丹酚酸B盐对转化生长因子-β1刺激肝星状细胞活化与胞内信号转导的作用

目的 探讨丹酚酸B盐（SA-B）抗肝纤维化的作用机理。方法 分离大鼠肝星状细胞（HSC）,于无包被的塑料培养皿上原代培1、4、7d,细胞分别处于静止,中间活化与完全活化3种活化状态,予以100pmol/L转化生长因子β1(TGF-β1）刺激,观察细胞α-肌动蛋白表达与胶原分泌的变化。选择对TGF-β1刺激最为敏感的中间活化状态HSC为细胞模型,[^3H]胸腺嘧啶掺入法观察0.1μmol/L-1mmol/LSA-B对该细胞增殖的作用,倒置显微镜观察药物对细胞形态的影响;Western印迹与Northern印迹等方法观察SA-B对TGF-β1刺激活化的HSC胞外基质基因与蛋白表达,α-肌动蛋白表达的影响;提取细胞质与细胞核蛋白,Western印迹方法观察SA-B对TGF-β1刺激的HSCSmad2/3蛋白表达,磷酸化与核转位的影响。结果 TGF-β1促进各活化状态HSC的胶原分泌,促进率分别为128.6%,207.3%与188.2%,中间活化状态HSC对TGF-β1的促胶原分泌最为敏感,除0.1mmol/L-1mmol/LSA-B引起部分细胞死亡外,0.1μmol/L-10μmol/LSA-B对细胞形态无影响,但可浓度依赖性地抑制细胞增殖,细胞内[^3H]胸腺嘧啶掺入量分别为对照组的76%,60.1%与47.8%,1μmol/L-100644mol/LSA-B明显抑制TGF-β1刺激的HSC胶原分泌量（分别为对照组的68.6%与56.1%)。抑制α-肌动蛋白与纤维蛋白酶原激活物抑制子蛋白表达,下调I型前胶原基因表达,0.1μmol/L-10μmol/LSA-B不同程度地抑制Smad2/3的蛋白表达量,明显抑制Smad2蛋白胞内磷酸化与核转位。结论 SA-B抑制TGF-β1的HSC胞内信号转导,从而拮抗TGF-β1的促HSC活化,以上作用是SA-B抗肝纤维化的主要机理。     

罗格列酮对转移生长因子诱导的大鼠肺纤维化的影响及其作用机制研究

目的采用转化生长因子（TGF-β1）诱导肺成纤维细胞,给予罗格列酮（过氧化物体增殖活化受体γ激动剂）干预,明确其对肺纤维的治疗作用及其作用机制。方法以组织贴块法培养肺成纤维细胞。实验分为0.4%血清组、TGF-β1刺激组、罗格列酮＋TGF-β1处理组,采用免疫细胞化学染色法检测TGF-β1和罗格列酮对肺成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的作用;采用Westernblot法检测肺脏成纤维细胞ERK1/2及磷酸化ERK1/2蛋白的表达。结果罗格列酮能够抑制TGF-β1诱导的大鼠肺成纤维细胞的增殖,抑制了Ⅰ型、Ⅲ型胶原的表达。同时磷酸化的ERK1/2蛋白的表达下降,而ERK1/2表达无明显改变,表明罗格列酮抑制了肺成纤维细胞的ERK1/2信号转导途径的活化。结论 TGF-β1能够通过激活ERK1/2途径促进大鼠肺成纤维细胞的增殖和胶原合成,而罗格列酮能够通过阻断TGF-β1介导的ERK1/2通路的激活进而抑制大鼠肺成纤维细胞增殖和胶原合成,对肺间质纤维化存在一定治疗作用。     

丹参酚酸B盐对转化生长因子β1活化的大鼠肝星状细胞内细胞外信号调节激酶信号转导通路的抑制作用

目的:探讨丹参酚酸B盐(salvianolic acid B,SA-B)对转化生长因子β1 (transforming growth factor-β1,TGF-31)活化的大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)内细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信号转导通路的影响.方法:采用原位灌流酶消化及Nycodenz密度梯度离心的方法分离正常大鼠HSC,将TGF-β1和SA-B直接添加于原代HSC的无血清培养液中.蛋白印记法检测HSC内磷酸化和总ERK,以及有丝分裂原激活蛋白激酶激酶MEK、有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶Raf、α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和Ⅰ型胶原蛋白的表达.结果:SA-B可抑制正常原代HSC及TGF-β1刺激的HSC内ERK上游激酶MEK的磷酸化;而对正常原代HSC及TGF-β1刺激的HSC内MEK上游激酶Raf-1的磷酸化无明显抑制.SA-B对TGF-β1刺激的HSC内α-SMA表达有明显的抑制作用,SA-B与ERK阻断剂联用,几乎接近完全阻断α-SMA的表达.SA-B对正常培养的HSC和经TGF-β1刺激的HSC Ⅰ型胶原蛋白的合成都有明显的抑制作用.结论:SA-B抑制TGF-β1刺激的HSC内ERK信号转导通路的作用环节在于抑制了MEK的磷酸化.SA-B通过抑制TGF-β1的ERK信号转导通路,减少了因HSC活化导致的α-SMA表达和Ⅰ型胶原蛋白合成增加.     

川芎嗪对成纤维细胞及TGF-β/Smads信号传导的影响

目的研究川芎嗪对成纤维细胞和TGF-β信号传导通路的影响,探讨其抗纤维化作用的机理。方法以NIH3T3成纤维细胞为模型,通过H3-thymidine DNA掺入量测定川芎嗪对成纤维细胞生长和增殖的影响;通过Ⅰ型胶原的免疫荧光染色实验,观察川芎嗪对成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白表达的影响;并利用Mv1Lu-(CAGA)12-Luc稳定细胞系,探讨川芎嗪对TGF-β/Smads信号传导通路的影响。结果川芎嗪可抑制成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白的表达。无病理因子刺激的情况下,川芎嗪在0.2~20 mg/L剂量范围内对NIH3T3细胞增殖和TGF-β信号传导的影响不明显;而在TGF-β刺激的情况下,在川芎嗪浓度为20 mg/L时,对NIH3T3细胞增殖出现明显的抑制作用(P<0.05)。川芎嗪在0.2~20 mg/L剂量范围内,对于正常情况下TGF-β响应的细胞荧光酶活性影响不明显;而在TGF-β(2μg/L)刺激的情况下,各剂量组都对TGF-β响应的荧光酶活性表现了明显的抑制(P<0.05或P<0.001)。结论川芎嗪能抑制成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白的表达和成纤维细胞的增殖,抑制TGF-β/Smads信号传导通路,可能是其发挥抗纤维化作用的机理之一。     

MAPK抑制因子对HSC中Smad2/3磷酸化及Smad4核转位的影响

目的 探究3种丝裂原活化蛋白激酶( MAPK)抑制因子对转化生长因子-β( TGF-β)活化的大鼠肝星状细胞( HSC)中Smad2/3磷酸化及Smad4 核转位的影响. 方法采用Ⅳ型胶原酶和链酶蛋白酶原位肝灌流法分离正常大鼠HSC并传代培养,分别用细胞外信号调节激酶( ERK)、c-Jun氨基末端激酶( JNK )、p38 抑制因子( PD98059、SP600125、SB203580 )与HSC共同培养,再加入TGF-β1活化细胞,采用免疫沉淀和 Western blot 法检测 pSmad2C、pSmad2L、pS-mad3L蛋白表达;采用细胞免疫荧光法检测Smad4 蛋白表达及细胞内定位情况. 结果 Western blot显示静息状态下HSC几乎不表达 pSmad2C 而低表达 pSmad2L、pSmad3L, TGF-β1刺激后显著上调上述磷酸化蛋白表达, p38 抑制因子(1、3 μmol/L)、ERK 抑制因子(1 μmol/L)对 Smad2C、Smad2L、Smad3L 磷酸化无显著影响;p38 抑制因子( 10μmol/L)降低了 pSmad3L 蛋白表达;ERK 抑制因子( 3、10μmol/L)降低了pSmad2C蛋白表达;JNK抑制因子(1、3、10μmol/L)减少了 pSmad2C、pSmad2L、pSmad3L 蛋白表达.TGF-β1刺激可明显诱导Smad4核转位,而3种MAPK抑制因子不同程度地抑制TGF-β1 诱导的Smad4 转位入核. 结论 在 HSC 细胞中 TGF-β1 可能通过活化 JNK 通路促进Smad2/3磷酸化,活化ERK、JNK、p38 通路促进Smad4 核转位.     

鹿茸多肽对小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3增殖和胶原蛋白分泌能力的影响及其机制

目的：探讨鹿茸多肽对小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3增殖和胶原蛋白分泌能力的影响,并阐明其相关作用机制。方法：选取对数生长期的NIH/3T3细胞,加入不同剂量（1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00和200.00 mg·L^-1）鹿茸多肽作为实验组,以加入0 mg·L^-1鹿茸多肽的细胞作为空白对照组,以加入50μg·L^-1碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的细胞作为阳性对照组。MTT法检测各组NIH/3T3细胞存活率,ELISA法检测各组NIH/3T3细胞中胶原蛋白分泌情况,划痕愈合实验检测各组NIH/3T3细胞的迁移能力,Western blotting法检测各组NIH/3T3细胞的细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK 1/2）的磷酸化蛋白（p-ERK 1/2）表达水平,免疫荧光法检测转化生长因子β1（TGF-β1）的表达情况。结果：与空白对照组比较,阳性对照组和6.25、12.50、25.00、50.00、100.00及200.00 mg·L^-1鹿茸多肽组细胞存活率明显升高（P<0.05或P<0.01）。与空白对照组比较,阳性对照组和6.25、12.50、25.00和50.00mg·L^-1鹿茸多肽组NIH/3T3细胞培养液中Ⅰ型胶原蛋白水平明显升高（P<0.05或P<0.01）,阳性对照组和12.50及25.00 mg·L^-1鹿茸多肽组NIH/3T3细胞培养液中Ⅲ型胶原蛋白水平明显升高（P<0.05）。与空白对照组比较,阳性对照组和12.50mg·L^-1鹿茸多肽组细胞划痕愈合率、NIH/3T3细胞中p-ERK 1/2表达水平及NIH/3T3细胞质中TGF-β1表达水平均明显升高（P<0.05或P<0.01）。结论：鹿茸多肽能促进NIH/3T3细胞增殖和胶原蛋白分泌,并提高其迁移能力,其作用机制是可能是通过激活ERK 1/2磷酸化及增加TGF-β1表达实现的。     

扶正化瘀方影响转化生长因子β1/Smad信号通路的抗肝纤维化作用机制

目的：探讨扶正化瘀方影响转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）/Smad信号转导的抗肝纤维化作用机制。方法：本研究分体内实验和体外实验两部分。在体内实验中,37只雄性Wistar大鼠分为正常组（5只）、模型组（18只）和扶正化瘀方组（14只）。模型组和扶正化瘀组大鼠采用二甲基亚硝胺（dimethylnitrosamine,DMN）腹腔注射复制大鼠肝纤维化模型。灌胃治疗4周后,采用盐酸水解法检测肝组织中羟脯氨酸（hydroxyproline,Hyp）含量,蛋白质印迹法分析肝组织中TGF-β1、TGF-β1Ⅰ型受体（TGF-β1 type Ⅰ receptor,TβR-Ⅰ）、Smad2、Smad3及磷酸化Smad2/3蛋白的表达。体外实验采用培养4d的原代大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）,分为对照组、TGF-β1组、10%扶正化瘀方药物血清组及TβR-Ⅰ胞内激酶抑制剂（SB-431542）组。后3组用2.5ng/mLTGF-β1刺激24h后,对照组及TGF-β1组加10%正常大鼠血清,10%扶正化瘀方药物血清组加10%服用扶正化瘀方的大鼠血清,SB-431542组加10%正常大鼠血清及10μmol/LSB-431542。共孵育24h后,免疫荧光染色检测HSC中α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）和Smad3蛋白的表达,蛋白质印迹法分析HSC中α-SMA蛋白的表达。结果：体内实验发现,扶正化瘀方可明显降低纤维化肝组织中异常升高的Hyp含量及TGF-β1、TβR-Ⅰ、磷酸化Smad2/3蛋白的表达。体外研究发现,正常HSC中α-SMA、TβR-Ⅰ表达较低,TGF-β1刺激可显著上调其表达;扶正化瘀方药物血清共孵育后,可明显抑制TGF-β1诱导的HSC中α-SMA的表达;正常HSCSmad3主要表达在细胞质中,细胞核中表达较低,TGF-β1可显著刺激Smad3向细胞核转移,扶正化瘀方药物血清可明显抑制TGF-β1诱导的Smad3核转位。结论：扶正化瘀方可下调纤维化大鼠肝脏及HSC中的TGF-β1/Smad病理信号转导通路,这可能是扶正化瘀方抗肝纤维化的部分作用机制。     

桂皮醛对小鼠成纤维细胞瘤NIH3T3细胞碱性成纤维细胞生长因子及转化生长因子β1表达的影响

目的 研究桂皮醛刺激小鼠成纤维细胞瘤NIH3T3细胞后碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及转化生长因子β1(TGF-β1)蛋白在不同时相点表达的规律,探讨桂皮醛促进成纤维细胞增殖及胶原合成的机制.方法 采用MTT法观察不同质量浓度桂皮醛对NIH3T3细胞增殖的影响;利用羟脯氨酸(Hyp)测试法测定细胞上清中胶原水平;利用免疫细胞化学技术检测桂皮醛对NIH3T3细胞bFGF、TGF-β1蛋白表达的影响.结果 桂皮醛作用NIH3T3细胞48 h后,细胞增殖速度和细胞上清中的胶原量均较对照组明显增加.桂皮醛刺激后,bFGF和TGF-β1蛋白表达增加,其中bFGF蛋白表达高峰在18 h,TGF-β1蛋白在刺激后12 h达到峰值.结论 桂皮醛可以上调内源性生长因子bFGF、TGF-β1蛋白的表达,这可能是桂皮醛体外促进NIH3T3细胞增殖及胶原合成,以及在创伤愈合、组织修复方面发挥作用的分子生物学机制.     

二苯乙烯苷对TGF-β1诱导新生大鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的影响及其机制

探讨二苯乙烯苷(2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡糖苷,TSG)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的新生大鼠心肌成纤维细胞(CFB)增殖和胶原合成的影响,并研究其相关机制。用消化法培养新生SD大鼠CFB,建立TGF-β1诱导新生大鼠CFB纤维化模型。采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入法检测CFB增殖情况;乳酸脱氢酶(LDH)法检测药物对细胞毒性作用;羟脯氨酸测定检测CFB胶原含量;流式细胞仪测定细胞周期;Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、增殖细胞核抗原(PCNA)、Ⅰ型胶原(COLⅠ)、Ⅲ型胶原(COL Ⅲ)、p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3、p-ERK、ERK、p-P38、P38、p-JNK、JNK的蛋白表达。结果表明,终浓度为0.1~100 μmol/L的TSG无明显细胞毒性作用;在一定浓度范围内,TSG可明显抑制TGF-β1诱导的CFB增殖和胶原合成,抑制细胞由G₀/G₁期向S期的转变,抑制TGF-β1诱导的CFB核内PCNA的蛋白表达,降低α-SMA、COLⅠ和COL Ⅲ的过度表达,并抑制TGF-β1诱导的Smad3、ERK和P38的磷酸化。因此推测一定浓度的TSG能抑制TGF-β1诱导的CFB增殖和胶原合成,其机制可能与干预Smad3、ERK和P38信号通路有关。     

二甲双胍抑制大鼠胆管成纤维细胞胶原生成的分子信号机制

目的 探讨二甲双胍是否通过活化腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）抑制转化生长因子-β1（TGF-β1）刺激的大鼠胆管成纤维细胞胶原生成并揭示其分子信号机制。方法 取雌雄各半的SD大鼠共50只（体质量150~200 g）,CO2窒息法处死后,无菌条件下分离并培养大鼠胆管成纤维细胞,倒置显微镜观察所培养的细胞,发现不同体质量及性别的大鼠所获取的细胞形态及活性无差异。采用随机数字表法进行随机分组,分别设置对照组、TGF-β1组、Smad3 siRNA干预组、结缔组织生长因子（CTGF）siRNA干预组、二甲双胍干预组、Compound C干预组,每组3个样本。设置对照组：大鼠胆管成纤维细胞正常培养;TGF-β1组：10 ng/mL TGF-β1孵育细胞;Smad3 siRNA干预组：Smad3 siRNA转染24 h后＋10 ng/mL TGF-β1孵育细胞;CTGF siRNA干预组：CTGF siRNA 转染 24 h 后＋10 ng/mL TGF-β1 孵育细胞;二甲双胍干预组：10 mmol/L 二甲双胍＋10 ng/mL TGF-β1 孵育细胞;Compound C干预组：10 μmol/L Compound C＋10 mmol/L二甲双胍＋10 ng/mL TGF-β1孵育细胞。以TGF-β1刺激大鼠胆管成纤维细胞分泌胶原,以Smad3 siRNA或CTGF siRNA转染细胞以抑制Smad3或CTGF蛋白的表达,以二甲双胍孵育细胞以激活AMPK,以Compound C预处理细胞以抑制AMPK的活性。采用ELISA或Western-blot的方法检测CTGF、胶原（I Col I）蛋白水平;Western-blot的方法检测p-Smad3/t-Smad3、p-AMPK/t-AMPK、CTGF水平。结果 TGF-β1以时间和剂量依赖的方式刺激胆管成纤维细胞胶原I生成,二甲双胍激活的AMPK也剂量依赖性抑制TGF-β1诱导的胶原I生成;AMPK抑制剂Compound C预孵育细胞,可显著逆转二甲双胍激活的AMPK抑制胶原I生成的作用（P<0.01）。进一步发现,二甲双胍激活的AMPK对TGF-β1刺激的Smad3磷酸化无抑制作用,却可抑制其下游的CTGF蛋白表达（P<0.01）及胶原I生成（P<0.01）,而AMPK抑制剂可逆转二甲双胍对CTGF及胶原I的上述作用。结论 二甲双胍通过激活AMPK抑制TGF-β1/Smad3信号通路诱导的CTGF蛋白表达,进而抑制胆管成纤维细胞胶原I生成。     

黄连素抗心脏纤维化作用及其机制

目的 观察黄连素对心脏纤维化的影响,探讨其可能机制.方法 体外使用转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激心脏成纤维细胞,建立心脏纤维化细胞模型.采用不同浓度(10~90μmol/L)黄连素刺激,观察心脏成纤维细胞的活力、胶原Ⅲ和p38 MAPK蛋白表达水平.结果 低浓度的TGF-β1可增加心脏成纤维细胞的活力,促进胶原Ⅲ的合成.黄连素呈浓度依赖性地抑制心脏成纤维细胞的活力,降低胶原Ⅲ的合成,促进p38 MAPK蛋白磷酸化.结论 黄连素可抑制心脏成纤维细胞的增殖和胶原Ⅲ的合成,其机制可能是通过磷酸化p38 MAPK蛋白起作用.     

TGF-β1对皮肤成纤维细胞的p-ERK表达的影响

目的探讨TGF-β1刺激后对皮肤成纤维细胞中磷酸化ERK表达的影响及相互关系。方法以原代培养人正常皮肤成纤维细胞为研究对象。细胞分2组:浓度组:10 ng/ml、5 ng/ml、1.0 ng/ml、0 ng/ml。时间组:给予10 ng/ml的TGF-β1刺激不同时间,分别在0、15、30、60、120 min的时间点提取蛋白。采用Western blotting法检测成纤维细胞中磷酸化ERK蛋白的表达变化。结果浓度组及时间组p-ERK蛋白表达与对照组相比均有差异(P0.05),随着TGF-β1剂量增加和作用时间延长,其磷酸化ERK蛋白表达水平逐渐增强,在TGF-β1 5 ng/ml时p-ERK水平达作用最强,在作用60 min时p-ERK达高峰。结论随着TGF-β1浓度增加及作用时间延长,大剂量TGF-β1时可上调体外培养成纤维细胞内的ERK信号蛋白活性。TGF-β1诱导的成纤维细胞的p-ERK水平增高可能是依赖ERK通路激活的,但ERK通路与TGF-β/Smad通路存在交互作用的机制,目前还无定论。     

CSD肽对肺成纤维细胞细胞外基质及Smad信号表达的影响

目的研究CSD肽（CSD-p）对转化生长因子β1（TGF-β1）刺激下人胚肺成纤维细胞的细胞外基质及Smad信号表达的影响。方法体外培养人胚肺成纤维细胞,分为4组：对照组（无TGF-β1处理）、TGF-β1处理组、CSD-p处理组、TGF-β1及CSD-p联合处理组。RT-PCR测定各组窖蛋白1mRNA的表达;Western blot检测各组窖蛋白1、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、胶原Ⅰ、p-Smad2、p-Smad3及Smad7蛋白的表达。结果 TGF-β1刺激人胚肺成纤维细胞后,窖蛋白1的mRNA和蛋白表达较对照组明显降低（mRNA：0.404±0.027比1.540±0.262;蛋白：0.278±0.054比1.279±0.085;P〈0.01）。经TGF-β1刺激,人胚肺成纤维细胞的胶原Ⅰ（1.127±0.078比0.234±0.048）、α-SMA（1.028±0.058比0.295±0.024）,p-Smad2（1.162±0.049比0.277±0.014）、p-Smad3（1.135±0.057比0.261±0.046）蛋白表达增加（P〈0.01）;Smad7表达较对照组明显降低（0.379±0.004比1.249±0.046,P〈0.001）。与TGF-β1处理组比较,CSD肽明显抑制TGF-β1诱导的胶原Ⅰ（0.384±0.040）、α-SMA（0.471±0.071）、p-Smad2（0.618±0.096）、p-Smad3（0.461±0.057）蛋白表达;上调Smad7的蛋白表达（0.924±0.065比0.379±0.004）。结论 CSD肽下调TGF-β1刺激下人胚肺成纤维细胞的胶原Ⅰ及α-SMA蛋白的表达,可能通过抑制TGF-β1/Smads信号通路激活,提示使用CSD肽增加窖蛋白1功能可能对肺纤维化具有一定的干预作用。     

互隔交链孢酚对NIH3T3细胞PKA-CREB信号通路的影响

目的：探讨互隔交链孢酚（Alternariol,AOH）对小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3中PKA-CREB信号通路的影响.方法：20μmol/L AOH作用NIH3T3细胞1 h,或用PKA特异性抑制剂10μmol/L H89预处理1 h,再进行20μmol/L AOH刺激实验,同时设溶剂对照组.用免疫荧光和免疫细胞化学染色法检测磷酸化PKA催化亚基表达情况,用免疫细胞化学染色法检测磷酸化CREB表达水平.结果：与溶剂对照组相比,AOH诱导NIH3T3细胞中磷酸化PKA催化亚基和磷酸化CREB水平明显增加（P〈0.05）;用PKA特异性抑制剂H89预处理,降低了AOH激活的PKA催化亚基和CREB的磷酸化水平.结论：AOH能够激活NIH3T3细胞中PKA-CREB信号转导通路,这为探讨AOH致癌的分子机制提供依据.     

异丙酚抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞增殖的机制研究

目的:探讨异丙酚(Propofol)抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的大鼠心肌成纤维细胞(CFb)增殖的机制。方法:用AngⅡ建立诱导新生大鼠CFb纤维化模型。将心肌细胞分为对照组、AngⅡ组和异丙酚组。用流式细胞仪测定各组细胞的周期分布;用ELISA法测定各组细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量;用Western Blot法测定各组细胞中转化生长因子β1(TGF-β1)的蛋白表达量;用免疫细胞化学化法测定各组细胞中细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)和经典型蛋白激酶Cα亚型(cPKCα)的表达。结果:100μmol/L的异丙酚对AngⅡ诱导的大鼠CFb的增殖抑制效果最显著(P<0.01)。与对照组相比,AngⅡ组细胞G_0/G_1期细胞百分率降低(P<0.01),S期和G_2/M期细胞百分率升高(P<0.01);异丙酚组细胞的G_0/G_1期细胞百分率高于AngⅡ组(P<0.01),S期和G_2/M期细胞百分率低于AngⅡ组(P<0.01)。与对照组相比,AngⅡ组大鼠的CFbⅠ、Ⅲ型胶原含量增加(P<0.01);异丙酚组大鼠的CFbⅠ、Ⅲ型胶原含量低于AngⅡ组(P<0.01)。与对照组相比,AngⅡ组大鼠CFb中TGF-β1的蛋表达升高(P<0.01),异丙酚组大鼠CFb中TGF-β1的表达低于AngⅡ组(P<0.01)。与对照组相比,AngⅡ组大鼠CFb中ERK1/2和cPKCα的表达增加(P<0.01);异丙酚组大鼠CFb中ERK1/2和cPKCα的表达低于AngⅡ组。结论:异丙酚能够抑制AngⅡ诱导的大鼠CFb的增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原含量的增加,其机制与降低细胞中TGF-β1的蛋白表达和抑制ERK1/2、cPKCα通路有关。     

人参皂苷Rg1对高糖培养的心肌成纤维细胞Wnt信号通路的影响

目的 建立体外高糖培养心肌成纤维细胞(CFs)的方法,观察人参皂苷Rg1对高浓度葡萄糖培养的心肌成纤维细胞增殖和蛋白分泌及Wnt信号通路的影响.方法 采用体外高糖诱导心肌成纤维细胞增殖模型,应用MTT法检测细胞增殖能力;流式细胞仪检测细胞增殖周期;ELISA法观察细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原及肿瘤生长因子β1(TGF-β1)蛋白的分泌;Western blot法检测β-catenin、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、磷酸化糖原合成酶激酶3β(P-GSK-3β)的蛋白表达水平以观察人参皂苷Rg1对于心肌成纤维细胞Wnt信号通路的影响.结果 人参皂苷Rg1可以抑制细胞增殖(P＜0.05);降低Ⅰ型、Ⅲ型胶原分泌(P＜0.05);减少TGF-β1的合成(P＜0.01);在分子水平上可以抑制β-catenin的表达(P＜0.05),上调P-GSK-3β的表达(P＜0.05).结论 人参皂苷Rg1能抑制心肌成纤维细胞的增殖,减少高糖培养心肌成纤维细胞胶原和TGF-β1的分泌,抑制Wnt信号通路的异常表达,具有潜在的抗心肌纤维化作用.     

非诺贝特对心脏成纤维细胞胶原合成的影响及作用机制

目的过氧化物酶增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor-α,PPARα)具有心血管保护作用,但其对心肌纤维化的影响及作用机制尚不清楚。文中探讨PPARα激动剂非诺贝特(Fenofibrate)对糜酶诱导的心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CF)胶原合成的影响及细胞内信号转导机制。方法用胰酶消化法分离、培养新生SD大鼠的CF,采用RT-PCR检测Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达水平,Western blot检测转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、p-Smad2/3及Smad7的蛋白表达水平。结果①非诺贝特浓度依赖性地抑制糜酶诱导的CF中Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达,其中50和100μmol/L组Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达水平均较糜酶组显著减少(P<0.01)。②不同浓度的非诺贝特预处理组CF的TGF-β1蛋白表达水平呈浓度依赖性减少,其中50和100μmol/L组均较糜酶组明显减少(P<0.05,P<0.01)。③不同浓度的非诺贝特预处理后,p-Smad2/3蛋白表达水平呈递减趋势,...     

ERK1/2信号蛋白在单侧尿路梗阻大鼠肾组织中的表达

目的:探讨单侧尿路梗阻(UUO)模型大鼠肾组织细胞外信号调节激酶(ERK1/2)的表达及意义。方法:42只SD大鼠随机分为模型组和假手术组。模型组采用UUO术,术后1,3,7,14,21 d和28 d处死动物取肾组织,观察肾组织病理改变;用免疫组化法测定肾组织TGF-β1、磷酸化ERK1/2和CollagenⅠ表达。结果:病理结果显示,UUO 3 d肾小管上皮细胞肿胀、肾间质炎症细胞浸润;UUO 14 d肾组织大量炎症细胞浸润和纤维组织增生,28 d肾小管结构基本破坏,纤维组织弥漫增生。免疫组化显示,正常肾组织有基础TGF-β1、磷酸化ERK1/2和CollagenⅠ的表达。UUO3 d TGF-β1增加明显,7 d达高峰,此后表达减少;磷酸化ERK1/2的表达在UUO术后3 d明显增加,并持续增加到第7 d,此后表达减少;而UUO术后3 d肾组织CollagenⅠ表达亦明显升高,并持续增加到28 d。模型组肾组织TGF-β1、磷酸化ERK1/2的表达时相一致并呈明显正相关,并与肾间质CollagenⅠ的积聚密切相关。结论:磷酸化ERK1/2信号蛋白在单侧尿路梗阻大鼠肾组织中的表达明显增高,可能在梗阻性肾病肾间质纤维化过程中起重要作用。     

1,25（OH）2D3对血管紧张素Ⅱ诱导的肾小管上皮细胞转化的抑制作用

目的探讨1,25(OH)2D3对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的肾小管上皮细胞转化起始过程的抑制作用,为临床肾间质纤维化的防治提供理论依据。方法分离SD大鼠肾小管上皮细胞,将其分为对照组、AngⅡ诱导组(AngⅡ终浓度10-8mol/L)以及AngⅡ(10-8mol/L)+1,25(OH)2D3干预组[1,25(OH)2D3终浓度分别为10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L],培养48 h后收集各组细胞。利用酶联免疫吸附实验检测ColⅠ和FN;Real-time RT-PCR检测肾小管上皮细胞TGF-β1mRNA表达;Western Blot检测肾小管上皮细胞TGF-β1蛋白表达。结果实验48 h后,AngⅡ组TGF-β1mRNA表达、蛋白表达及培养上清中ColⅠ和FN浓度均较对照组显著增高,AngⅡ+10-6mol/L1,25(OH)2D3组TGF-β1mRNA表达、蛋白表达较对照组明显增高,但细胞培养上清中ColⅠ和FN浓度仅略有增高,差异无显著性,随着1,25(OH)2D3浓度的降低(10-7mol/L,10-8mol/L),TGF-β1mRNA表达、蛋白表达,细胞培养上清中ColⅠ和FN浓度也随之显著增高(P<0.05)。结论 1,25(OH)2VD3可以部分抑制AngⅡ诱导的肾小管上皮细胞EMT,其机制可能是通过抑制肾小管上皮细胞TGF-β1基因与蛋白表达、减少肾小管上皮细胞ColⅠ和FN分泌实现的。     

LncRNA-MEG3在心肌纤维化过程中的表达变化研究

目的 研究LncRNA-MEG3在大鼠心肌纤维化及心肌成纤维细胞(CFs)活化增殖过程中的表达变化.方法 用异丙肾上腺素(ISO)腹部皮下注射SD大鼠构造心肌纤维化动物模型为实验组(ISO组),对照组注射等量的生理盐水;提取乳鼠CFs,采用转化生长因子β1(TGF-β1)作用CFs构建细胞水平纤维化模型为实验组(TGF-β1组),对照组为未经TGF-β1作用正常培养的CFs;HE、Masson染色观察心肌组织胶原变化;用Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(oα-SMA)、Ⅰ型胶原分子(Collagen Ⅰ)蛋白的表达;qRT-PCR法检测Collagen Ⅰ、α-SMA mRNA和MEG3的表达;CCK-8法检测经TGF-β1作用CFs后的吸光度(OD)值.结果 与对照组比较,ISO组的心肌细胞体积变大、紊乱,组织胶原面积明显增加;ISO组和TGF-β1组中Collagen Ⅰ、α-SMA蛋白和mRNA表达都显著增多,LncRNA-MEG3表达显著减少;CCK-8实验结果提示使用TGF-β1刺激CFs 24、48 h后较对照组的细胞OD值明显增加,即细胞增殖活性增强.结论 Ln-cRNA-MEG3在大鼠心肌纤维化组织及CFs细胞活化增殖中的表达显著降低,提示MEG3在大鼠心肌纤维化及CFs活化增殖中可能发挥了负调控作用,为临床心肌纤维化防治和研究提供新的思路.