与14-3-3ζ相互作用的蛋白Polo样激酶1的筛选与鉴定

目的:应用酵母双杂交系统筛选与14-3-3ζ相互作用的蛋白,进一步鉴定其与Polo样激酶1(Plk1)相互作用。方法:构建pGBKT7-14-3-3ζ诱饵表达载体,筛选HeLa细胞cDNA文库中与14-3-3ζ相互作用蛋白,进一步通过共转酵母、免疫荧光以及外源性和内源性的细胞免疫共沉淀实验验证两者的相互作用。结果:通过酵母双杂交系统筛选出的阳性相互作用蛋白中包括Plk1,进一步通过共转酵母,外源性和内源性的细胞免疫共沉淀实验证实两者的相互作用,免疫荧光实验证实两者共定位于有丝分裂过程中胞质分裂期的中体。结论:Plk1是高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在中体的成熟,有丝分裂期染色体的分离,胞质分裂以及DNA的损伤应答等环节发挥重要作用,其与14-3-3ζ的相互作用为14-3-3蛋白家族参与有丝分裂(M期)的调控提供了直接证据。     

酵母双杂交系统筛选GATA-1相互作用蛋白质及功能验证

目的 利用酵母双杂交技术从人脑cDNA文库中筛选与人GATA-1相互作用的蛋白质.方法 从人K562细胞中扩增出全长GATA1基因,设计引物将其3段截断体亚克隆入酵母表达载体pDBLeu中,转化至AH109感受态酵母中,利用酵母双杂交技术筛选人脑cDNA文库中与其相互作用的蛋白质,阳性克隆通过回转及免疫共沉淀试验进行验证,利用3xGATA荧光素酶报告基因对相互作用蛋白质进行功能验证.结果 成功构建出酵母诱饵蛋白表达质粒pDBLeu-GATA1(1),pDBLeu-GATA1(2),pDBLeu-GATA1(3),筛到34个阳性克隆,用生物信息学分析及回转验证得到5个与GATA-1相互作用的候选蛋白,通过免疫共沉淀试验进一步验证,获得3个蛋白质能与GATA-1相互作用,分别是ECSIT,EFEMP1和GPS2.荧光素酶试验表明这3个蛋白质均能对GATA1的转录活性产生影响,证实它们之间的相互作用具有影响GATA1转录的功能.结论 应用酵母双杂交技术及免疫共沉淀试验,从人脑cDNA文库中成功获得3个与GATA-1相互作用并对其转录活性具有调节作用的蛋白质,为研究GATA1蛋白质的功能提供了新的线索.     

酵母双杂交技术筛选并回转验证在胞内与PML-C结构域相互作用的蛋白

目的 利用酵母双杂交技术在活细胞内筛选并回转验证与PML-C结构域相互作用的蛋白质.方法 通过诱饵质粒pGBKT7-PML-C,利用酵母双杂交系统从白血病细胞cDNA文库中筛选与PML-C结构域相互作用的蛋白质.结果 利用酵母双杂交技术筛选到43个能与PML-C结构域相互作用的克隆;经进一步的归类与酵母回转试验得到9个阳性克隆.结论 在细胞内PML-C结构域能与多种蛋白质有相互作用.中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)介导的急性早幼粒细胞白血病的发生可能与这些相互作用所致的生物学功能改变有关.     

酵母双杂交系统筛选CLN8P相互作用蛋白

目的：应用酵母双杂交系统筛选CLN8P相互作用蛋白质,通过对相互作用蛋白质的筛选及研究,探讨CLN8的功能,为NCL8和NCLs疾病群的发病机制研究提供线索,并为疾病的蛋白质相互作用网络提供资料。方法 应用酵母双杂交技术,以pLexA-CLN8为诱饵质粒筛选人胎脑cDNA文库,得到Leu+LacZ+阳性克隆,进一步进行验证,并对验证后的阳性克隆的外源性片断进行测序及同源性分析。结果 从人胎脑cDNA文库中筛选得到60个Leu+LacZ+阳性克隆;将获得的具有外源性片段的文库质粒与诱饵质粒一对一重新转入酵母体内对相互作用进行验证,共获得阳性克隆22个;对验证后阳性克隆测序并进行同源性分析,共获得不同的候选基因序列10个。结论 应用酵母双杂交系统,共筛选得到10个不同的基因,其编码蛋白与CLN8P有相互作用,可能与NCLs 发病机制相关。     

NALP3富含亮氨酸重复序列结构域识别人细胞周期蛋白H和禽冠状病毒蛋白

 目的：寻找与NALP3富含亮氨酸重复序列（leucine-rich repeat, LRR）结构域相互作用的蛋白质分子。方法：克隆NALP3富含亮氨酸重复序列（NALP3-LRR）结构域的DNA序列并经测序检验。应用酵母双杂交技术,构建以NALP3-LRR结构域为诱饵基因的酵母双杂交载体,对人胚肺cDNA文库进行杂交筛选,经酵母回交实验验证蛋白质在酵母细胞内的相互作用并对阳性克隆的DNA进行序列测定和生物信息学分析。将筛选到的阳性克隆进一步用免疫共沉淀实验验证NALP3-LRR结构域与阳性蛋白之间相互作用的可靠性。结果：成功克隆NALP3-LRR结构域的DNA序列并经测序检验正确。用酵母双杂交技术对人胚肺cDNA文库进行酵母杂交筛选共获得4个阳性克隆。免疫共沉淀实验证实能与NALP3-LRR结构域发生相互作用的阳性蛋白是人细胞周期蛋白H和禽传染性支气管炎病毒株Cal99的ORF1a。结论：NALP3的富含亮氨酸重复序列结构域能与人细胞周期蛋白H和禽冠状病毒蛋白发生相互作用。     

应用酵母双杂交系统筛选Foxp3△2相互作用蛋白

目的:应用酵母双杂交系统从人外周血白细胞cD-NA文库中筛选与转录因子Foxp3相互作用的蛋白,为进一步研究Foxp3的转录调控机制奠定基础。方法:首先构建pG-BKT7-Foxp3△2酵母双杂交诱饵载体,转化AH109酵母细胞,检测其毒性及自激活作用;然后将诱饵质粒与人外周血白细胞cDNA文库共转AH109酵母细胞,筛选了与Foxp3△2存在相互作用的蛋白。结果:成功构建了pGBKT7-Foxp3△2酵母表达载体,经转染AH109酵母细胞,无有毒性,无自激活作用。获得了40个阳性克隆,经生物信息学分析,其中9个具有开放读框。结论:应用酵母双杂交技术筛选出一组可与Foxp3△2相互作用的候选蛋白,为进一步研究Foxp3△2功能奠定了基础。     

Klotho:与FPC蛋白相互作用的蛋白质分子

目的:利用酵母双杂交技术筛选与纤囊素相互作用的蛋白质,为进一步探讨纤囊素(FPC)在常染色体隐性遗传多囊肾病(ARPKD)发生、发展中的作用机制提供依据。方法:利用酵母双杂交系统以质粒pG-BKT7-FPC为"诱饵",在人类胚肾cDNA文库中筛选与FPC蛋白C末端相互作用宿主蛋白的基因,再通过一对一回交试验验证两者之间的相互作用。结果:酵母双杂交筛选得到相互作用的蛋白分子Klotho(后简称KL),回交试验再次确认KL能够与FPC蛋白相互作用。结论:FPC的C末端能够与KL相互作用,它们之间的相互作用可能为研究FPC在ARPKD发病中的功能及作用机制提供新途径。     

细菌双杂交系统筛选与tumstatin45-132相互作用蛋白质

目的筛选与新生血管抑制剂肿瘤抑素功能性片段tumstatin45-132相互作用的蛋白质分子。方法构建诱饵蛋白载体pBT-tumstatin45-132,通过细菌双杂交系统筛选人肝细胞cDNA文库;克隆表达MBP-tumstatin45-132及候选蛋白His-MMP-2,利用MBP pull-down assay和蛋白质印迹方法验证pBT-tumstatin45-132与候选蛋白MMP-2间的相互作用。结果pBT-tumstatin45-132无自身转录激活活性,筛选人肝细胞cDNA文库,获得25个双阳性克隆,序列分析和同源检索表明所获其中之一候选蛋白为基质金属蛋白酶MMP-2;MBP pull-down assay和蛋白质印迹方法验证了pBT-tumstatin45-132与候选蛋白MMP-2间确实存在相互作用。结论　这些结果为进一步研究tumstatin45-132新的功能和机制创造了条件。     

应用酵母双杂交系统筛选人胃黏膜上皮组织SHIP2的相互作用蛋白

目的通过酵母双杂交系统筛选人胃黏膜上皮组织标准均一化cDNA文库,寻找与含Src同源蛋白2肌醇-5-磷酸酶2(SHIP2)相互作用的蛋白。方法利用酵母双杂交系统,以SHIP2的P1(SH2+5-Ptase)和P2(PRD+SAM)段作为诱饵蛋白,筛选出人胃黏膜上皮组织均一化cDNA文库中与SHIP2相互作用的蛋白,并通过免疫共沉淀法进行验证。结果挑选出39个阳性克隆,经测序比对分析,回复性杂交,免疫共沉淀试验验证,最终确定一个与SHIP2相互作用的蛋白抗增殖蛋白1(prohibitin1/PHB)。结论酵母双杂交系统筛选人胃黏膜上皮组织SHIP2的相互作用蛋白PHB。     

NF-κB p50亚基同源结构域相互作用多肽的筛选

目的：应用酵母双杂交技术筛选获得与核因子κB（NF-κB）p50亚基同源结构域（RHD）相互作用的多肽。方法：应用酵母双杂交技术，以NF—κBp 50 RHD为诱饵，筛选16肽cDNA文库，寻找与其相互作用的多肽，应用β-gal试验、酵母交配试验及一对-酵母回复性杂交等方法筛除假阳性克隆，确定阳性克隆。结果：经酵母双杂交及反复的排查，共获得8个阳性克隆。通过GenBank进行检索，未发现与之相匹配的蛋白序列。结论：获得8个与NF-κB p50 RHD相互作用的新型多肽，多肽的功能需进一步验证。     

小鼠脑14-3-3蛋白ζ亚型cDNA克隆及其原核表达分析

14-3-3是一类脑中丰富存在的蛋白质。在许多神经疾病患者的脑脊液中含量升高。最近的研究显示该蛋白相关于Parkinson病的病理过程。本研究采用RT-PCR法从小鼠脑中分离出编码14-3-3ζ亚型的cDNA片段,构建了基因重组质粒,分析了14-3-3ζ亚型cDNA在原核细胞中的表达并制备了基因重组蛋白。结果显示,RT-PCR扩增产物为738bp,编码245个氨基酸。重组质粒在原核细胞中的表达受IPTG诱导呈时间依赖性递增。纯化的目的蛋白在SDS-PAGE中的表观分子量为32kD,在Su-perdexS-200HR中的表观分子量为96kD。每升菌液可收获目的蛋白4.0mg。研究结果提示,14-3-3ζ亚型cDNA在原核细胞中高水平表达,基因重组蛋白易纯化可用于制备抗体和研究其生理功能。     

甲型H3N2流感病毒截短型PB1-F2蛋白与宿主蛋白的相互作用的初步研究

目的利用酵母双杂交技术研究甲型H3N2流感病毒截短型PB1-F2蛋白与人类宿主蛋白的相互作用,为该病毒蛋白的功能研究和致病机制提供理论依据。方法以本实验室分离和鉴定的甲型H3N2流感病毒A／Guangdong／7028／2010为模版,构建pGBKT7-PB1-F2重组载体,利用Y2HGold酵母双杂交系统,从人类通用cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白。结果成功构建含诱饵蛋白基因的pGBKT7-PB1-F2重组载体,转化酵母自激活和毒性实验显示为阴性：酵母双杂交实验显示Y2HGold和Y187酵母的结合率为5．22％,符合实验要求;经筛选和验证后,得到3个与截短型PB1-F2蛋白有相互作用的阳性克隆,分别为钾／钠ATP酶B1亚基、热休克蛋白40和白介素-2受体1亚基。结论初步推断截短型H3N2流感病毒PB1-F2蛋白可能影响流感病毒在宿主细胞中的复制功能和凋亡调控。     

ATPase 抑制因子1是与HCMV pUL23蛋白相作用的宿主蛋白分子-酵母双杂交技术筛选与鉴定

目的： 利用酵母双杂交技术筛选与人巨细胞病毒相互作用的宿主蛋白分子,为探讨人巨细胞病毒pUL23蛋白在HCMV生活周期中的作用机制提供依据。方法: 利用GAL4酵母双杂交系统筛选人胚肾cDNA文库,以获得与人巨细胞病毒pUL23蛋白相互作用的宿主蛋白分子,再通过回交试验和体外GST-pulldown试验验证两者之间的相互作用。结果: 酵母双杂交筛选得到宿主蛋白分子ATPase inhibitory factor 1（ATIF1）,回交试验和体外GST-pulldown试验再次确认ATIF1能够与人巨细胞病毒pUL23蛋白相互作用。结论: pUL23确实能够与ATIF1相互作用,它们之间的相互作用可能为研究pUL23在病毒生活周期发挥的功能提供依据。     

人PIRH2b与ARF4相互作用的初步研究

目的利用酵母双杂交技术筛选PIRH2b的相互作用蛋白。方法以PIRH2b为诱饵蛋白,利用酵母双杂交技术筛选人胎肝cDNA文库,用GST-pull down验证PIRH2b与ARF4在体外的相互作用,并用绿色荧光蛋白标记PIRH2b,红色荧光蛋白标记ARF4,观察两者在肝癌细胞株Hep3B中的亚细胞定位。结果利用酵母双杂交筛选到一个能与PIRH2b相互作用的蛋白ARF4,GST-pull down验证了两者在体外的相互作用,荧光标记共定位结果显示两个蛋白共定位于Hep3B细胞的核周区域。结论首次发现并证实了PIRH2b与ARF4的相互作用,PIRH2b对ARF4的功能可能有重要影响。     

18日龄日本血吸虫酵母双杂交cDNA文库的构建

为揭示血吸虫生长发育机理,深入研究血吸虫与宿主、血吸虫雌雄虫之间蛋白质的相互关系,本研究选取血吸虫进入终末宿主体内18天时的虫体(发育成熟初期),采用Clontech Matchmaker技术成功构建日本血吸虫的酵母双杂交cDNA文库.该文库具有基因多样性和足够大的库容量,库容量为2.5×106 pfu/mL,插入的双链cDNA片段的长度在0.25～2.0 kb之间,文库重组比率为97.9%,具有良好的代表性.该文库的构建为筛选相互作用蛋白并进一步阐明其生理意义提供了基础.     

14-3-3ζ蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

为了探讨14-3-3ζ蛋白在中枢神经系统内的分布,本文采用纯化的基因重组型14-3-3ζ蛋白免疫Balb/c小鼠,用杂交瘤技术制备抗14-3-3ζ蛋白单克隆抗体;Western blot及免疫组织化学法鉴定抗体。结果显示:制备的单克隆抗体能特异性识别基因重组14-3-3ζ蛋白和大鼠脑匀浆32kD蛋白。免疫组化染色结果显示,14-3-3ζ蛋白在大鼠中枢神经系统广泛分布,在皮层、海马、杏仁核和基底前脑的免疫阳性染色较强,免疫阳性产物位于神经元胞浆内。本研究结果提示,14-3-3ζ蛋白可能具有多样化的生理功能。     

原癌基因LMO3相互作用蛋白的筛选及鉴定

目的 通过筛选LMO3的相互作用蛋白,进一步了解LMO3的作用及可能机制.方法:酵母双杂交方法 筛选LMO3相互作用蛋白,并通过酵母结合试验、免疫共沉淀及荧光共定位等进行验证.结果:在初步获得相互作用蛋白CIB的基础上,在酵母中证实了LMO3与CIB的相互作用,并通过酵母结合试验确定了CIB与LMO3的相互作用位点,发...     

人肝再生增强因子相互作用蛋白基因的克隆

目的：寻找与人肝再生增强因子(hALR)相互作用的蛋白质．探讨其在肝再生过程中的分子生物学机制。方法：采用酵母双杂交系统，以hALR作诱饵蛋白筛选预转化的人肝cDNA文库，对阳性克隆进行生物信息学分析。结果：筛选出6组与hALR具有特异性相互作用的蛋白基因，分别是：血清白蛋白、金属硫蛋白、Na／K-ATPase、硒蛋白P和两个未知功能基因的cDNA序列。结论：初步克隆了与hALR相互作用蛋白基因，为以后深入研究这些蛋白质与hALR之间的相互作用，进一步揭示hALR的作用机制奠定了基础。     

应用酵母双杂交系统筛选与乙型流感病毒BM2相互作用的蛋白质

目的　筛选与乙型流感病毒BM2蛋白相互作用的蛋白质。方法　应用酵母双杂交系统,以BM2 (2 6 10 9)插入载体pGBKT7作为诱铒,在四缺培养基上筛选人KidneyMATCHMAKERcDNA文库,寻找与BM2蛋白相互作用的宿主蛋白。结果　筛选得到6个阳性AD 文库质粒,并用酵母双杂交实验验证了阳性AD 文库质粒与BM2的相互作用。将阳性AD 文库质粒测序并对测序结果做BLAST分析,发现它们分别是N 乙酰神经氨酸酶丙酮酸裂解酶,Angiopoietin 3、锌指蛋白2 5 1、核糖体蛋白S2 0、蛋白精氨酸N 甲基转移酶1(PRMT)、转录因子样1(TCFL1)。结论　BM2能与这些转录翻译功能相关的蛋白质相互作用,表明BM2蛋白在病毒生活周期中发挥重要作用。     

筛选CD4结合蛋白的酵母双杂交饵载体构建及功能鉴定

目的构建用于筛选人CD4结合蛋白的酵母双杂交饵载体,并对其功能进行鉴定.方法RT-PCR扩增编码CD4的cDNA.构建双杂交饵载体pAS2-1-CD4,并转化入宿主酵母菌Y190中.通过测定报告基因——β-半乳糖苷酶的活性,判断饵载体自激活报告基因能力.将CD4的已知HIV配体gp120构建入猎物载体pACT2,转入重组菌Y190/pAS2-1-CD4.检测其报告基因活性,鉴定pAS2-1-CD4是否具有筛选CD4结合蛋白的能力.结果DNA序列测定证实,获得了编码CD4蛋白的cDNA序列.β-半乳糖苷酶活性测定表明,pAS2-1-CD4单独无自激活能力,与猎物载体pACT2-gp120能够发生相互作用,激活报告基因表达.结论构建了酵母双杂交饵载体pAS2-1-CD4,为筛选CD4结合蛋白（尤其是筛选病毒编码的CD4配体）,提供了技术平台.