生物素化质粒rep20探针检测恶性疟原虫感染的研究

Bio—ll—dUTP经切口平移法标记于质粒rep20,自身杂交敏感度为100pg。检出云南株Pf(恶性疟原虫)培养血和病人血样中pf密度低限分别为1/10~5和1/10~4(虫/红细胞),病人血样中最低pf检出数为12000个。检测30份云南省恶性疟患者血样,28份阳性;检测20份云南省和海南省问日疟患者血样、29份正常人血样均为阴性;与三种动物疟原虫及人白细胞的DNA未出现杂交反应。表明质粒rep20对云南株pf具有高度同源性和特异性,该生物素化探针检测Pf具较高敏感性。     

恶性疟原虫特异的质粒型DNA探针的制备

恶性疟原虫 DNA 与 pBR_(322)质粒 DNA 体外重组后,导入 E.coli HB_(101)建成基因文库,用疟原虫全基因组 DNA 从文库中筛出了5个杂交信号特强的克隆 pBF_1,pBF_2,pBF_3,pBF_4和 pBF_5。克隆 pBF_4 DNA与 P.c DNA,P.b DNA,及人白细胞 DNA 均无交叉反应,与 P.f DNA 杂交时,可检出的最低 DNA 量为10pg。     

恶性疟原虫DNA探针检测血内恶性疟原虫的初步研究

从培养恶性疟原虫(Fcc-1)中分离纯化基因组DNA,用~(32)P标记,作为探针,按DNA斑点杂交法,检测血样。结果表明:该探针可检出9个恶性疟原虫感染红细胞/10_6红细胞;在现场应用时,与13例恶性疟阳性标本镜检符合率为92％:与1例间日疟原虫病例和正常人血、白细胞之间,未发现非特异性杂交。     

基因组、克隆重组DNA探针平行检测恶性疟原虫的初步研究

本文报告实验室制备恶性疟原虫（Ｆｃｃ－１／ＨＮ分离株）基因组ＤＮＡ．酶切冻融回收克隆重组ｐＰＦ１４ＤＮＡ，经３２Ｐ缺口移位法标记作为探针，按ＤＮＡ—ＤＮＡ斑点杂交试验平行检测Ｐ．ｆ．ＤＮＡ及血样中恶性疟原虫的初步结果．两探针检测人工培养的恶性疟原虫（Ｆｃｃ－１／ＨＮ）敏感度，基因组探针为０．０００７８％原虫血症和７．８３ｐｇ原虫ＤＮＡ，ｐＰＦ１４探针为０．００７８％和１５．６３ｐｇ。镜检确诊并复核后的５６例云南恶性疟病人血样，基因组探针检出５３例（９４．６４％），ｐＰＦ１４探针检出５１例（９１．０７％）．９例间日疟病人血样，基因组探针阳性７例，ｐＰＦ１４探针均未显示杂交．２例伯氏鼠疟、１例刚地弓形虫阳性鼠及１０例正常人血样皆为阴性．结果揭示：这两种探针似可用于我国疟疾主要流行区恶性疟原虫检测。与基因组探针相比，ｐＰＦ１４探针似是发展适合于我因恶性疟原虫大规模核酸诊断技术中，比较经济、方便的探针来源。     

聚合酶链反应检测恶性疟原虫的研究

根据编码恶性疟原虫红细胞结合抗原（ＥＢＡ－１７５）的部分ＤＮＡ片段而设计合成寡核苷酸引物并进行多聚酶链反应（ＰＣＲ）以检测体外培养的恶性疟原虫（Ｐ．ｆ．）。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见扩增出了特异的４９２ｂｐ大小的ＤＮＡ片段，而对间日疟原虫（Ｐ．ｖ．）、食蟹猴疟原虫（Ｐ．ｃ．）、约氏鼠疟原虫（Ｐ．ｙ．）、伯氏鼠疟原虫（Ｐ．ｂ．）及正常人血白细胞ＤＮＡ不能扩增出此片段。本法可检原虫密度下限为２０μｌ血中仅含１０个原虫，具有高敏感性和特异性。     

复式PCR检测恶性疟原虫与间日疟原虫的研究

目的： 建立在同一次扩增中即可鉴别患者感染的疟原虫虫种的复式ＰＣＲ检测方法。方法： 根据恶性疟原虫（Ｐ．ｆ．）中度重复基因序列ｐＢＲＫ１－１４ 和间日疟原虫（Ｐ．ｖ．）线粒体细胞色素Ｃ氧化酶基因ＣＯＩＩＩ合成引物,采用经优化的ＰＣＲ反应体系, 对疟原虫ＤＮＡ模板进行扩增。结果： Ｐ．ｆ．与Ｐ．ｖ．分别被扩增出２０６ 和３７０ ｂｐ 大小的ＤＮＡ片段,与人白细胞ＤＮＡ 无交叉;用该反应体系至少可检测出原虫血症为５×１０－ ７的Ｐ．ｆ．感染和１．０２×１０－ ６ Ｐ．ｖ．感染; 自云南疟疾流行区采集的７８３份滤纸干血滴样本中, 复式ＰＣＲ法阳性检出率为８５．８％ , 误诊率为０, 漏诊率为０．１％ , 而镜检法依次分别为８４．９％ 、３．１％ 和１．０％ , 两者符合率为９５．８％ 。结论： 本复式ＰＣＲ检测疟原虫较镜检敏感、特异, 适用于我国恶性疟与间日疟混合流行区的疟疾诊断、流行病学调查、药物的疗效考核和献血员的筛选等。     

聚合酶链反应检测恶性疟原虫的研究

通过５ 对根据恶性疟原虫不同基因序列设计的引物筛选及７ 种从滤纸干血滴中快速制备疟原虫ＤＮＡ模板的方法的比较,以建立一种敏感、特异、简便、快速的聚合酶链反应（ＰＣＲ） 检测恶性疟原虫的方法。结果表明,根据恶性疟原虫中度重复基因序列ｐＢＲＫ１１４ 设计的引物,可从恶性疟原虫ＤＮＡ 中扩增出２０６ ｂｐ 大小的ＤＮＡ片段,而间日疟原虫、人白细胞ＤＮＡ均无此扩增带出现,并至少可检测出原虫血症为５ ×１０－ ７ 的感染水平,且适用于我国不同地理株恶性疟原虫的检测;滤纸干血滴样本经生理盐水溶血煮沸法处理的ＰＣＲ 扩增效果最为理想,且简易、经济、重复性好;在云南疟疾流行区采集的３６０ 份血样中,ＰＣＲ 法与镜检法符合率为９７ ．５％ 。本研究建立的ＰＣＲ 检测恶性疟原虫方法具有敏感、特异、简易和快速的特点,便于现场推广应用。     

重组质粒DNA探针用于间日疟诊断的研究

用~(32)P标记含间日疟原虫DNA片段的重组质粒pVA1作为探针,通过DNA打点杂交试验检测红内期间日疟原虫。该探针检测间日疟原虫基因组DNA的敏感度达1ng;与现场采集的25份间日疟患者血样(原虫血症为0.003％～0.7％)的杂交阳性率为72％,与6例恶性疟和3例食蟹猴疟血样中各1例杂交阳性;与3例约氏疟和6例正常人血样均为阴性。     

（Dig）—DNA探针检测恶性疟病人的研究

采用异羟基洋地黄毒苷配基(Digoxigenin,(Dig)-11-dUTP),以随机引物法标记含有恶性疟原虫(P.f.)DNA的重组质粒片段(酶切克隆pPF14),制成pPF14-F-Dig探针。用此探针,以斑点杂交试验检测提纯的P.f.DNA及海南地区疟疾病人。结果显示,pPF14-F-Dig探针至少可检出40pg的P.f.DNA和低至0.005％原虫血症。38例P.f.病人中,检出阳性33例。3例恶性疟原虫和间日疟原虫混合感染者中,2例阳性。4例间日疟病人中,阴性3例,可疑1例。21例正常人血皆为阴性。     

PCR结合非放射性标记DNA探针技术用于班氏微丝蚴检测的研究

本研究根据班氏丝虫ＩＷｂ３５重复序列，用聚合酶链反应扩增、回收班氏丝虫特异性片段（６５６ｂｐ），以异羟基洋地黄毒苷配基（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ，Ｄｉｇ）标记该片段，制备非放射性ＤＮＡ探针，并把ＰＣＲ和Ｄｉｇ标记ＤＮＡ探针杂交检测方法结合起来，用于检测安徽班氏丝虫病流行区病人血样中的微丝蚴。结果表明，该探针与马来丝虫ＤＮＡ及人白细胞ＤＮＡ不发生杂交反应，仅与班氏微丝蚴ＤＮＡ发生杂交反应，可检出０．５ｐｇ同源ＤＮＡ。微丝蚴血样经ＰＣＲ扩增后与探针进行斑点杂交试验，能检出６０μｌ血样中１条微丝蚴，３１例流行区班氏微丝蚴阳性患者，检出阳性３０例，３２例流行区“正常人”检出阳性２例，３２例非流行区正常人均阴性。     

人生长激素受体DNA探针建立及mRNA检测

用多聚酶链反应方法建立了人生长激素受体（ｈＧＨＲ）ＤＮＡ探针。探针片段长度为６７０ｂＰ，两端分别为ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切末端。克隆在ＰＴＺ１９Ｕ质粒上。用此探针检测成人外周静脉血和脐血淋巴细胞的ｈＧＨＲｍＲＮＡ的表达水平，表明成人ｈＧＨＲ基因转录水平显著高于新生儿。     

应用DNA探针检测蚊体内疟原虫的研究

本文用生物素标记的克隆ＤＮＡ探针，以斑点杂交法检测蚊体内恶性疟原虫。将一组蚊虫在还原性缓冲液中研磨后集体检测时，在２５只蚊中有１只感染蚊即可检出，亦可将单个蚊虫直接压在硝酸纤维素膜上进行检测。本技术的高特异性、敏感性以及试剂的稳定性等表明，它可作为一个适用的流行病学调查工具。     

恶性疟原虫Pf12基因在大肠杆菌中的表达及其产物的初步鉴定

目的　克隆并表达恶性疟原虫Pf12基因 ,为进一步研究其抗原表位奠定基础。　方法　将恶性疟原虫Pf12基因克隆入高效融合表达载体 pGEX 4T 1,转化大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ,2 8℃、IPTG诱导表达 ,SDS PAGE和Western blot免疫印迹分析表达产物。　结果　成功构建重组质粒 pGEX Pf12 ,经诱导后表达出含外源基因的融合蛋白 ,SDS PAGE分析表达产物分子质量约 66ku ,Western blot免疫印迹表明 ,表达的产物能特异地被抗GST多抗 (1∶5 0 0稀释 )识别 ,亦能较特异地与抗疟原虫鼠免疫血清结合。　结论　恶性疟原虫Pf12在原核表达系统 pGEX 4T 1/BL2 1(DE3 )中获得成功表达 ,为下一步表达蛋白纯化 ,以及研究Pf12基因包含的抗原表位提供试验依据。     

套式PCR和DNA探针技术检测Q热立克次体

目的 建立套式PCR（NPCR）和DNA探针技术用于检测Q热立克次体。方法 依据已知的Cb 23s rRNA基因序列,设计两对引物用于建立套式PCR技术,并将扩增片段制成探针进行斑点杂交。结果 9株Cb分离株均可扩增出阳性产物带,而对照菌均为阴性,扩增灵敏度可达0.1pg Cb DNA,实验感染第6天的豚鼠血、小鼠血、小鼠脾脏均可扩增出阳性带;用七医株扩增片段制成的探针与9株Cb分离株的全DNA呈阳性杂交,对照菌为阴性,探针杂交灵敏度为0.5ng Cb DNA,感染的豚鼠血、小鼠血、小鼠脾脏均可呈阳性反应。结论 我们的NPCR和DNA探针技术具有很好的特异性和灵敏度,可将二者联合用于Q热的病原学诊断。     

恶性疟原虫重组质粒DNA接种诱导BALB/c小鼠的免疫应答

目的：观察重组质粒DNA直接免疫接种诱导BALB／c小鼠的免疫应答水平，为恶性疟原虫DNA疫苗在动物和人体的应用提供依据。方法：构建编码多价保护性抗原的重组质粒pcDNA3－Pf8，PCR法检测免疫鼠的肌肉、肝脏、肾脏、心脏、脾脏和肺组织中pcDNA3－Pf 8，ELISA、T淋巴细胞转化试验、体外抑制试验观察其诱导的体液免疫及细胞免疫水平。结果：用PCR法从上述组织中均检测到pcDNA3－Pf8，ELISA法测得免疫鼠血清的特异性抗体滴度达12560，淋巴细胞转化试验显示恶性疟原虫可溶性抗原能特异性地剌激免疫鼠脾细胞增殖，免疫血清在体外还能抑制恶性疟红内期疟原虫的生长、发育。结论：编码恶性疟原虫多价保护性抗原的重组质粒pcDNA 3-Pf 8 直接免疫接种, 能特异性地剌激BALB/c 小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答, 其免疫血清在体外对疟原虫生长发育具有明显抑制作用。     

用聚苯乙稀胶乳吸附鼠疫F1抗原检查鼠疫抗体试验的初步研究

用聚苯乙烯胶乳吸附鼠疫菌FI抗原检查鼠疫抗体,具有特异性强、快速、操作方法简单等特点,适用于野外对鼠疫大面积的检测工作。