神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤后Caspase-3和c-fos表达的影响

目的研究神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤后Caspase-3和c-fos表达的影响。方法 SD大鼠45只,随机分成3组(n=15):假手术组、脊髓损伤模型组(模型组)和神经干细胞移植组。假手术组仅打开锥板但不离断脊髓;模型组动物锥板打开后横向断开脊髓,止血并逐层缝合;神经干细胞移植组椎板打开后横向断开脊髓,止血并注入神经干细胞悬液,再逐层缝合。手术后1、2、3和14 d对大鼠进行神经功能评分(BBB评分)。14 d后处死动物,取脊髓组织,部分用于制备切片并进行TUNEL标记,检测神经细胞(神经元)的凋亡;对另一部分脊髓组织进行蛋白提取,Western blotting检测Caspase-3和c-fos蛋白的表达。结果与假手术组相比,模型组和神经干细胞移植组BBB评分均显著下降(P<0.05);但神经干细胞移植组神经功能改善情况好于模型组(P<0.05)。模型组和神经干细胞移植组的细胞凋亡率均显著高于假手术组(P<0.05);神经干细胞移植组细胞凋亡率明显低于模型组(P<0.05)。Western blotting检测结果显示,模型组和神经干细胞移植组大鼠脊髓组织中Caspase-3和c-fos的表达量显著高于假手术组(P<0.05);神经干细胞移植组大鼠脊髓组织中Caspase-3和c-fos的表达量显著低于模型组(P<0.05)。结论在大鼠脊髓损伤后,神经干细胞移植能够加快大鼠损伤后的恢复并降低细胞凋亡率,使Caspase-3和c-fos的表达量减少,对大鼠脊髓损伤具有治疗作用。     

基因修饰神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤后神经营养素养-3表达及神经细胞凋亡的影响

目的：探讨基因修饰神经干细胞（NSCs）移植大鼠损伤脊髓后对神经营养素‐3（NT‐3）表达及神经细胞凋亡的影响。方法 SD大鼠80只随机分为假手术组（Normal组）、单纯损伤组（SCI组）、NSCs移植组（NSC组）、NT‐3基因修饰NSCs移植组（NT‐NSC组）。采用电控脊髓损伤打击装置致大鼠SCI模型,25g／cm （10g ×2.5cm）力致伤T13脊髓。5‐溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）法标记处于对数生长期的NSCs ,SCI后即刻进行NSCs及基因修饰NSCs移植,分1、3、7、14、28d 5个时间点运用免疫组织化学的方法检测NT‐3、BrdU的表达,采用原位末端脱氧核苷转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸生物素缺口末端标记技术（TUNEL法）标记凋亡细胞,改良Rivlin法（斜板试验）观察大鼠后肢运动功能的恢复情况。结果 N T‐NSC组与NSC组在脊髓损伤区域内均可检测到Brdu阳性细胞,移植后7、14、28d BrdU阳性NSCs数与NSC组相比明显增多,差异有统计学意义（t＝9.439、8.918、4.185,P均＜0.05）。NT‐NSC组NT‐3表达高峰延迟,在14d达到最高值,其平均OD值与其他实验组各时间点相比均增高,差异有统计学意义（ P＜0.05）;移植后7、14、28d凋亡细胞数比 NSC组明显减少（ P＜0.05）,斜板试验评分比NSC组明显提高（P＜0.05）。结论 NT‐3基因修饰NSCs移植较单纯NSCs移植更容易在脊髓损伤区域存活,并能通过增强NT‐3的表达来抑制神经细胞的凋亡,从而促进大鼠损伤脊髓的功能恢复。     

大鼠脊髓压迫性损伤后神经细胞的死亡方式

目的：观察实验性脊髓损伤后神经细胞死亡方式。方法：应用凋亡细胞原位末端标记法，ＨＥ染色，对脊髓组织进行定量形态学分析，结果；在脊髓损伤区及相邻区域中发现少量神经元以大量胶质细胞凋亡，结论：脊髓损伤后的神经细胞的凋亡是继发损伤期的重要病理变化。     

17β-雌二醇对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响

目的研究17β-雌二醇（E2）对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响。方法SD大鼠随机分为假手术组（A组）、磷酸盐缓冲液对照组（B组）及E2治疗组（C组）。应用重物打击法建立大鼠急性脊髓损伤模型（A组仅行椎板切除术），分别于伤后7、14、21及28d，按照改良Tarlov评分法和Rivlin斜板试验观察脊髓功能恢复情况。伤后6、24h和3、7、14、28d分别处死动物取材，HE染色观察病理变化，TUNEL法和流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果TUNEL法和流式细胞术检测结果均表明大鼠脊髓损伤后存在细胞凋亡。TUNEL法显示细胞凋亡在伤后3d达高峰，C组伤后24h、3d及7d凋亡细胞比率均显著低于B组（P〈0．01或P〈0．05）；流式细胞术显示细胞凋亡率在伤后7d达高峰，C组细胞凋亡率在24h以后各观察时间点均显著低于B组（P〈0．01或P〈0．05）。14d以后，C组脊髓神经功能恢复显著好于B组（P〈0．01或P〈0．05）。结论E2能减少继发性脊髓损伤后细胞凋亡，促进脊髓功能的恢复。     

慢性压迫性脊髓损伤神经细胞的变化

①目的观察在慢性压迫性脊髓损伤时，脊髓的一般组织病理变化及脊髓内神经元和神经胶质细胞的凋亡情况。②方法健康家免16只，随机分为3组：A组为正常对照组；B组为手术对照组；C组为慢性压迫组。采用慢性泛影葡胺胶囊逐级压迫建立慢性脊髓压迫动物模型，造成家兔第2腰髓节段的慢性压迫。用Nissl染色法观察脊髓的一般组织病理学变化，用原位末端标记法(TUNEL)观察细胞凋亡情况。③结果C组在Nissl染色下白质中神经胶质细胞增生，以后索最明显；灰质中神经元尼氏体淡染或消失，神经元萎缩、脱失，以Ⅸ板层最明显。TUNEL标记的阳性细胞为神经胶质细胞，白质中各索均有，以后索和外侧索明显。灰质中标记细胞主要存在于Ⅰ，Ⅱ板层，压迫区明显，其相邻的首尾端次之。A，B两组的表现正常。④结论慢性压迫性脊髓损伤是导致脊髓一般组织发生病理变化及神经细胞凋亡的重要原因。     

大鼠脊髓损伤后神经细胞损伤与Caspase-3关系的研究

目的探讨大鼠脊髓损伤与凋亡促进因子Caspase-3之间的关系。方法SD大鼠24只,脊髓损伤后取损伤脊髓标本,应用HE染色、免疫组织化学和Caspase-3mRNA原位杂交,TUNEL染色,观察脊髓损伤区神经元损伤变化与Caspase-3表达之间的关系。结果脊髓损伤后5h可监测到Caspase-3免疫组化阳性细胞(10.2个/高倍视野),22～48h时达高峰(21.5～24.2个/高倍视野)。Caspase-3mRNA原位杂交阳性表达始于5h(6.66个/高倍视野),24h达高峰(14.55～18.22个/高倍视野),二者均在72h后呈明显下降趋势。损伤后24h,可监测到TUNEL阳性细胞,持续至72h。Caspase-3mRNA与Caspase-3呈正相关,相关系数为0.716(P<0.05).4～16h受损神经原形态基本正常,24￣48h细胞凋亡特征明显,72h后,几乎所有神经元形态呈现严重变化。结论大鼠脊髓损伤后神经元发生一系列形态变化,其演变规律与凋亡促进因子Caspase-3有密切相关性。     

急性脊髓损伤后神经细胞凋亡及其意义

目的：研究急性脊髓损伤后神经细胞凋亡的分布特点及其意义。方法：Wistar雌性大白鼠54只，使用改良Allen法制作急性脊髓损伤模型，分别于术后1、4、8、24、72h及7、14、21天处死取材。应用苏木精-伊红染色及凋亡细胞原位末端标记(TUNEL)法对脊髓组织进行标记。结果：损伤后4h，在损伤段及邻近段可见末端标记的阳性神经细胞，损伤段灰质中阳性细胞数24h达高峰，白质中阳性胶质细胞数量72h达高峰。相邻节段阳性细胞数量在72h达高峰。灰质中神经元及胶质细胞均有阳性表达，但以胶质细胞为主。结论：脊髓损伤后神经细胞凋亡是继发损伤期的重要病理变化，并有其时相和空间分布特点。     

慢性压迫性脊髓损伤神经细胞的变化

目的：观察在慢性压迫性脊髓损伤时，脊髓的一般组织病理变化及脊髓内神经元和神经胶质细胞的凋亡情况。方法：健康家兔16只，随机分为3组：A组为正常对照组；B组为手术对照组；C组为慢性压迫组。采用慢性泛影葡胺胶囊逐级压迫建立慢性脊髓压迫动物模型，造成家兔第2腰髓节段的慢性压迫。用Nissl染色法观察脊髓的一般组织病理学变化，用原位末端标记法(TUNEL)观察细胞凋亡情况。结果：C组在Nissl染色下白质中神经胶质细胞增生，以后索最明显；灰质中神经元尼氏体淡染或消失，神经元萎缩。灰质中标记细胞主要存在于Ⅰ，Ⅱ板层，压迫区明显，其相邻的首尾端次之。A,B两组的表现正常。结论：慢性压迫性脊髓损伤是导致脊髓一般组织发生病理变化及神经细胞凋亡的重要原因。     

骨髓基质细胞移植对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响

目的 研究骨髓基质细胞(BMSCs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后神经细胞凋亡的影响,探讨骨髓基质细胞移植治疗脊髓损伤的机制.方法 取大鼠股骨和胫骨骨髓培养BMSCs并传代.参照Taoka's方法制作大鼠脊髓压迫损伤模型.脊髓损伤后30 min,进行BMSCs或DMEM培养液损伤周围局部四点注射.在术后3、7和14 d,应用TUNEL方法检测脊髓损伤周围神经细胞凋亡情况.结果 脊髓损伤后,损伤区周围组织内TUNEL阳性细胞数量明显增加,阳性细胞分布于脊髓灰质和白质内,但以白质内神经细胞为主.与DMEM组大鼠相比,移植术后3、7和14 d,BMSCs移植显著减少脊髓损伤周围区凋亡的神经细胞数目(P＜0.05).结论 脊髓损伤后,BMSCs移植能够抑制神经细胞凋亡.     

白细胞介素-6对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响

目的探讨白细胞介素-6(IL-6)对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响。方法SD大鼠随机分为3组,IL-6治疗组(A组),单纯脊髓损伤(SCI)(B组),假损伤组(C组)。每组20只动物,应用改良Allen打击法制作急性SCL模型,A组SCL后30min,腹腔内注射10μgIL-6,B组单纯脊髓损伤,无治疗,C组,暴露硬脊膜,无SCL,术后分别12h和12周,每组10只动物,取脊髓伤段标本测小离子含量和Bcl-2、Fas蛋白表达的测定(免疫组化法)。结果(1)SCL后组织水肿,Na 、Ca2 离子浓度升高,K ,Mg2 离子浓度降低。IL-6治疗后显著改善这些变化。(2)A、B、C中,均发现Bcl-2和Fas蛋白阳性表达,表达顺序分别为A>B>C和B>C>A。结论SCI后早期应用IL-6可抑制大鼠脊髓细胞凋亡,减少神经细胞离子失衡,改善细胞内环境,从而对脊髓损伤起到保护作用。     

新生大鼠脊髓神经干细胞的分离培养及鉴定

目的　从新生大鼠的脊髓中分离培养神经干细胞并观察其增殖和分化能力。方法　采用细胞培养技术结合间接免疫荧光细胞化学法。结果　分离的细胞生长旺盛 ,单克隆化生成的细胞团 ,BrdU掺入呈强阳性。分离培养获得的细胞团呈Nestin强阳性 ,至今已在体外连续传代 8个月。培养的细胞团经 1%小牛血清诱导可分化为神经元和星形胶质细胞。结论　成功分离培养了新生大鼠脊髓神经干细胞     

神经干细胞移植对损伤脊髓细胞的保护作用

目的 观察神经干细胞移植对损伤脊髓细胞的保护作用。方法 将脊髓半横断伤SD大鼠模型，随机分为神经干细胞移植组(A组)、损伤对照组(B组)和正常组(C组)，24小时每组12只动物取伤段标本测水离子含量。其余动物第6周、第12周每组8只动物爬坡试验，评价下肢运动功能及运动诱发电位(MEP)检测。结果 脊髓损伤(SCI)后组织水肿，Na^ 、Ca^ 离子浓度升高，K^ 、Mg^2 离子浓度降低。神经干细胞脊髓内移植后显著改善这些变化，使损伤神经功能有显著恢复。结论 神经干细胞脊髓内移植对SCI有保护作用。其机制可能与减少神经细胞离子失衡、改善细胞内环境有关。     

神经干细胞与嗅鞘细胞移植对脊髓全横断大鼠后肢运动功能的影响

目的探讨神经干细胞（NSCs）与嗅鞘细胞（OECs）移植对脊髓全横断大鼠后肢运动功能的影响．方法SD大鼠行T11脊髓全横断术后，随机分为NSCs移植组、OECs移植组、联合移植组和对照组．术后将取自绿色荧光蛋白（GFP）转基因胚胎小鼠海马和新生小鼠嗅球的、经培养鉴定后的NSCs和OECs，以明胶海绵做载体分别或联合移植到各移植组动物脊髓损伤处，对照组不移植细胞，用BBB评分法评价1～8周大鼠后肢运动功能恢复的程度．8周后移植各组动物行左心室主动脉内4％多聚甲醛灌注，取横断处上下各约1mL脊髓，连续冰冻切片（片厚20tam），置于荧光显微镜下观察切片中有无绿色荧光细胞，确定NSCs及OECs的存活情况．结果NSCs及OECs细胞在移植脊髓损伤后能存活，并向周围迁移；术后3和4周末，NSCs组、OECs组和联合移植组大鼠运动功能均较对照组有明显改善（P〈0．05）；且3周时，联合移植组和OECs组比NSCs组后肢运动功能变化显著（P〈0．05）；而联合移植组和OECs组比较后肢运动功能未见显著差别（P〉0．05）．绪论NSCs、OECs和联合移植在早期均可促进脊髓全横断大鼠运动功能恢复；OECs组、联合移植组效果均优于NSCs组；联合移植对大鼠运动功能恢复在早期没有显现最佳作用．     

神经干细胞与促红细胞生成素在脊髓损伤中的应用与进展

脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）是由多种损伤因素引起的感觉和运动障碍,这些损伤因素包括：创伤、缺血、医源性损伤等,尽管各国研究者在其治疗方面做了很多努力,但脊髓损伤的治疗仍然是世界性的难题,目前还没有一种安全、有效的治疗方法。本文就神经干细胞和促红细胞生成素在脊髓损伤中的应用和研究进展做一综述,以便为临床治疗脊髓损伤提供新的思路和方法。     

胚胎大鼠脊髓源性神经干细胞的分离培养及分化观察

目的：研究脊髓源性神经干细胞的分离、培养、增殖和分化特点。方法：利用无血清培养和细胞克隆培养技术及免疫细胞化学方法,观察脊髓源性神经干细胞的体外扩增和贴壁分化情况。结果：脊髓源性神经干细胞具有增殖能力,并可传代培养,经含血清培养基培养,贴壁可分化为MAP2、GFAP和GC阳性细胞。结论：分离培养的脊髓源性神经干细胞具有增殖能力,并具有多向分化潜能。     

Induction of functional recovery by co-transplantation of neural stem cells and Schwann cells in a rat spinal cord contusion injury model

Objective To study the transplantation efficacy of neural stem cells （NSCs） and Schwann cells （SC） in a rat model of spinal cord contusion injury. Methods Multipotent neural stem cells （NSCs） and Schwann cells were harvested from the spinal cords of embryonic rats at 16 days post coitus and sciatic nerves of newborn rats, respectively. The differential characteristics of NSCs in vitro induced by either serum-based culture or co-culture with SC were analyzed by immunofluorescence. NSCs and SCs were co-transplanted into adult rats having undergone spinal cord contusion at T9 level. The animals were weekly monitored using the Basso-Beattie-Bresnahan locomotor rating system to evaluate functional recovery from contusion-induced spinal cord injury. Migration and differentiation of transplanted NSCs were studied in tissue sections using immunohistochemical staining. Results Embryonic spinal cord-derived NSCs differentiated into a large number of oligodendrocytes in serum-based culture upon the withdrawal of mitogens. In cocultures with SCs, NSCs differentiated into neuron more readily. Rats with spinal cord contusion injury which had undergone transplantation of NSCs and SCs into the intraspinal cavity demonstrated a moderate improvement in motor functions. Conclusions SC may contribute to neuronal differentiation of NSCs in vitro and in vivo. Transplantation of NSCs and SCs into the affected area may be a feasible approach to promoting motor recovery in patients after spinal cord injury.     

人胚神经干细胞的长期体外培养

目的：建立人胚神经千细胞（human Neural Stem Cells、hNSC）的体外培养体系。方法：选取3个月～4个月大的引产胎儿，分离原代人胚神经千细胞、添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、N2促进hNSC的增殖，使用免疫细胞化学方法与诱导分化实验鉴定其神经千细胞的特性。结果：成功培养出人胚神经干细胞、原代培养的hNSC悬浮生长，似桑椹状，表达巢蛋白（Nestin）抗原，诱导分化后可表达神经元与神经胶质细胞特异抗原βⅢ与神经胶质细胞特异抗原GFAP，并能自我增殖：目前已成功传代10余次（5月余）。结论：使用本方法可以获得大量纯化hNSC？为临床实验提供适合的移植材料。     

BDNF联合chABC鞘内注射对大鼠脊髓损伤修复的影响

目的 探究脑源性神经营养因子（BDNF）联合软骨素酶（chABC）鞘内注射对大鼠脊髓损伤后运动感觉功能的影响以及脊髓组织中神经干细胞、神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的影响。方法 将SD大鼠分为假手术对照组（A组）,损伤对照组（B组）,chABC治疗组（C组）,BDNF治疗组（D组）,联合治疗组（E组）,采用后肢运动功能评分法（CBS）对大鼠术后1周、2周、4周和2个月后肢运动功能进行评定,苏木精-伊红（HE）染色法观察不同时间点大鼠脊髓组织变化,免疫组化法观察各组大鼠脊髓组织神经干细胞的影响,荧光免疫组化法观察各组大鼠神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的变化。结果 术前各组大鼠神经功能均正常,术后1~2周,B、C、D、E各组CBS评分降低,但各组间对比差异无统计学意义（P>0.05）;术后4周~2个月,C、D、E组CBS评分逐渐降低,低于B组,差异有统计学意义（P<0.05）。与A组相比,B组不同时间点BrdU阳性细胞数目降低,差异有统计学意义（P<0.05）。脊髓损伤后1周,C、D、E组大鼠脊髓组织BrdU阳性细胞数目与B组比较,差异无统计学意义（P>0.05）;脊髓损伤后第2~4周,C、D、E组BrdU阳性细胞数高于B组,差异有统计学意义（P<0.05）。与空白对照A组比较,B组脊髓损伤后不同时间点Nestin阳性细胞数目均减少,差异有统计学意义（P<0.05）。脊髓损伤后2周、4周、2个月,C、D、E组脊髓组织Nestin阳性细胞数高于B组,差异有统计学意义（P<0.05）。脊髓损伤后1周,A组星形胶质细胞比例逐渐降低,神经元细胞比例逐渐升高。B组细胞3种细胞比例均较低,随着时间延长,神经元细胞比例缓慢升高,星形胶质细胞比例缓慢下降。C、D、E组脊髓受损后脊髓受损后4周~2个月,C、D、E组神经元比例逐渐升高,星形胶质细胞逐渐下降,与B组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 BDNF、chABC鞘内注射后对大鼠脊髓损伤后运动、感觉功能恢复具有一定的促进作用,可能与促进神经干细胞增殖以及神经元细胞的分化有关,但两者联合后效果并不显著。     

人胚神经干细胞的长期体外培养

目的:建立人胚神经干细胞(humanNeuralStemCells,hNSC)的体外培养体系。方法:选取3个月～4个月大的引产胎儿,分离原代人胚神经干细胞,添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、N2促进hNSC的增殖,使用免疫细胞化学方法与诱导分化实验鉴定其神经干细胞的特性。结果:成功培养出人胚神经干细胞,原代培养的hNSC悬浮生长,似桑椹状,表达巢蛋白(Nestin)抗原,诱导分化后可表达神经元与神经胶质细胞特异抗原βⅢ与神经胶质细胞特异抗原GFAP,并能自我增殖,目前已成功传代10余次(5月余)。结论:使用本方法可以获得大量纯化hNSC,为临床实验提供适合的移植材料。     

人胚胎脊髓神经干细胞生长及分化过程中BDNF的作用研究

目的研究脑源性神经营养因子对人胚胎脊髓神经干细胞生长和分化的影响。方法孕20周水囊引产胎儿标本经家属同意捐赠,分离培养脊髓神经干细胞,分为正常对照组、BDNF蛋白组、BDNF抗体封闭组,计数神经球数目并以MTT法检测细胞活力,免疫组织化学检测NeuN和GFAP的表达情况并进行计数。结果与对照组相比,BDNF蛋白组神经球数目或MTT值均无明显变化,BDNF抗体封闭组的神经球数目和MTT值有明显减少(P<0.05);BDNF蛋白组NeuN阳性细胞数明显多于对照组(P<0.05),GFAP阳性细胞数与对照组相比有明显减少(P<0.05),BDNF抗体封闭组NeuN或GFAP阳性细胞数均少于对照组(P<0.05)。结论外源性BDNF可促进人胚胎脊髓神经干细胞向神经元样细胞分化;内源性BDNF在人胚胎脊髓神经干细胞的增殖分化过程中发挥重要作用。