鼠成骨细胞诱导兔BMSCs成骨的实验观察

目的观察乳鼠成骨细胞诱导乳兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨情况。方法取SD大鼠乳鼠颅盖骨,采用组织块培养法培养成骨细胞;取乳兔长骨,采用全骨髓培养法培养BMSCs;用Transwell双层细胞培养板共育,实验组于培养上室接种成骨细胞,对照组培养上室不接种细胞,两组培养下室均接种BMSCs。观察BMSCs形态变化,用酶标仪检测诱导分化后BMSCs的ALP活性,RT—PCR检测BMSCs中的骨钙素、骨形态发生蛋白-2（BMP-2）、Ⅰ型胶原基因。结果共培养后实验组BMSCs形态逐渐向成骨样细胞转化,对照组无明显变化;实验组BMSCs中ALP活性高于对照组,实验组的BMSCs的骨钙素、BMP-2、Ⅰ型胶原基因有所表达,对照组无表达。结论乳鼠成骨能够诱导乳兔BMSCs向成骨细胞分化。     

共培养大鼠内皮祖细胞对自体骨髓基质干细胞成骨作用的影响

目的探讨体外培养大鼠外周血内皮前体细胞(EPCs)与自体骨髓基质细胞(BMSCs)共培养时对BMSCs成骨作用的影响。方法采用密度梯度离心法分离、培养大鼠BMSCs和EPCs,培养细胞分为四组:A组(BMSCs组)、B组(EPCs组)、C组(BMSCs成骨诱导组)及D组(BMSCs和EPCs联合培养组)。通过观察细胞克隆形态、免疫细胞化学、细胞增殖、碱性磷酸酶活性,从酶学、组织学及生化等不同方面观察:EPCs对BMSCs成骨活性及生长情况的影响。结果免疫细胞化学染色证实C组培养的细胞具有晚期EPCs的特性。倒置相差显微镜、HE染色均证实共培养的BMSCs和EPCs生长良好,并能够形成与单纯成骨诱导培养的BMSCs相似的钙结节。MTT检测结果:各组细胞增殖差异无统计学意义(P>0.05)。碱性磷酸酶活性检测结果:C、D组显著高于A、B组(P<0.05)。结论 EPCs和BMSCs联合培养具有良好的细胞相容性,EPCs能够增强成骨细胞的ALP活性,提高成骨细胞的增殖能力。     

茶黄素对人骨髓基质干细胞的成骨诱导作用

目的探讨茶黄素对体外培养人骨髓基质干细胞（BMSCs）的成骨诱导作用及其能力。方法将第二代人BMSCs分为茶黄素组、对照组,茶黄素组加入浓度为10 mmol/L茶黄素,对照组不干预。对比观察两组干预后细胞形态,钙结节、碱性磷酸酶（ALP）、Ⅰ型胶原及骨钙素（OCN）免疫组化染色结果,并检测各组4、8、12、16 d各时点ALP、OCN活性。结果茶黄素组钙结节、ALP、Ⅰ型胶原及OCN免疫组化染色均呈阳性,对照组均为阴性;茶黄素组各时点ALP、OCN活性均高于对照组（P均〈0.05）。结论茶黄素可促进人BMSCs向成骨细胞分化。     

NO供体亚硝基化合物-18对大鼠成骨细胞的影响

目的 探讨NO供体亚硝基化合物-18(NOC-18)对大鼠成骨细胞增殖和分化、碱性磷酸酶(ALP)活性和Ⅰ型胶原蛋白表达的影响。方法 采用酶消化法和骨组织块法联合分离培养新生SD大鼠颅骨成骨细胞，然后将不同浓度的NOC-18作用于大鼠成骨细胞，采用噻唑蓝(MTY)比色法检测细胞增殖能力，测定细胞ALP活性。免疫细胞化学染色检测Ⅰ型胶原蛋白的表达，观察NOC-18对大鼠成骨细胞增殖和分化能力的影响。结果 NOC-18可显著促进大鼠成骨细胞增殖，提高成骨细胞ALP活性和Ⅰ型胶原蛋白的表达。结论 适量浓度的NOC-18可通过刺激成骨细胞的增殖和分化，促进骨形成，为预防和治疗骨质疏松提供了理论和实验依据。     

淫羊藿总黄酮对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化中DKK1蛋白动态表达的影响

目的观察DKK1在淫羊藿总黄酮调控去势雌性大鼠骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化平衡过程中的动态表达,为进一步阐明淫羊藿总黄酮治疗绝经后骨质疏松症的作用机制提供实验依据。方法体外分离培养去势雌性大鼠来源骨髓间充质干细胞,分别在成骨诱导液和脂肪诱导液条件下连续培养15 d,并在此基础上添加剂量为10μg/mL的淫羊藿总黄酮。采用ALP染色、ALP活性测定、油红O染色以及荧光定量PCR技术,观察淫羊藿总黄酮对骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化的影响。用酶联免疫法(ELISA)检测淫羊藿总黄酮处理过程中DKK1蛋白的动态表达,观察DKK1蛋白在淫羊藿总黄酮调控去势雌性大鼠骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化平衡过程中的作用。结果淫羊藿总黄酮能显著增加骨髓间充质干细胞ALP的表达以及成骨早期分化因子Runx2 mRNA的表达,显著下调骨髓间充质干细胞中脂肪形成关键基因PPARγ-2mRNA的表达,从而抑制脂滴的形成。在成骨诱导条件下,EFs呈时间依赖性下调DKK1的表达;在脂肪诱导条件下,EFs呈时间依赖性抑制DKK1蛋白的上调。结论通过抑制DKK1蛋白的表达调控去势雌性大鼠BMSCs成骨和成脂分化平衡,可能是淫羊藿总黄酮治疗绝经后骨质疏松症的分子机制之一。     

17β-雌二醇在大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞转换中的作用

目的探讨17β-雌二醇对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的作用。方法体外分离培养SD大鼠MSCs,诱导大鼠MSCs向成骨细胞定向分化,应用放免法、酶联免疫吸附法观察应用17β-E2对成年大鼠来源的MSCs成骨分化的影响。结果分离得出BMSCs细胞为长梭形或纺锤形,诱导7 d时,大部分细胞逐渐变为多边形,可见碱性磷酸酶(ALP)染色呈阳性;诱导约14 d,细胞互相聚集周围有钙盐晶体形成;诱导培养21 d,细胞聚集形成典型的骨小结,茜素红染色将骨结节中沉积的钙盐染成红色。结论密度梯度离心与贴壁筛选法相结合,是体外分离、纯化MSCs的理想方法;雌激素能通过增强MSCs的成骨分化能力来发挥促骨形成作用。     

冬凌甲草素在体外促进成骨分化和抑制破骨形成及其机制研究

目的研究冬凌甲草素对成骨细胞分化和破骨细胞形成的作用及分子机制。 方法从SD大鼠股骨和胫骨中分离出骨髓间充质干细胞和骨髓单核细胞,培养于含10%胎牛血清的α-MEM培养基,细胞80%~90%汇合后采用不同浓度的冬凌甲草素（0、1、2、3、4 μM）进行分组干预,CCK-8法及活死染色检测不同浓度的冬凌甲草素对间充质干细胞及骨髓单核细胞活力的影响;通过碱性磷酸酶（ALP）染色、茜素红染色、ALP活性的测定以及TRAP染色检测冬凌甲草素对成骨和破骨分化的影响;qRT-PCR检测wnt1、β-catenin、Runx2、ALP、collage-1(col-1)、骨钙蛋白(OCN)、TRAP、c-Fos、NFATc1和CTSK的表达;Western-blot及免疫荧光检测wnt1、β-catenin、ALP、col-1、OCN、Runx2、核因子κB受体活化因子配体（RANKL）、骨保护素（OPG）、GSK-3β、p-GSK-3β的表达。 结果（1）与对照组比较,冬凌甲草素（2 μM）具有促进间充质干细胞向成骨细胞分化和提高ALP活性的作用;（2）冬凌甲草素可以促进wnt1、β-catenin、Runx2的表达,在加入Wnt/β-catenin/TCF通路选择性拮抗剂ICG-001后,成骨相关标志物表达下降。（3）冬凌甲草素可以促进OPG而抑制RANKL的表达。（4）冬凌甲草素可以直接或间接抑制破骨相关基因TRAP,NFATc1和c-Fos的表达。 结论冬凌甲草素可能通过Wnt/β-catenin信号通路促进骨髓间充质干向成骨细胞分化,同时,它还可能抑制RANKL介导的破骨细胞的形成。     

Wnt/β-catenin基因对骨髓瘤患者间充质干细胞成骨潜能的影响

目的:探讨Wnt/β-catenin基因和多发性骨髓瘤骨病的关系。方法:分离培养多发性骨髓瘤患者和正常人的骨髓间充质干细胞(MSCs),体外诱导分化成骨细胞,茜素红实验检测矿化物沉积、荧光定量RT-PCR方法检成骨指标(OPN、OC、ALP、Cbfal)和Wnt/β-catenin mRNA表达,分析MSCs细胞成骨能力变化及两组间Wnt/β-catenin mRNA表达差异。结果:骨髓MSCs体外成骨诱导后,茜素红染色阳性,呈现明显红色钙化结节;MSCs体外诱导成骨细胞,试验组与对照组比较,成骨指标OPN、OC、ALP、Cbfαl mRNA表达降低(P<0.05);骨髓MSCs体外成骨诱导后β-catenin mRNA表达降低(P<0.05)。结论:骨髓MSCs体外可成功诱导分化为成骨细胞;多发性骨髓瘤患者MSCs向成骨细胞分化潜能比正常人降低,Wnt/β-catenin可作为多发性骨髓瘤骨病潜在治疗靶点。     

橘红素对大鼠成骨细胞增殖、分化和成骨功能的影响

目的 研究橘红素(TG)对体外培养大鼠成骨细胞增殖、分化、矿化和成骨功能指标基因蛋白表达的影响。方法 选取出生24 h内的SD大鼠乳鼠颅骨，通过酶消化法培养原代成骨细胞，倒置显微镜下观察细胞形态和状态，并以碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红(ARS)染色法进行细胞鉴定；分别采用噻唑蓝(MTT)法、ALP染色法、ARS染色法检测TG对原代成骨细胞的存活率、评价成骨细胞分化能力和矿化能力的影响；采用Western印迹检测TG对原代成骨细胞成骨相关转录因子(OSX)、ALP、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)和骨桥蛋白(OPN)等成骨功能指标基因的蛋白表达。结果 与Control组相比，TG作用浓度为5、10、15、20μmol/L时可明显促进成骨细胞的增殖(P<0.01);TG共培养7 d后，与Control组比较，TG作用浓度为5、10、15、20μmol/L时ALP染色明显增加，说明TG能明显促进成骨细胞分化(P<0.05);TG共培养21 d后，与Control组比较，TG浓度为5、10、15、20μmol/L时ARS染色明显增加，说明TG能明显促进成骨细胞的矿化功能(P&...     

AGEs对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中β-catenin、ALP的影响及PTH的干预作用

目的:初步探讨在培养的骨髓间充质干细胞(BMSCs)层面,晚期糖基化终末产物(AGEs)对BMSCs成骨分化中β-catenin、碱性磷酸酶(ALP)的影响,以及甲状旁腺激素(PTH)的干预及其机制。方法:取第三代BMSCs,检测AGEs对其增殖的影响。将BMSCs分为对照组、AGEs组、Wnt3a组、AGEs+Wnt...     

罗格列酮对经诱导的骨髓间充质干细胞ALP、BMP-2及TGF-β1分泌的影响

目的 体外观察罗格列酮对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化的影响,并观察对碱性磷酸酶(ALP)、骨形成蛋白-2(BMP-2)、转化生长因子β1(TGF-β1)分泌的影响,探讨其对骨代谢的作用机制.方法 无菌条件下从大鼠长骨骨髓中分离获取BMSCs,采用全骨髓贴壁培养法对BMSCs进行纯化、传代扩增,随后在1、2、5、10 μmol/L罗格列酮干预下诱导成骨细胞分化培养21 d,进行茜素红染色观察矿化结节,并测定成骨细胞标记物ALP、BMP-2及TGF-β1的分泌.结果 1、2、5、10 μmol/L罗格列酮干预组与成骨经典组对比,成骨细胞的钙结节形成比例显著降低(P＜0.05),ALP、BMP-2、TGF-β1水平呈剂量依赖性地下降(均P＜0.05).结论 罗格列酮可剂量依赖性地抑制BMSCs向成骨细胞分化,这可能是罗格列酮致骨质疏松的重要机制.

Abstract：

Objective To observe the effects of rosiglitazone on differentiation of rat bone-marrow stromal cells (BMSCs) into osteoblasts (OB) and on secretion of alkaline phosphatase (ALP), bone morphogenetic protein2 (BMP-2), and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) in order to investigate its mechanism of the impact on the bone metabolism.Methods BMSCs from long bone were bred by using differential time adherent culture method,and then were interfered with 1,2,5,10 μmol/L rosiglitazone to differentiate into osteoblasts in the presence of an osteogenic medium.The rate of mineralization was examined by staining mineralized nodules with Alizarin red S,and the secretion of ALP, BMP-2, and TGF-β1 was examined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)after 21 d of culture.Results Compared with the classic group, the rate of mineralization was significantly decreased by 1,2,5 and 10 μmoL/L rosiglitazone (P＜0.05), the levels of ALP, BMP-2, and TGF-β1 decreased in a dose-depedent manner (P＜0.05).Conclusion Rosiglitazone dose-dependently inhibits differentiation of BMSCs into osteoblasts, which may be an important mechanism in causing osteoporosis.     

丹参酮ⅡA对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的研究丹参酮ⅡA（TanⅡA）对体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化能力的影响。方法扩增传代至第3代的SD大鼠BMSCs向成骨诱导分化培养,分为实验组和对照组,采用MTT比色法检测细胞的增殖能力;采用RT—PCR方法检测成骨相关细胞因子mRNA的表达;通过钙结节染色对比观察细胞形态情况。结果实验组各浓度TanⅡA较对照组BMSCs增殖速度提高（P〈0．05）,细胞增殖速率随TanⅡA浓度的增高而加快（P〈0．05）;实验组各浓度TanⅡA成骨相关细胞因子mRNA的表达较对照组提高（P〈0．05）;钙结节染色观察TanⅡA各浓度组均阳性显色,对照组显色不明显。结论TanⅡA能够提高体外培养的BMSCs增殖速率,对BMSCs向成骨细胞分化有明确的诱导作用,缩短骨细胞的成熟时间。     

尼古丁对兔骨髓源成骨细胞生物学特性的影响

体外成骨诱导兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),使之分化为骨髓源成骨细胞(MOOBs),用含不同浓度尼古丁的成骨条件培养液培养MOOBs,于第1、3、5、7天采用MTT比色法检测MOOBs的增殖力,用磷酸苯二钠比色法测定MOOBs的碱性磷酸酶(ALP)活性.与对照组相比,10、100 μg/ml尼古丁对MOOBs的增殖有抑制作用(P<0.05),降低其ALP活性(P<0.05),并呈时间依赖性.提示尼古丁对兔MOOBs的增殖及ALP活性有抑制作用,这对种植体骨整合可能有影响.     

亚麻木酚素促进绝经期妇女种植体骨结合机制

目的观察亚麻木酚素(SDG)对成骨细胞的增殖分化及护骨素(OPG) mRNA表达的影响。方法将成骨细胞在不同浓度的SDG环境下进行培养,采用噻唑蓝(MTT)法和碱性磷酸酶(ALP)活性检测法检测细胞增殖情况及ALP活性;利用SDG培养成骨细胞24 h后,Phalloielin染色观察细胞骨架的形态变化;利用实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测OPG mRNA的表达水平。结果高浓度SDG抑制成骨细胞增殖(P0.05),低浓度SDG促进成骨细胞增殖(P0.05)。与空白组相比,低浓度SDG组ALP活性高(P0.05),高浓度SDG浓度组ALP活性明显下降(P0.05)。在SDG浓度10~(-9)～10~(-7) mol/L范围内,随浓度的增高细胞铺展面积增大且内部框架结构更加清晰,而10~(-5) mol/L组细胞内部结构不清晰。SDG浓度为10~(-6)、10~(-7) mol/L时,OPG mRNA的表达明显增加(P0.05)。结论 SDG在成骨细胞增殖、分化的促进上具有一定效果。     

Wnt/β-catenin信号通路介导糖基化终未产物对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的探讨糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)对体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增生及成骨分化的影响及可能机制.方法采用全骨髓法分离培养4周龄SD大鼠的BMSCs.将BMSCs随机分为成骨诱导液、BSA组、AGEs3组,Western blot法检测AGEs对BMSCs成骨分化过程中β-catenin、OSX、RUNX2、RAGE(AGE受体)蛋白表达量的影响,茜素红染色观察AGEs对BMSCs成骨分化过程中矿化的影响.抑制RAGE后实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluo-rescence quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)及Western blot法再次测定上述指标水平.结果0.2 g/L AGEs作用于体外培养SD大鼠BMSCs,上调RAGE蛋白表达(0.88±0.04),β-catenin、OSX、RUNX2蛋白表达降低(分别为0.21±0.02,0.25±0.03和0.21±0.01,P<0.05).RAGE中和抗体阻断RAGE作用后,AGE+RAGE中和抗体组RAGE蛋白表达下调(0.30±0.03),β-catenin、OSX、RUNX2蛋白表达增高(0.90±0.02,0.84±0.03和0.88±0.02,P<0.05).结论AGEs通过Wnt/β-catenin信号通路抑制BMSCs成骨分化.     

腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-7基因转染大鼠骨髓基质干细胞及其表达

目的 利用人骨形态发生蛋白-7(hBMP-7)腺病毒表达载体(Ad-hBMP-7)转染大鼠骨髓基质干细胞(BMSC)的方法,观察Ad-hBMP-7转染后对BMSC分化的影响,探讨基冈治疗的可能性.方法 获取Wistar大鼠BMSC,并分为3组:Ad-hBMP-7转染组、Ad-绿色荧光蛋白(Ad-GFP)转染组、未转染组.将Ad-hBMP-7和Ad-GFP的病毒液分别转染体外培养的大鼠BMSC,用RT-PCR法检测hBMP-7 mRNA的表达,7 d后用Western blot法检测hBMP-7的蛋白表达,同时进行碱性磷酸酶(ALP)染色.结果 在Ad-hBMP-7转染组,RT--PCR可检测到hBMP-7 mRNA的表达(470 bp),Western blot可检测到hBMP-7蛋白分泌(相对分子质量为15×103),转染后第10天ALP染色多数细胞-胞浆呈棕黑色阳性着色;而Ad-GFP转染组和未转染组ALP染色阳性细胞少见并且未检测到hBMP-7蛋白分泌.结论 Ad-hBMP-7基因可高效转染BMSC,促进BMSC向成骨细胞转化,为利用hBMP-7开展局部基因治疗的研究奠定了基础.     

中药及其活性成分影响骨髓间充质干细胞成骨成脂分化的研究进展

<正>成骨细胞和脂肪细胞共同来源于骨髓间充质干细胞(BMSCs),BMSCs的成骨与成脂分化存在相互制约的平衡关系,一旦该平衡被打破,便会引起代谢相关疾病或发育异常。近年来研究发现,中药在调控BMSCs成骨、成脂分化平衡方面具有一定的积极作用。本文将围绕中药影响BMSCs成骨、成脂分化及其机制进行简要综述。1概述在不同诱导条件下能够向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、肌肉细胞、心肌细胞、血管内皮细胞等多种组织细胞     

BMSCs的分离培养、纯化与鉴定

目的 建立一种持续、稳定的可多向分化的骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外分离培养体系.方法 运用密度梯度离心法从1月龄新西兰兔骨髓中分离培养BMSCs,利用相差显微镜观察其形态及生长情况,扫描电镜观察其细胞结构,运用流式细胞术分析分离细胞群所处细胞周期和细胞活力,用MTT比色法绘制细胞生长曲线,并用特定诱导液将分离的BMSCs向成骨细胞和成脂肪细胞定向诱导分化,利用ALP和油红O进行染色鉴定.结果 所分离的BMSCs细胞在形态学观察与生长动力学上均符合BMSCs特征,分离培养的BMSCs细胞在第3天进入对数生长期,第10天进入平台期;在成骨、成脂肪的诱导培养条件下,分别出现成骨、成脂肪表型特征,可进一步定向分化,结论所收获的细胞具有BMSCs的特异性.     

低浓度补肾中药血清联合骨形态发生蛋白-2对人脐血间充质干细胞的生物学作用

目的观察低浓度补肾中药血清联合骨形态发生蛋白(BMP)-2对人脐血间充质干细胞(MSCs)体外增殖、成骨分化的生物学作用。方法取正常孕妇脐静脉血培养第3代人脐血MSCs,制备补肾中药大鼠血清,按诱导分化培养基不同,随机分为空白对照组、中药血清组、BMP-2组、中药血清+BMP-2组(联合组)。以MTT比色法检测脐血MSCs增殖活性,观察碱性磷酸酶(ALP)活性、矿化结节及Ⅰ型胶原染色以检测细胞成骨分化能力。结果与空白对照组比较,联合组、BMP-2组在诱导第3、5天细胞增殖活性明显提高,在诱导第3、6、9、12天ALP活性明显提高(P0.05)。与BMP-2组比较,中药血清+BMP-2组在诱导第5天增殖活性明显提高,在诱导第6天ALP活性明显提高(P0.05)。成骨诱导第14天,除空白对照组外各组von Kossa染色均可见细胞间散在黑色颗粒,尤以联合组为明显;而Ⅰ型胶原纤维表达,BMP-2组、联合组与空白对照组相比均明显增强。结论低浓度补肾中药血清联合BMP-2后能诱导人脐血MSCs增殖及定向成骨分化,是复合型诱导因子的一种理想选择。     

骨碎补总黄酮对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中TGF-β1、BMP-2分泌的影响

将大鼠分为空白对照组、经典组和骨碎补组,采用全骨髓贴壁法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),检测BMSCs成骨分化过程碱性磷酸酶活性、矿化结节、转化生长因子-β1(TGF-β1)和骨形态发生蛋白2(BMP-2)的分泌.结果显示,骨碎补总黄酮促进成骨分化同时增加TGF-β1、BMP-2分泌(均P＜0.05).骨碎补总黄酮可能通过上调二者的表达促进成骨,对骨质疏松症可能有积极的治疗意义.