我国主要问号钩端螺旋体血清群lipL21基因序列及其产物免疫反应性分析

目的 分析我国15群15型问号钩端螺旋体（简称钩体）参考标准株外膜脂蛋白lipL21基因序列，构建该基因原核表达系统并鉴定表达产物的免疫原性，了解lipL21基因自然表达状况。方法 高保真PCR扩增上述问号钩体株及双曲钩体Paloc型PalocⅠ株基因组DNA中全长lipL21基因片段，T-A克隆后测序并构建其原核表达系统。分别用钩体TR/PatocⅠ和rLipL21兔抗血清为一抗的Western blot鉴定目的重组蛋白rLipL21的免疫原性，显微镜凝集试验（MAT）检测rLipL21兔抗血清的交叉凝集效价。以盐变-去垢剂处理法提取钩体外膜蛋白，用SDS-PAGE和免疫印迹法检测上述钩体株lipL21基因自然表达情况。结果 上述钩体株均存在序列高度保守的lipL21基因，其核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98．75％～99．82％和99．46％～100％。rLipL21能与TR/PatocⅠ及rLipL21兔抗血清发生结合反应。rLipL21免疫家兔能产生抗体，该抗体对上述15株问号钩体MAT效价为1：16～1：128。问号钩体外膜标本中均可检出LipL21，双曲钩体则否。结论 我国钩体群参考标准株均含有序列保守的lipL21基因并自然表达于外膜，双曲钩体PatocⅠ株虽含有lipL21基因但未表达。rLipL21具有良好的抗原性和免疫反应性，有可能作为新型钩体疫苗或检测试剂盒的候选属特异性表面抗原之一。     

不同毒力的问号钩端螺旋体对Vero及J774A.1细胞的黏附和内化

目的 探讨问号钩端螺旋体对传代细胞黏附和内化的能力及其差异。方法 实验中采用非洲绿猴肾成纤维细胞(Vero)和小鼠单核巨噬样细胞(J774A．1)细胞株。采用透射电镜、扫描电镜和Fontana镀银染色法，观察问号钩端螺旋体强毒株黄疸出血群赖型56601、弱毒株波摩那群波摩那型56608黏附细胞及内化能力及其差异，采用腐生性的双曲钩端螺旋体三宝垄群patoc型Patoc I株作为对照.结果 问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株和波摩那群波摩那型56608株均能以一端或两端黏附于Vero及J774A．1细胞。钩体56601株和56608株对J774A．1的黏附率分别为49％和46．9％，对Vero细胞黏附率分别为24．2％和22．9％。钩体56601株和56608株可侵入上述2株细胞，在胞质内形成典型的吞噬泡。钩体56601株还可侵入宿主细胞核内，56608株则否。双曲钩端螺旋体二宝垄群patoc型Patoc I株不能黏附和侵入细胞。结论 两株受试的不同毒力问号钩体株均能黏附细胞，并以内化方式侵入细胞。细胞株的差异可明显影响钩体黏附和内化能力。问号钩体毒力的强弱可能与黏附能力无关，而与其侵入胞核的能力密切相关。     

问号钩端螺旋体内化过程中细胞内游离Ca2+水平变化及细胞凋亡

目的建立观察问号钩端螺旋体(简称钩体)黏附的双荧光染色法,探讨不同毒力钩体对细胞内游离Ca2+水平及细胞凋亡的影响.方法以问号钩体黄疸出血群赖型56601株和双曲钩体三堡垄群patoc型PatocⅠ株抗血清为一抗、羊抗兔IgG荧光素F(ab)2和罗丹明F(ab)2片段为二抗的双荧光染色法,分别检测56601株和PatocⅠ株钩体对Vero、J774A.1细胞的黏附作用.采用fluo-3/AM胞内Ca2+特异荧光标记激光共聚焦技术,检测问号钩体56601株和波摩那群波摩那型56608株、双曲钩体PatocⅠ株作用的J774A.1细胞胞内游离Ca2+水平的变化.采用FITC-annexinⅤ/PI荧光标记流式细胞术,检测紫外线灭活前后的56601株钩体诱导Vero和J774A.1细胞凋亡的情况.结果所建立的双荧光染色法能清晰地观察到强毒力的56601株钩体对Vero和J774A.1细胞的黏附,无毒力的PatocⅠ株钩体则否.正常J774A.1细胞胞内游离Ca2+基础值为(105.0±7.0)%,PatocⅠ株钩体作用细胞的荧光强度变化百分数一直波动于(102.2±5.2)%.56601株钩体感染J774A.1细胞胞内游离Ca2+浓度迅速增高,呈现为双峰型曲线,其荧光强度变化百分数分别为(747.5±35.7)%和(804.6±40.8)%.56608株钩体感染J774A.1细胞胞内游离Ca2+浓度呈现为缓慢的单一坡型升高,其最大荧光强度变化百分数为(402.4±23.6)%,明显小于56601株钩体,差异有统计学意义(P<0.01).紫外线灭活前后56601株钩体作用Vero细胞的凋亡率分别为84.5%和78.2%,J774A.1细胞凋亡率分别为34.5%和30.9%.结论所建立的双荧光染色法可用于观察钩体的黏附.细胞胞内游离Ca2+水平与所感染的钩体菌株毒力成正相关.有毒力的钩体接触细胞时即可诱导凋亡发生,启动细胞凋亡信号通路的配体分子可能位于钩体表面.     

问号钩端螺旋体ompA基因分析及其重组表达产物的免疫学鉴定

目的 了解我国15群15株问号钩端螺旋体(简称问号钩体)参考标准株携带ompA基因情况,重组表达OmpA(rOmpA)并鉴定rOmpA的免疫原性和免疫保护性.方法 采用酚-氯仿法提取问号钩体基因组DNA,PCR扩增全长ompA基因,T-A克隆后测序.构建问号钩体黄疸出血群赖型56601株ompA基因的原核表达系统,采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶}冬{像分析系统检测rOmpA表达情况及其产鼍.rOmpA免疫家兔以获得抗血清,采用免疫扩散试验检测抗血清效价.采用Western blot检测rOmpA与其抗血清和问号钩体56601株全菌抗血清的免疫反应性,显微镜凝集试验(MAT)检测rOmpA抗血清对15株问号钩体的交叉凝集情况.分别采用问号钩体黏附J774A.1细胞模型和豚鼠感染模型,了解rOmpA兔抗血清黏附阻断及rOmpA免疫保护作用.结果 15株问号钩体均含有序列保守的ompA基因,双曲钩体Patocl株则否.rOmpA表达量约占细菌总蛋白的20%.rOmpA能诱导家兔产生抗体,其抗血清免疫扩散效价为1:4.兔抗血清及问号钩体56601株全菌抗血清均能与rOmpA产生阳性Western blot信号.rOmpA抗血清对15株问号钩体的MAT效价为1:20～1:320.1:10～1:160稀释的rOmpA抗血清均能阻断问号钩体黏附J774A.1细胞,100μg和200μg rOmpA对豚鼠的免疫保护率分别为50.0%和75.0%.结论 ompA基因仅存在于不同血清群致病性问号钩体基因组中.rOmpA具有较好的抗原性,多种免疫学方法 检测显示,有可能作为通用型问号钩体基因上程疫苗的候选抗原.     

问号钩端螺旋体毒力相关蛋白InvA转录和表达特征的研究

目的 确定我国不同基因种问号钩端螺旋体(简称钩体)参考标准株携带毒力相关基因invA的情况,了解问号钩体赖株感染细胞前后invA基因转录和表达水平的变化.方法 采用PCR检测4个不同基因种问号钩体株及双曲钩体Patoc Ⅰ株invA基因.克隆问号钩体全长invA基因并测序,构建问号钩体黄疸出血群赖型赖株invA基因原核表达系统.Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组蛋白rlnvA后免疫家兔获得抗血清,免疫双扩散法检测其效价.建立问号钩体赖株感染人胚肾上皮细胞HEK293模型,采用荧光定量RT-PCR和Western blot分别检测问号钩体赖株感染HEK293细胞前后invA基因的转录和表达水平的变化.结果 4个不同基因种的问号钩体株均含有invA基因,双曲钩体Patoc Ⅰ株则否.4株不同基因种的问号钩体invA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.33%～100%和98.66%～100%.所构建的原核表达系统能有效地表达rInvA.rInvA兔抗血清免疫双扩效价为1:16.问号钩体赖株感染HEK293细胞30 min以后可大量黏附于细胞表面.问号钩体赖株感染HEK293细胞30 min时,invA基因mRNA水平明显上调,45 min时达到峰值,然后逐渐下降.问号钩体赖株感染HEK293细胞后45 min和60 min时可检出InvA蛋白,感染前及感染90 min以后检测结果均为阴性.结论 invA基因是致病性问号钩体所特有的基因.invA基因具有宿主细胞接触式表达及瞬时表达的特点,与问号钩体侵入宿主细胞密切相关.     

问号钩端螺旋体鞘磷脂酶类溶血素基因功能分析及其感染细胞后转录水平变化

目的 了解问号钩端螺旋体(简称钩体)鞘磷脂酶类溶血素基因sph1～sph4产物溶血活性及其感染细胞后转录水平的变化.方法 以致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株、波摩那群波摩那型罗株和非致病性双曲钩体三宝垄群Patoc型Patoc Ⅰ株基因组DNA为模板,采用PCR扩增全长sph1～spl4基因片段,扩增产物T-A克隆后测序.构建sph1～sph4基因原核表达系统,采用SDS-PAGE检测目的 重组蛋白rSph1～rSph4的表达情况,Ni-NTA亲和层析柱提纯rSph1～rSpM.采用绵羊血平板对rSph1～rSph4溶血活性进行鉴定,实时荧光定量RT-PCR检测问号钩体赖株感染J774A.1细胞前后sph1～sph4基因转录水平的变化.结果 问号钩体赖株和罗株基因组DNA中均能扩增sph1～sph4基因,双曲钩体Patoc Ⅰ株则否.与报道的相应基因序列比较,所克隆的sph1～sph4基因核苷酸序列相似性均为100%.所构建的原核表达系统能分别表达目的蕈组蛋白rSph1～rSph4.rSph1～rSph4均有溶血活性,其中以rSph2溶血活性最强.问号钩体赖株感染J774A.1细胞后,sph1～sph4基因转录水平均上调,其中sph2和sph4基因mRNA水平上调更为明显.结论 sph1～sph4基因仅存在于致病性问号钩体中,其表达产物有溶血活性.问号钩体赖株感染细胞后sph1～sph4基因转录水平的上调,提示此类鞘磷脂酶类溶血素可能在问号钩体感染宿主过程中有重要作用.     

问号钩端螺旋体血清群LipL32基因型分析及其重组蛋白的免疫学鉴定

目的　探讨 15群 15型问号钩端螺旋体 (简称钩体 )中国参考标准株及 2群 2型双曲钩体国际参考标准株是否均存在主要外膜蛋白 (MOMP)基因 (LipL32 ) ,克隆并构建该基因的原核表达系统 ,鉴定表达产物的免疫性。方法　常规酚 氯仿法提取上述钩体株基因组DNA ,高保真PCR扩增全长LipL32基因片段 ,T A克隆后测定核苷酸序列并构建表达系统 ,不同浓度IPTG诱导后用SDS PAGE检测rMOMP表达情况。分别用兔抗TR patocⅠ钩体全菌抗血清、rMOMPs免疫兔血清的Westernblot鉴定其免疫反应性和免疫原性 ,显微镜凝集试验 (MAT)检测rMOMPs免疫兔血清的交叉凝集效价 ,钩体细胞黏附模型检测抗体阻断效果。结果　上述 17株钩体均有LipL32基因 ,但可分LipL32 1和LipL32 2两种基因型。 13个LipL32 1和 4个Li pL32 2基因型之间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为 95 .12 %～ 96 .6 0 %和 97.79%～ 98.16 %。IPTG诱导后rMOMP1和rMOMP2表达量分别占细菌总蛋白的 4 0 %和 10 %。rMOMP1和rMOMP2均能与兔抗钩体TR patocⅠ血清发生结合反应 ,免疫家兔可对上述 17株钩体产生 1∶2～ 1∶6 4MAT效价的凝集抗体。 1∶2～ 1∶16稀释的兔抗rMOMP1和rMOMP2血清均能有效地阻断钩体的黏附。结论　所有检测的钩体具有LipL32 1或LipL32 2基因。所     

问号钩端螺旋体血清群LipL41基因型分析及其表达产物的免疫学鉴定

目的 确定我国15群15株问号钩端螺旋体(简称钩体)参考标准株和2群2株双曲钩体国际标准株携带LipL41基因情况，构建该基因的原核表达系统，鉴定表达产物的免疫原性。方法 常规酚—氯仿法提取上述17株钩体基因组DNA，高保真PCR扩增全长LipL41基因片段，T—A克隆后测序分型。构建LipL41基因原核表达系统，SDS-PAGE检测重组目的蛋白(rLipL41)表达情况。分别用钩体属特异性TP/patoe Ⅰ抗原、rLipL41兔抗血清的Western blot鉴定其免疫反应性和抗原性。分别用显微镜凝集试验(MAT)、钩体黏附J774A．1细胞模型检测兔抗rLipL41血清的交叉凝集效价和黏附阻断作用。结果 15株问号钩体均有LipL41基因，并可分为LipL41／1和LipL41／2两种基因型，2株双曲钩体则否。11个LipL41／1基因和4个LipL41／2基因克隆之间的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为88．61％—88．67％和93．24％—97．18％。所构建的原核表达系统rLipL41／1和rLipL41／2的表达量分别占钩体总蛋白的30％和40％。rLipL41／1和rLipL41／2均能与TP/patoe Ⅰ抗血清发生结合反应，免疫家兔能产生抗体。rLipL41／1和rLipL41／2兔抗血清对上述15株问号钩体MAT效价为1：8，1：128、1：16～1：2．S6稀释时均能有效地阻断钩体对细胞的黏附。结论 我国主要的15群问号钩体代表株均有LipL41／1或LipL41／2基因。所构建原核表达系统能高效表达rLipL41／1和rLipL41／2。rLipL41／1和rLipL41／2是具有良好抗原性和免疫反应性、广泛存在于不同血清群问号钩体表面的蛋白抗原。     

问号钩端螺旋体T和B细胞表位联合基因的原核表达及其产物免疫性分析

目的 构建问号钩端螺旋体(简称钩体)LipL32、OmpL1和LipL21蛋白的优势T-和B-细胞联合表位融合基因及其原核表达系统,并对表达产物的免疫原性进行鉴定.方法 人工合成多表位联合基因并构建其原核表达系统.采用SDS-PAGE检测重组蛋白;采用MAT检测重组蛋白兔抗血清与我国钩体标准参考株的凝集效价;Western blot和ELISA检测重组蛋白的免疫原性.结果 获得了多表位融合基因并构建了原核表达系统.表达产物的相对分子质量约为23×103,且主要以可溶性形式存在;重组蛋白兔抗血清免疫双扩散效价为1∶8,该抗血清能与我国15群的钩体标准参考株发生凝集反应,ELISA证明该重组蛋白能检测不同群型钩体感染患者血清中的抗钩体抗体.结论 成功构建了包含钩体LipL32、OmpL1和LipL21蛋白的优势T和B细胞联合表位基因及其原核表达系统,表达产物具有良好的抗原性和交叉免疫反应性,可作为研制通用型问号钩体基因工程疫苗及血清学检测的抗原.     

中国主要问号钩端螺旋体血清群外膜蛋白OmpL1的基因型,原核表达系统构建表达及免疫学鉴定

目的 探讨15群15型问号钩端螺旋体(简称钩体)中国参考标准株及2群2型双曲钩体国际参考标准株是否均存在外膜蛋白OmpL1基因，克隆并构建该基因的原核表达系统，鉴定表达产物的免疫性。方法 常规酚．氯仿法提取上述钩体的基因组DNA，高保真PCR扩增全长OmpL1基因片段,T-A克隆后测定核苷酸序列并构建原核表达系统，不同浓度lPTG诱导后用SDS-PAGE检测重组蛋白rOMPLI表达情况。分别用兔抗钩体TR／PatocⅠ抗原、rOMPL1血清的Westernblot鉴定其免疫反应性和免疫原性。分别用显微镜凝集试验(MAT)和钩体细胞黏附模型检测兔抗rOMPLI血清的交叉凝集效价和细胞黏附阻断作用。结果 上述17株钩体均具有OmpL1基因，但至少可分3种基因型：OmpL1/1、OmpL1/2和OmpL1/3。与文献报道比较，所克隆的OmpL1/1、OmpL1/2和OmpL1／3基因核苷酸序列同源性分别为93．87％～94．08％、89．82％～100％和80．89％～81．72％，其氨基酸序列同源性分别为93．13％～98．75％、91．87％～100％和85．63％～88．44％。IPTG诱导后pET32a-OmpL1/1．E．coli／BL21DE3和pET32a-OmpL1/2-E．coliBL21DE3的rOMPL1/1和rOMPL1/2表达量分别占细菌总蛋白的30％和20％。rOMPL1，1和rOMPLl，2均能与兔抗钩体TR／PatocⅠ抗原血清发生免疫结合反应，免疫家兔可获得抗体。兔抗rOMPL1/1和rOMPL1/2血清对上述17株钩体的MAT效价为1：2．1：32，1：2．1：16稀释时均能有效地阻断钩体黏附J744A．1细胞。结论 所检测的钩体均有OmpLl基因，但至少可分为3种不同的基因型。所构建的原核表达系统表达的rOMPL1/1和rOMPL1/2具有良好的免疫原性和免疫反应性。rOMPL1/1和rOMPL1/2具有属特异性、钩体表面的膜蛋白抗原，能诱生交叉凝集抗体，并具有钩体黏附阻断的作用。     

问号钩端螺旋体病人血清中LipL21抗体检测

寻找钩体属特异性保护抗原,对于研制通用型钩体疫苗及实验室诊断试剂盒均有重要价值。Cullen等首先报告了致病性问号钩体均具有属特异性lipL21脂蛋白基因。我们也曾证实我国15群15型问号钩体参考标准株均含有序列保守的lipL21基因。已知钩体病免疫保护作用主要依赖血清抗体为主的体液免疫。我们采用显微镜凝集试验(MAT)检测了156份钩体病人血清的凝集效价,并建立rLipL21-IgM/IgG-ELISAs对血清标本中LipL21的IgG和IgM型抗体进行了检测。     

问号钩端螺旋体铁离子调节蛋白A的免疫原性及保守性研究

目的克隆表达和鉴定问号钩端螺旋体（L．interrogans，简称钩体）黄疸出血群赖型赖株中铁离子调节蛋白A（IRPA），研究IRPA的免疫原性和在不同钩体菌种中的保守性，探讨其在致病和疫苗研究中的意义。方法生物信息学软件分析预测IRPA的特征。构建原核表达质粒pQE31-IRPA，经IPTC诱导后用SDS-PAGE及Western blot鉴定表达情况。用表达的重组蛋白免疫BALB／c小鼠，Western blot检测其免疫原性和在不同血清型钩体中的保守性。ELISA和Western blot检测钩体全菌兔抗血清中的IRPA抗体。结果生物信息学预测结果显示，IRPA是可能位于外膜的脂蛋白，在钩体内有多个蛋白可能与之相互作用。成功克隆表达了重组质粒pQE31-IRPA，重组蛋白能刺激BALB／c小鼠产生抗体（效价为1：32000），并能与相应抗体反应，具有良好的免疫原性。在15株不同血清型的问号钩体及1株双曲钩体（L．biflex）中均可检测到重组蛋白的表达，并在钩体全菌兔抗血清中检测到其抗体。结论IRPA具有良好的免疫原性和保守性，为进一步研究其在钩体病中的作用机制及其作为候选基因疫苗的研究奠定了基础。     

问号钩端螺旋体脂蛋白LipL32膜定位及其免疫应答

目的 确定问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性脂蛋白抗原LipL32膜定位及其自然抗体应答情况和抗体类型.方法 IPTG诱导目的 重组蛋白rLipL32-1和rLipL32-2表达,Ni-NTA亲和层析法提纯rLipL32.采用显微镜凝集试验(MAT)检测四川地区钩体患者血清标本及rLipL32兔抗血清与我国问号钩体参考标准株的交叉凝集情况.采用胶体金免疫电镜技术对LipL32进行膜定位.建立基于rLipL32的ELISA,检测钩体患者血清中特异性抗体类型及其水平.结果 黄疸出血群是四川地区最主要的优势钩体血清群.rLipL32兔抗血清均能与我国问号钩体参考标准株发生MAT效价为1∶80～1∶320的交叉凝集反应.LipL32是位于钩体外膜表面的蛋白质分子.156例MAT阳性钩体患者血清标本中,rLipL32-1和rLipL32-2特异性IgM阳性率分别为91.0%～92.9%和90.4%～92.3%,特异性IgG阳性率分别为99.4%和97.4%～98.1%.结论 LipL32是问号钩体属特异性表面蛋白抗原.自然感染钩体时,LipL32-1和LipL32-2可诱导机体产生IgM和IgG两类血清抗体.rLipL32-1和rLipL32-2可作为研制检测试剂盒的候选抗原.     

问号钩端螺旋体鞭毛蛋白相关蛋白FliH/Ⅰ/Y/N基因原核表达和膜定位

目的 克隆问号钩端螺旋体(简称钩体)鞭毛相关蛋白编码jliH、fliⅠfliH、和fliN并构建其原核表达系统,制备表达产物抗血清并了解其蛋白的定位.方法 以苯酚-氯仿法提取的问号钩体黄疸出血群赖型赖株基凶组DNA为模板,用PCR扩增全长fliH,fliⅠ,firY和flfliN基因片段,T-A克隆后测序,继而构建上述目的 基因克隆的原核表达系统.采用SDS-PAGE和BioRad凝胶图像分析系统检查重组蛋白rFliH、rFliI、rFliY和rHiN的表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯目的 表达产物.皮下免疫家兔获得4种目的 重组蛋白抗血清,用ELISA和Western blot分别检测抗血清效价并了解抗血清与相应抗原结合的能力.采用免疫电镜技术对FliH、FliⅠ、FliY和FliN进行定位.结果 PCR扩增获得大小分别为924、1365、1065和318 bp的全长fliH,fliⅠ,fliY和fliN基因片段,与报道的序列比较.其核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%.所构建的原核表达系统均能有效地表达目的 重组蛋白,其产量均约为20%.rFliH、rFliⅠ、rFliY和rHiN蛋白免疫家兔后能产生抗体,其兔抗血清ELISA效价达到1:100 000以上,并分别识别钩体相应重组蛋白和膜蛋白提取物而出现明显的Westem杂交条带.FiH、FliⅠ、FliY和FliN蛋白分布于问号钩体内膜、外膜或内外膜之间.结论 本研究成功地构建了能高效表达问号钩体鞭毛相关蛋白FliH、FliⅠ、FIiY和HiN的原核表达系统,并获得了能有效识别上述蛋白抗原的高效价抗血清.鞭毛相关蛋白HiH、Flil、FliY和FIiN是问号钩体内膜或外膜蛋白成分.     

问号钩端螺旋体rLTB/rCTB-LipL32/1免疫保护作用及野生株LipL32基因表达和患者抗体检测

目的构建LTB—LipL32／1和CTB—LipL32／1融合基因原核表达系统并鉴定其表达产物的免疫和佐剂活性及保护作用，了解问号钩端螺旋体(简称钩体)野生株LipL32基因携带、表达及钩体病人血清LipL32基因产物抗体产生频率。方法采用常规分子生物学技术构建LTB—LipL32／1和CTB—LipL32／1融合基因及其原核表达系统。采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rLTB-LipL32／1及rCTB-LipL32／1表达情况。分别采用Western blot和GM1-ELISA检测rLTB-LipL32／1及rCTB—LipL32／1的免疫反应性和佐剂活性。采用PCR和MAT分别检测97株问号钩体野生株LipL32基因及其表达情况。采用ELISA检测228例钩体病人血清LipL32基因产物的抗体。采用豚鼠保护试验检测重组蛋白的免疫保护作用。结果与报道的相关序列比较，LTB—LipL32／1和CTB-LipL32／1融合基因核苷酸序列相似性分别为99．12％～99．71％和98．54％～99．42％，氨基酸序列相似性分别为97．58％-99．63％和96．77％～99．63％。rLTB-LipL32／1和rCTB—LipL32／1表达产量均约为细菌总蛋白的10％，并主要以包涵体形式存在。rLTB—LipL32／1和rCTB-LipL32／1均分别能与LipL32／1兔抗血清和牛GMI结合。97．9％(95／97)问号钩体野生株含有LipL32基因，95．9％(93／97)问号钩体野生株与rLipL32／1和rLipL32／2兔抗血清的MAT结果阳性。97．4％(222／228)和94．7％(216／228)的病人血清rLipL32／1和rLipL32／2抗体阳性。rLTB-LipL32／1、rCTB-LipL32／1和rLipL32／1豚鼠保护率分别为75．0％、75．0％～87．5％、50．O％～62．5％。结论成功构建了LTB—LipL32／1和CTB—LipL32／1融合基因及其原核表达系统。rLTB-LipL32／1和rCTB-LipL32／1融合蛋白有良好的抗原性和佐剂活性及一定的免疫保护作用，具有成为问号钩体属特异性疫苗的良好前景。LipL32／1是不同问号钩体血清群中广泛存在、序列保守、高频率表达的基因。     

钩端螺旋体内毒素的实验研究 Ⅴ 钩端螺旋体脂多糖增强机体特异性抗感染能力的作用

波摩那群波摩那型56608株钩端螺旋体脂多糖(L-LPS)免疫的豚鼠能抵抗同株钩端螺旋体的攻击而免于发病和死亡,旦其心血和肾脏培养阳性率也明显下降。L-LPS免疫动物后可产生以IgM为主的群特异性抗体。该抗体当有补体存在时,能在体外裂解钩端旋螺体。此外,L-LPS尚能特异性地抑制豚鼠腹腔巨噬细胞的粘附作用。实验结果提示L-LPS为一种保护性抗原,可特异性地增强机体抗感染的能力。     

感染人单核细胞THP-1前后钩端螺旋体外膜蛋白抗原表达差异性

目的 了解感染人单核细胞THP-1前后钩端螺旋体(简称钩体)外膜蛋白表达变化,为选择钩体基因工程疫苗候选抗原提供依据.方法 采用Triton X-114法提取感染THP-1细胞前后问号钩体黄疸出血群赖型赖株外膜蛋白.采用双向电泳技术分离钩体外膜蛋白,银染色法检测感染前后钩体外膜蛋白表达量及其差异.感染细胞后4个表达显著上调和4个表达显著下调的钩体蛋白点胰酶水解后,采用LC-MS/MS方法进行鉴定.应用生物信息学软件分析靶蛋白跨膜区和信号肽,采用实时荧光定量RT-PCR检测感染细胞前后靶基因mRNA水平变化.构建靶基因原核表达系统,采用钩体感染豚鼠模型了解重组靶蛋白的免疫保护作用.结果 感染THP-1细胞60 min后,问号钩体赖株外膜蛋白中Loa22、GroEL、F0F1 ATP合成酶α和β亚单位表达水平均显著升高(P＜0.05),FluB2、LigB、OmpA和OmpA家族蛋白表达显著下降(P＜0.05),实时荧光定量RT-PCR检测结果与之基本一致.生物信息学分析结果显示,上述8个外膜蛋白中,OmpA和OmpA家族蛋白为跨膜蛋白,其余均无跨膜结构,Loa22、LigB和OmpA家族蛋白含有信号肽.200 μg重组表达的靶蛋白 rLoa22或rGroEL对豚鼠的免疫保护率均为75.0％.结论 问号钩体赖株感染细胞时外膜蛋白表达谱可发生明显变化.感染后高表达的钩体外膜蛋白尤其是GroEL和Loa22,可作为钩体基因工程疫苗侯选抗原.     

中国钩端螺旋体rRNA基因限制性内切酶酶切位点多态性分类研究

目的初步建立我国致病性钩端螺旋体ｒＲＮＡ基因限制性内切酶酶切位点多态性分类体系。方法采用ｒＲＮＡ基因限制性内切酶酶切位点多态性（ＭＲＳＰ）方法对６５个血清型７５株国内外钩端螺旋体参考株及２７株野生株进行分析。结果１６ＳｒＲＮＡ及２３ＳｒＲＮＡ基因在ＨｉｎｆⅠ、ＤｄｅⅠ的酶切位点上呈多态性,分别存在１８种和２４种不同的图谱。结合两种方法则有３４种不同的图谱。致病性钩端螺旋体间ＭＲＳＰ谱型差别相对较小,遗传距离较近,而它们与非致病性钩端螺旋体的ＭＲＳＰ谱型相差大,遗传距离远。国内主要流行型的ＭＲＳＰ只表现为ＭＲＳＰ１型和２型,非主要流行型的ＭＲ－ＳＰ型变化较多。大多数野生株与相应的参考株的ＭＲＳＰ型相同,个别具有不同ＭＲＳＰ型的野生株与相应参考株的遗传距离较近。结论ｒＲＮＡ基因限制性内切酶酶切位点多态性（ＭＲＳＰ）可用于钩体分类,而且是钩体病分子流行病学调查的一种好方法     

问号赖型钩端螺旋体重组质粒pDL121及其表达产物的初步研究

目的:探讨问号赖型钩端螺旋体重组质粒pDL121外源基因及其表达产物23 kDa蛋白的特点。方法:用6种内切酶对pDL121行酶谱分析,用Digoxin标记的pDL121外源基因片段作探针对不同种属的钩体进行杂交,用SDS-PAGE制备23 kDa蛋白,Western blot鉴定其免疫原性。结果:pDL121外源基因没有6种内切酶的酶切位点,重组探针与致病性钩体(serovar lai strain 017,serovar hebdomadis strain56610,serovar pomona strain 56608)有杂交信号,与非致病性钩体(serovar patoc strain Patoc I,serovar illini strain 3055)无杂交信号,亦不识别大肠杆菌。23 kDa兔抗血清可识别pDL121体外表达的23 kDa蛋白带和赖型钩体017株超声抗原成份;其抗体滴度为1/12800;用pDL121细菌裂解液主动免疫豚鼠,可使豚鼠抵抗强毒力株钩体攻击。结论:pDL121外源基因可能是赖型钩体的一个新基因;该重组探针能鉴别致病性钩体和非致病性钩体;23 kDa抗原有良好的免疫原性,可能是赖型钩体017株的保护性抗原。     

问号钩端螺旋体属特异性外膜蛋白OmpL1和LipL21抗原表位预测及鉴定

目的 筛选问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性外膜蛋白OmpL1和LipL21有效T和B细胞联合抗原表位,为研制多抗原肽(multiple antigenic peptide,MAP)疫苗提供基础.方法 采用生物信息学方法预测OmpL1和LipL21分子中T和B细胞联合抗原表位.采用PCR扩增候选联合抗原表位片段并分别构建其噬菌体展示系统.分别以rOmpL1或rLipL21、黄疸出血群赖株、钩体患者抗血清为一抗,采用Western blot检测各抗血清与目的表位的免疫反应性及其强度.结果 通过抗原表位预测,选择了高分值的4个OmpLl和2个LipL21联合表位.经扩增获得了预期的各抗原表位片段,各目的表位序列均准确插入噬菌体PⅢ蛋白N端并有效表达.各抗血清均能识别上述6个联合表位.其中LipL21的97～112和176-184表位对任一抗血清均显示相似强度的杂交条带.综合4个OmpL1表位对3种抗血清的不同Western blot结果及其实际意义,杂交信号从强到弱依次为173～191、87～98、297～320和59～78表位.结论 所研究的6个联合表位均分别为LipL21和OmpL1的有效抗原表位,其中LipL21的97～112、176～184和OmpL1的87～98、173～191表位可应用于钩体MAP疫苗研制.