地区耐利福平（RFP）、异烟肼（硼）和链酶素（SM）结核分支杆菌临床分离株rpoB基因、KatG、rpsL基因突变情况，评价其耐药分子机制。方法采用PCR和聚合酶链反应．单链构象多态性（PCR-SSCP）对373株结核分支杆菌临床分离株（其中敏感株148株，耐RFP、INH、SM株共225株）rpoB基因、KatG和砒基因进行检测。并对其中19株SSCP阴性的耐RFP株用双脱氧末端终止法进行测序分析。结果安徽省、北京市、上海市、河北省、河南省、辽宁省、吉林省结核分支杆菌耐RFP临床分离株rpoB基因突变率分别为90％、91％、90％、91％、90％、93％、91％；KatG基因突变率分别为69％、63％、71％、68％、67％、68％、65％，rpsL基因突变率71％、69％、74％、68％、70％、61％、76％，分别为经统计学处理不同地区间无显著性差异（X^2=0．46，P＞0．05）。同时rpoB基因敏感株均无突变，特异性为100％；KatG基因有3株发生突变，特异性为98％。19株SSCP阴性耐药株中经测序6株在531位密码子TCG→TIE，1株526位密码子CAC→TAC，7株发生在516位密码子GAC→GTC，5株未改变。结论我国不同地区耐利福平、异烟肼和链霉素的rpoB、KatG、rpsL耐药基因突变率大致相同，rpoB基因、KatG和rpsL基因突变分别是耐RFP、INH和SM结核分支杆菌耐药性产生的主要分子机制，PCR-SSCP可快速检测结核分支杆菌RFP、INH和SM耐药性。     

结核分支杆菌临床分离株rpoB基因突变的研究

目的：了解我院结核分支杆菌耐RFP临床分离rpoB基因的突变特点。方法：利用PCR和测序试验,分析了50株结核分支杆菌临床分离株及H37Rv标准株的rpoB基因,包括核心区域的81个碱基在内的184bp的基因片段,结果：20株敏感株未发现rpoB基因的突变,30株耐药株中,28株（93.3%）出现rpoB基因的突变,突变位置集中在rpoB基因核心区域内的27个氨基酸内,531,526两个密码子的突变率为60.7%（17／28）,未发现缺失或插入突变。高浓度耐药（R250）突变位置主要在531位氨基酸,占52.4%（11／21）,低浓度耐药（R50）突变位置主要在526位氨基酸,占57.1%(4/7)。结论：rpoB基因核心序列的检测,可作为利福平耐药的指标,对临床用药有指导意义。     

PCR-DNA测序技术检测结核分支杆菌耐多药基因突变的研究

目的应用PCR—DNA测序技术快速检测同时耐利福平和异烟肼结核分支杆菌分离株rpoB、KatG基因突变，评价其在检测结核分支杆菌耐多药性方面的价值。方法47株耐利福平和异烟肼结核分支杆菌临床分离株及30株结核分支杆菌敏感分离株用PCR—DNA测序技术分别检测rpoB、KatG基因突变。结果47株耐多药结核分支杆菌分离株中，检出43株rpoB基因突变，突变检出率为91．5％（43／47）；31株KatG基因突变，突变检出率为66．0％（31／47）；rpoB和KatG基因同时突变者31株，突变检出率为66．0％（31／47）。30株结核分支杆菌敏感株检出1株KatG基因突变。结论PCR—DNA测序技术方法敏感、准确、特异，可快速检测结核分支杆菌rpoB、KatG耐药基因突变，有利于耐多药结核分支杆菌耐药性的快速检测。     

结核分支杆菌rpoB基因突变与对利福平耐药的关系

目的:研究结核分支杆菌耐利福平(RFP)分离株rpoB基因突变情况并评价英应用价值.方法:采用多聚合酶链式反应-单链构象多态性分析法(PCR-SSCP法)对60株结核分支杆菌rpoB基因进行检测.结果:以结核分支杆菌标准株H37Rv为对照,60株PCR扩增阳性的结核分支杆菌中,共有32株发生突变,总突变率为53.3%(32/60);24株药物敏感株有4株rpoB基因有突变,突变率为16.7%;36株耐药株中,28株rpoB基因有突变,突变率为77.8%.耐药菌株突变率明显高于敏感菌株的突变率(P<0.05).结论:rpoB基因突变是耐RFP结核分支杆菌耐药性的主要分子机制;应用PCR-SSCP可快速检测结核分支杆菌对RFP的耐药性.     

等位基因特异性PCR法快速检测结核分枝杆菌常见耐药突变基因

摘要：目的：建立一套同步检测结核分枝杆菌(MTB)常见耐药突变基因的等位基因特异性PCR（AS-PCR）检测体系,以间接判断对利福平（RFP）与异烟肼（INH）的耐药性。 方法：用AS-PCR技术同步检测58株MTB临床分离株rpoB基因516位、526位和531位,katG基因315位及inhA基因-15位密码子突变,并与DNA测序结果进行比对。 结果：AS-PCR法对RFP耐药株检出率为95.1%（39/41）,其中rpoB基因531位、526位、516位点突变分别检出28株、10株、2株,包括531位与526位联合点突变1株;未检出突变的2株RFP耐药株经测序验证1株未发生突变、1株发生533位点突变;RFP敏感株均未检测到突变。AS-PCR法对INH耐药株检出率为86.5%（45/52）,其中katG基因315位点突变43株、inhA基因-15位点突变2株,未检出突变的7株INH耐药株经测序验证未见突变;INH敏感株均未检测到突变。 结论：等位基因特异性PCR能够快速检测MTB常见突变基因,具有较高的敏感性与特异性,快速经济、操作简便。     

结核分支杆菌利福平和链霉素耐药基因的快速检测

目的 :评估采用聚合酶链反应 -单链构象多态性 (PCR SSCP)同时检测rpsL基因、rpoB基因突变在结核分支杆菌耐链霉素 (SM )和利福平 (RFP)耐药性测定中的应用价值。方法 :采用PCR SSCP技术对 86株结核分支杆菌临床分离株rpsL基因、rpoB基因突变同时进行检测。即首先用PCR方法同时扩增RFP、SM的rpoB基因和rp sL基因 ,然后进行SSCP分析。结果 :以结核分支杆菌H3 7RV为对照 ,41株药物敏感株的rpsL基因、rpoB基因均未见SSCP图谱异常。特异性为 10 0 %。 45株同时耐链霉素和利福平的耐药株中 ,3 4株 (75 6% )有rpsL基因图谱异常 ;41株 (90 1% )有rpoB基因图谱异常。结论 :rpoB基因突变和rpsL基因突变与结核分支杆菌耐利福平和链霉素密切相关 ,应用PCR SSCP技术可同时快速检测结核分支杆菌对链霉素和利福平耐药性。     

聚合酶链反应-单链构象多态性技术快速筛选结核杆菌的利福平耐药性

目的：探讨利用分子生物学方法直接快速检测结核分枝杆菌利福平（RFP）药物敏感性的可行性。方法：应用聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术分别检测了40株RFP药物敏感及耐药的结核分枝杆菌临床分离株。先用PCR扩增rpoB基因，随后用SSCP方法鉴定其扩增产物有无突变，并与药敏试验结果作对照分析。结果：所有临床分离株均观察到rpoB基因PCR扩增产物。40株RFP敏感的临床分离株SSCP带谱与结核分枝杆菌H37RV标准株相同，40株RFP耐药株中37株检测到突变图谱。与Bactec结果对照，用PCR-SSCP技术检测结核分枝杆菌RFP耐药性的敏感性为93％，特异性为100％。结论：结核分枝杆菌耐RFP是其rpoB基因突变所致。PCR-SSCP技术可用于结核分枝杆菌RFP药物敏感性的直接快速检测。     

结核杆菌耐药性调查与基因突变分析

目的了解结核分支杆菌耐药性与基因突变情况,分析耐药表型与基因突变的相关性。方法从临床标本中分离培养、鉴定结核分支杆菌;应用药敏试验、单链探针反向杂交试验技术(LiPA)和基因测序分析结核分支杆菌耐药性与基因突变情况。结果50株结核分支杆菌中,12株耐异烟肼(INH),7株耐利福平(RFP),15株耐链霉素(SM),2株耐乙胺丁醇(EMB)。LiPA检测耐RFP菌株,4株rpoB基因531位TCG→TTG突变;耐INH菌株中5株KatG基因315位AGC→ACC突变;耐SM菌株中6株、SM敏感株1株rpsl基因43位AAG→AGG突变,1株耐SM菌株rpsl基因88位AAG→AGG突变;rrs基因未检测到突变;1株耐EMB菌株与1株EMB敏感株的embB基因306位发生ATG→GTG突变。结论本市结核分支杆菌的耐药性增加的趋势显著,加强监测与综合干预非常必要。     

银染单链构象多态性技术检测结核杆菌rpoB基因突变

目的探讨分子生物学方法在临床标本结核分枝杆菌利福平（ＲＦＰ）耐药性评估中的应用价值。方法设计针对ｒｐｏＢ基因１８３ｂｐ扩增引物,运用聚合酶链反应单链构象多态性分析（ＰＣＲＳＳＣＰ）银染色方法,检测了４５株结核杆菌临床分离株,并对其中部分菌株进一步做了ＤＮＡ序列分析。结果以药敏试验结果为对照,有１６株ＲＦＰ敏感株及２６株ＲＦＰ耐药株经ＳＣＰ方法得到检测,阳性占９３．３％,特异性１００％。对部分菌株１８３ｂｐ片断测序结果显示,ＲＦＰ敏感株无ｒｐｏＢ基因突变,耐药株均发生碱基突变,分别导致编码５３１及５２６位点的氨基酸改变。结论银染ＰＣＲＳＣＰ方法具有简便,快速,准确的特点,提高敏感性,可以对临床标本结核杆菌利福平耐药突变进行鉴定。序列分析证明结核分枝杆菌利福平耐药菌株有ｒｐｏＢ基因突变。     

Characterization of rpoB mutations in rifampin-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates from Kuwait and Dubai

Mutations conferring resistance to rifampin in rifampin-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates occur mostly in the 81 bp rifampin-resistance-determining region (RRDR) of the rpoB gene. In this study, 29 rifampin-resistant and 12 -susceptible clinical M. tuberculosis isolates were tested for characterization of mutations in the rpoB gene by line probe (INNO-LiPA Rif. TB) assay and the results were confirmed and extended by DNA sequencing of the PCR amplified target DNA. The line probe assay identified all 12 susceptible strains as rifampin-sensitive and the DNA sequence of RRDR in the amplified rpoB gene from two isolates matched perfectly with the wild-type sequence. The line probe assay identified 28 resistant isolates as rifampin-resistant with specific detection of mutation in 22 isolates including one isolate that exhibited hetro-resistance containing both the wild-type pattern as well as a specific mutation within RRDR while one of the rifampin-resistant strain was identified as rifampin-susceptible. DNA sequencing confirmed these results and, in addition, led to the specific detection of mutations in 5 rifampin-resistant isolates in which specific base changes within RRDR could not be determined by the line probe assay. These analyses identified 8 different mutations within RRDR of the rpoB gene including one novel mutation (S522W) that has not been reported so far. The genotyping performed on the isolates carrying similar mutations showed that majority of these isolates were unique as they exhibited varying DNA banding patterns. Correlating the ethnic origin of the infected TB patients with the occurrence of specific mutations at three main codon positions (516, 526 and 531) in the rpoB gene showed that most patients (11 of 15) from South Asian region contained mutations at codon 526 while majority of isolates from patients (6 of 11) of Middle Eastern origin contained mutations at codon 531.     

Relationship between rifampin MICs for and rpoB mutations of Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Japan.

We analyzed the relationship between rifampin MICs and rpoB mutations of 40 clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. A point mutation in either codon 516, 526, or 531 was found in 13 strains requiring MICs of > or = 64 micrograms/ml, while 21 strains requiring MICs of < or = 1 microgram/ml showed no alteration in these codons. However, 3 of these 21 strains contained a point mutation in either codon 515 or 533. Of the other six strains requiring MICs between 2 and 32 micrograms/ml, three contained a point mutation in codon 516 or 526, while no alteration was detected in the other three. Our results indicate that the sequencing analysis of a 69-bp fragment in the rpoB gene is useful in predicting rifampin-resistant phenotypes.     

基因芯片诊断耐多药结核病的临床多中心研究

目的 评估基因芯片法检测耐多药结核临床分离株的临床意义。方法采取分层抽样的方法分别从北京胸科医院、同济大学附属上海市肺科医院和广州市胸科医院保存的临床菌株库的耐药组和敏感组中,随机抽取利福平耐药株800株,异烟肼耐药株797株,耐多药株791株,利福平/异烟肼双敏感380株。用基因芯片法检测包括rpoB基因的511(T→C)、513(A→C,C→A)、516( G→T,A→T,A→G)、526( C→T,C→G,A→T,A→G)、531( C→T,C→G)、533( T→C)位点、katG的315(G→C,G→A)位点和inhA的-15(C→T)位点的耐药突变。以绝对浓度法药敏结果为金标准,计算基因芯片法的符合率、敏感度和特异度。同时对基因芯片法的核酸扩增产物进行测序,以验证基因芯片对核酸序列检测的准确性。结果以绝对浓度法药敏结果作为标准,基因芯片法检测利福平、异烟肼耐药和耐多药的符合率分别是93.7％(1 108/1 183)、83.8％ (994/1 186)、82.4％ (975/1 183)。检测利福平耐药的敏感度为92.0％ (733/797),特异度为97.2％( 375/386);检测异烟肼的敏感度为77.4％ (617/797),特异度为96.9％ (377/389);检测耐多药的敏感度为74.6％( 588/788),特异度为98.0％(387/395)。在利福平基因芯片检测为突变的菌株中,突变频率最高的位点是531( TCG),突变率为64.5％(480/744);在katG/ inhA突变菌株中,基因芯片检测为katG 315( AGC)单突变的为77.4％(487/629);且与测序结果基本一致,仅有5例菌株中不完全相符。其中1株异烟肼耐药菌基因芯片法检测为katG 315(G→C)突变,而测序结果为野生型,其余4株为基因芯片法未包含的突变类型。结论基因芯片法可快速可靠地检测结核临床分离株利福平和异烟肼的耐药性,有望在临床诊断中广泛应用。     

95例耐多药结核菌株rpoB基因突变的分子特征

目的:探讨广东地区MDR-TB菌株rpoB基因突变的分子特征.方法:对95例MDR-TB菌株rpoB基因453-564位密码子片段进行PCR-直接测序.结果:95例MDR-TB菌株rpoB基因突变率91.58％.86例为点突变,1例插入突变,未发现缺失.常见位点为531 (63.22％)、526(20.69％)、516(9.20％).其中:单位点突变69例(80.23％),双位点突变16例(18.60％),三位点突变1例(1.17％).511位点突变常同时伴有其他位点突变(57.14％).结论:主要突变位点与国内外报道基本相同,但各位点所占比例具有地域差异;联合突变率较高,占19.54％.512位点插入(AGGAGC)突变可能为新突变类型.     

结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼相关基因快速检测的应用研究

目的 利用DNA芯片检测技术直接检测痰标本中结核分枝杆菌耐利福平(RFP)、异烟肼(INH)相关的耐药基因(rpoB、katG/inhA),评价DNA芯片检测技术临床应用的可行性.方法 对586份涂阳痰标本使用L-J培养并用终点法确定其耐药性,同时利用DNA芯片检测技术检测痰标觋本中结核分枝杆菌的rpoB、katG/inhA常见基因突变位点的突变情况,比对两种方法的检测结果,对不符合的菌株测定其相应DNA序列,评估上述试验的准确性.结果 (1)586份涂阳痰标本,其中3(+)163份、2(+)204份、1(+)217份,培养阳性584份.耐药结果显示,对INH、RFP敏感的菌株分别为361株和327株,耐药菌株分别为223株和247株,其中低浓度耐药、高浓度敏感菌株分别为93株和59株,低浓度、高浓度均耐药菌株分别为130株和188株.(2)耐药基因特异性片段扩增阳性标本367份(62.8%)、阴性217份(37.2%).对INH耐药相关基因(katG/inhA)突变检出率是28.4%,突发发生位点集中在katG315位密码子(89.8%);对RFP耐药相关基因(rpoB)突变检出率是55.9%(137/247),突变发生位点主要在rpoB 531和rpoB 526位密码子,发生率分别是68.6%和16.1%.(3)对L-J药敏结果与DNA芯片检测结果不符的菌株进行DNA序列分析,发现有漏检现象.结论 DNA芯片技术直接检测样本中结核分枝杆菌的相关耐药基因存在可行性,如直接应用于临床样本检测,关键要解决样本中DNA的提取效率、PCR的扩增效率和试验的质量控制.     

结核分枝杆菌临床分离株利福平耐药表型及rpoB基因型分析

目的分析结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)临床分离株利福平(rifampin,RFP)耐药表型及rpoB基因突变关系,阐明MTB RFP耐药株rpoB基因突变特征。方法采用改良罗氏培养基比例法检测387株MTB临床分离株对RFP敏感性,并进行rpoB基因测序。对经测序rpoB基因511位和533位密码子突变株进行RFP最小抑菌浓度(MIC)检测。结果比例法检测387株MTB临床分离株中1,98株RFP耐药株,189株RFP敏感株。rpoB基因测序结果表明1,98株比例法RFP耐药株中1,92株(96.97%)发生rpoB基因突变,涉及16种单位点和24种双位点密码子联合突变类型,单位点和双位点密码子联合突变率分别为84.34%(167/198)和12.63%(25/198),其中发现1种单位点和21种双位点密码子联合突变新类型。最常见的突变位点为531位(51.01%)、526位(21.21%)和516位(7.07%)密码子。6株(3.03%)耐药株在rpoB测序范围内未见突变。189株比例法RFP敏感株中,174株(92.06%)在rpoB基因测序范围内未见突变1,5株(7.94%)发生突变,其中7株CTG511CCG(Leu→Pro)突变和6株CTG533CCG(Leu→Pro)突变。511位和533位密码子突变株MIC检测结果提示其突变与低度耐RFP相关。结论所得数据及一些新的发现为进一步研究MTB RFP耐药机制、研制快速新型分子药敏试验方法提供理论和实际应用依据。     

Characterization of spontaneous, In vitro-selected, rifampin-resistant mutants of Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv

Resistance to rifampin in Mycobacterium tuberculosis results from mutations in the gene coding for the beta subunit of RNA polymerase (rpoB). At least 95% of rifampin-resistant isolates have mutations in rpoB, and the mutations are clustered in a small region. About 40 distinct point mutations and in-frame insertions and deletions in rpoB have been identified, but point mutations in two codons, those coding for Ser(531) and His(526), are seen in about 70% of rifampin-resistant clinical isolates, with Ser(531)-to-Leu (TCG-to-TGG) mutations being by far the most common. To explore this phenomenon, we isolated independent, spontaneous, rifampin-resistant mutant versions of well-characterized M. tuberculosis laboratory strain H37Rv by plating 100 separate cultures, derived from a single low-density inoculum, onto rifampin-containing medium. Rifampin-resistant mutants were obtained from 64 of these cultures. Although we anticipated that the various point mutations would occur with approximately equal frequencies, sequencing the rpoB gene from one colony per plate revealed that 39 (60.9%) were Ser(531) to Leu. We conclude that, for unknown reasons, the associated rpoB mutation occurs at a substantially higher rate than other rpoB mutations. This higher mutation rate may contribute to the high percentage of this mutation seen in clinical isolates.     

焦磷酸测序技术快速检测结核分枝杆菌利福平耐药性研究

目的利用焦磷酸测序技术，建立一种高通量结核分枝杆菌利福平耐药性快速基因检测方法。方法应用生物素标记的引物扩增rpoB基因片段，经链亲和素标记的磁珠分离制备单链模板，设计2个测序引物在焦磷酸测序仪上检测rpoB基因耐药突变区的81bp序列突变情况，与H。Rv序列比对后判断耐药结果。结果通过建立的基于焦磷酸测序技术的结核分枝杆菌rpoB基因突变检测平台，32株利福平耐药株均在rpoB基因片段上检测到突变，22株利福平敏感株未检测到突变，检测结果与直接测序符合率达100％。结论本方法可快速、准确、高通量检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变。     

首次复治肺结核病结核分枝杆菌对利福平耐药性与rpoB基因RRDR突变的研究

目的：研究分离自首次复治肺结核病患者的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）临床菌株对利福平的耐药性, 及其与rpoB基因利福霉素耐药决定区（rifampicin resistance determining regions, RRDR）位点突变间的相关性。方法：收集2013年2月至2013年12月国内19家医院的首次复治肺结核患者的Mtb, 进行利福平药敏检测;使用PCR技术检测Mtb的rpoB基因RRDR位点突变。结果：来自全国12个省19家医院共141例患者的141株临床菌株获得药敏结果, 而RRDR位点测序分析显示首次复治结核患者中有53%（75/141）对利福平耐药。RRDR DNA测序共检测到72株Mtb存在rpoB耐药突变区突变, 其中71株的突变发生在RRDR, 主要突变位点分别为531位（42株）、526位（11株）和516位（10株）。有75株Mtb对利福平耐药, 其中70株（93.3%）检测到rpoB突变, 69株的突变发生在RRDR;除了2株L511P、H526N突变的Mtb对利福平敏感, 70株rpoB突变株均对利福平耐药。对于复治结核患者, 检测RRDR突变判断利福平耐药有较高的特异度。结论：首次复治肺结核病患者对利福平耐药率较高, Mtb耐利福平与rpoB基因RRDR突变密切相关, RRDR突变检测可以用于快速鉴定复治肺结核病患者的Mtb利福平耐药。