人牙周膜干细胞成骨相诱导后相关基因的表达变化

目的:对人牙周膜干细胞进行筛选纯化,骨向诱导后观察其成骨能力,并对成骨相分化过程中相关基因的表达变化进行检测。方法:用组织块联合磁珠分选法分离纯化人牙周膜干细胞,初步探讨其成骨性能,碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色观察其成骨情况,实时定量PCR检测其相关成骨基因的表达变化。利用SPSS12.0软件包对数据进行统计学分析。结果:组织块联合磁珠分选法能成功培养出高纯度的人牙周膜干细胞。体外培养中,PDLSCs具备成脂和成骨的双相分化能力。在成骨诱导过程中,FOXO1和RUNX2的表达先升高再降低,ALP和OCN的基因表达水平持续增高。结论:成骨相关基因 ALP、RUNX2、FOXO1和OCN均参与其向成骨样组织分化的过程,其表达变化具有时间规律性,与成骨过程类似。     

细胞外信号调节激酶1/2信号转导通路调控牙周膜细胞成骨分化的研究

目的：探索细胞外信号调节激酶（ERK）1/2信号转导通路是否参与调控牙周膜细胞的成骨分化。方法???取体外培养的第3代牙周膜细胞进行研究。实验分为空白对照组、成骨诱导组和实验组（在成骨诱导培养基中加入10?nmol·L－1?ERK1/2磷酸化的抑制剂PD98059）。培养1周和3周后通过定量聚合酶链反应（qPCR）、碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红染色检测其成骨能力。结果?成骨诱导可促进牙周膜细胞中ERK1/2的磷酸化。培养1周后,抑制ERK1/2的磷酸化可上调成骨标志物Runx2、ALP和骨钙蛋白（OCN）的表达,与成骨诱导组相比较,OCN的表达差异具有统计学意义（P<0.05）,Runx2、ALP的表达差异也具有统计学意义（P<0.01）。培养3周后,实验组牙周膜细胞成骨标志物Runx2、ALP和OCN的表达仍较成骨诱导组高,ALP染色和钙结节形成较成骨诱导组强,其中Runx2、ALP的表达差异具有统计学意义（P<0.05）,OCN的表达差异也具有统计学意义（P<0.01）。结论 ERK?1/2信号转导通路参与了调控体外培养的牙周膜细胞的成骨分化。     

过表达ADAM10通过调控Notch信号通路对牙周膜干细胞成骨分化的影响

目的:探讨解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)调控Notch信号通路对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)成骨分化的影响.方法:体外培养hPDLSCs并对其进行成骨分化诱导,RT-PCR检测成骨诱导第0、7、14天细胞中ADAM10 mRNA表达水平.采用ADAM10过表达慢病毒感染hPDLSCs,并将细胞分为空白对照组、空载组和ADAM10过表达组,分别采用RT-PCR和Western blot检测感染后hPDLSCs中ADAM10 mRNA和蛋白表达水平,CCK-8检测各组细胞增值情况.感染的hPDLSCs经成骨诱导分化后,茜素红染色观察各组细胞矿化结节生成情况,RT-PCR检测各组细胞中成骨相关基因ALP、Runx2、OCN以及Notch信号通路相关基因Notch1、NICD、Hes1的mRNA表达水平,Western blot检测Notch信号通路相关蛋白Notch1、NICD和Hes1的蛋白表达水平.结果:hPDLSCs成骨诱导分化的第0、7、14天过程中,ADAM10 mRNA表达水平逐渐降低(P<0.05).感染ADAM10过表达慢病毒后,hPDLSCs中ADAM10 mRNA和蛋白表达水平显著增加(P<0.05),同时细胞增殖能力明显增强(P<0.05).成骨诱导分化后,与对照组和空载组比较,ADAM10过表达组矿化结节形成量、成骨相关基因ALP、Runx2、OCN的mRNA表达水平以及Notch信号通路相关基因Notch1、NICD、Hes1的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05).结论:过表达ADAM10可促进hPDLSCs增殖并抑制其成骨分化,其机制可能与Notch信号通路的激活有关.     

p38信号通路在牙周膜细胞成骨分化中的调控作用

目的 研究p38信号通路在人牙周膜细胞成骨分化中的调控作用。 方法 体外培养人牙周膜细胞,取第三代细胞进行成骨诱导培养,实验组加入p38信号通路抑制剂(SB203580),诱导培养4周后通过定量PCR和茜素红染色检测其成骨能力。 结果 成骨诱导可促进牙周膜细胞中p38的磷酸化（p-p38）。抑制p38的磷酸化可降低成骨标记物Runx相关基因（Runx2）、碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OPN）和骨钙素（OCN）的表达,减少钙结节形成。 结论 p38信号通路在体外培养的牙周膜细胞成骨分化中具有重要的调控作用。     

低氧对人牙周膜细胞骨向分化能力的影响

目的 研究低氧对人牙周膜细胞（PDLC）的碱性磷酸酶（ALP）活性及成骨相关基因表达的影响.方法 采用组织块法体外分离培养人PDLC;取第3 ～ 5 代细胞分别在常氧和低氧条件下培养后检测其ALP 活性;并通过荧光定量聚合酶链反应（PCR）观察低氧处理后人PDLC 中成骨相关基因的表达变化.结果 低氧12、24、36、48 h 组ALP 活性均比常氧组高;其中低氧48 h 组与常氧组相比明显升高,差异有统计学意义（P ＜ 0.05）;低氧48 h 组ALP mRNA 表达比常氧组高,差异具有统计学意义（P ＜ 0.05）;4 个时间点低氧组骨钙蛋白（OCN）mRNA 表达均比常氧组高,且差异有统计学意义（12、36 h：P ＜ 0.05;24、48 h：P ＜ 0.01）.结论 低氧增强人PDLC 的ALP 活性,上调ALP mRNA 和OCN mRNA 的表达,促进人PDLC 向成骨细胞分化,同时促进成骨细胞的矿化,提示低氧环境对人PDLC 的骨向分化功能产生一定的影响.     

低强度高频振动对人牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的 研究低强度高频振动（low-magnitude high frequency vibration,LMHFV）对人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs）增殖、迁移、成骨分化能力的影响。方法 体外分离培养hPDLSCs;流式细胞术检测间充质干细胞表面标志物;加载LMHFV（加速度=0.3 g,频率=40 Hz,时间=15 min/24 h）刺激后,采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力,通过细胞划痕实验检测细胞迁移能力;通过qRT-PCR、Western免疫印迹检测成骨相关基因、蛋白表达水平,通过茜素红染色检测细胞成骨分化能力。采用SPSS 21.0软件包对数据进行统计学分析。结果 加载振动刺激后,hPDLSCs的增殖能力增强,迁移能力上升;RUNX2、ALP、Col-1、OCN的mRNA表达量和蛋白表达量均上升,茜素红染色结果与qRT-PCR、Western免疫印迹结果一致。结论 LMHFV可提高hPDLSCs的增殖、迁移能力和成骨分化能力。     

细胞外基质磷酸化糖蛋白mRNA在人牙周韧带细胞成骨分化过程中的表达

目的 检测人牙周韧带细胞(periodontal ligament stem cell,PDLC)诱导矿化过程中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)和细胞外基质磷酸化糖蛋白(matrix extracellular phosphoglycoprotein,MEPE)mRNA的表达,探讨MEPE能否作为人牙周韧带细胞的分化标记及其功能.方法 酶消化法培养PDLC并鉴定其来源,取未诱导及矿化诱导7、14和21 d的PDLC,茜素红染色检测矿化结节的形成;免疫组织化学染色检测OCN的表达;实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测ALP、OCN和MEPE mRNA的表达变化,并对结果进行方差分析.结果 PDLC矿化诱导后茜素红染色显示钙化结节形成,免疫染色OCN表达增强;PDLC成骨诱导培养前ALP、OCN和MEPE mRNA表达系数分别为72、1.1和534.随着诱导时间延长,ALP、OCN和MEPE mRNA表达上调,诱导7 d组的表达系数分别为78、9.56和629.6,诱导14 d组的表达系数分别为290、133和638.3,诱导21 d组的表达系数分别为1108、925和2261.1.与对照组相比,各诱导组OCNmRNA的表达、诱导14 d和21 d组ALP mRNA的表达,以及诱导21 d组MEPE mRNA的表达,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 在PDLC向成牙骨质或成骨样细胞分化过程中,MEPE mRNA与ALP和OCN呈现相似的表达变化趋势,提示MEPE与PDLC成骨分化有关,有可能作为PDLC向成牙骨质或成骨样细胞分化的标志.     

过表达ADAM10通过调控Notch信号通路对牙周膜干细胞成骨分化的影响

目的:探讨解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)调控Notch信号通路对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)成骨分化的影响.方法:体外培养hPDLSCs并对其进行成骨分化诱导,RT-PCR检测成骨诱导第0、7、14天细胞中ADAM10 mRNA表达水平.采用ADAM10过表达慢病毒感染hPDLSCs,并将细胞分为空白对照组、空载组和ADAM10过表达组,分别采用RT-PCR和Western blot检测感染后hPDLSCs中ADAM10 mRNA和蛋白表达水平,CCK-8检测各组细胞增值情况.感染的hPDLSCs经成骨诱导分化后,茜素红染色观察各组细胞矿化结节生成情况,RT-PCR检测各组细胞中成骨相关基因ALP、Runx2、OCN以及Notch信号通路相关基因Notch1、NICD、Hes1的mRNA表达水平,Western blot检测Notch信号通路相关蛋白Notch1、NICD和Hes1的蛋白表达水平.结果:hPDLSCs成骨诱导分化的第0、7、14天过程中,ADAM10 mRNA表达水平逐渐降低(P<0.05).感染ADAM10过表达慢病毒后,hPDLSCs中ADAM10 mRNA和蛋白表达水平显著增加(P<0.05),同时细胞增殖能力明显增强(P<0.05).成骨诱导分化后,与对照组和空载组比较,ADAM10过表达组矿化结节形成量、成骨相关基因ALP、Runx2、OCN的mRNA表达水平以及Notch信号通路相关基因Notch1、NICD、Hes1的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05).结论:过表达ADAM10可促进hPDLSCs增殖并抑制其成骨分化,其机制可能与Notch信号通路的激活有关.     

P2X7受体在人牙周膜干细胞成骨分化中的作用

目的：探讨P2X7受体（P2X7 receptor,P2X7r）在人牙周膜干细胞成骨分化中的作用。方法：选取就诊于贵州中医药大学第一附属医院的健康青年患者因正畸需要而拔除的前磨牙为实验材料,分离、培养人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs）。取第4代hPDLSCs,分为A、B、C、D 4组,A组用常规培养液培养,B组用成骨诱导液培养,C组用成骨诱导液+100 nmol/L三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）溶液培养,D组用成骨诱导液+100 nmol/L P2X7受体特异性拮抗剂KN-62培养。7 d后,采用茜素红染色观察各组hPDLSCs成骨效果,采用实时荧光定量反转录PCR（RT-PCR）检测各组hPDLSCs成骨相关因子骨钙素（osteocalcin,OCN）、RUNX2 mRNA的表达量,采用RT-PCR检测各组hPDLSCs中P2X7r mRNA表达。采用SPSS 22.0软件包对结果进行统计学分析。结果：茜素红染色结果显示,B组和C组hPDLSCs细胞形态发生显著变化,逐渐由不规则形变为方形,出现灰白色钙化小结节。结节多呈板层状圆形或椭圆形团块,C组灰白色钙化小结节显著多于B组,而A组和D组钙结节量均很少。B、C组hPDLSCs中OCN、RUNX2、P2X7r mRNA表达量显著高于A组（P<0.05）,C组hPDLSCs中OCN、RUNX2、P2X7r mRNA表达量显著高于B组（P<0.05）,D组hPDLSCs中OCN、RUNX2、P2X7r mRNA表达量显著低于B、C组（P<0.05）,D组hPDLSCs中OCN、RUNX2、P2X7r mRNA表达量与A组相比,差异无统计学意义（P>0.05）。结论： P2X7受体在人牙周膜干细胞成骨分化中发挥正调节作用。P2X7受体被ATP激活后,可促进人牙周膜干细胞成骨分化,这为临床上治疗牙周炎提供了新的方向。     

牙周膜干细胞向成骨细胞方向分化实验

目的:探讨人牙周膜干细胞(Periodontalligament stem cell,PDLSCs)向成骨细胞定向分化潜能,从细胞、分子和基因水平分析矿化诱导过程中细胞形态、功能变化。方法:将免疫磁珠分离的人PDLSCs矿化诱导,通过倒置显微镜观察诱导细胞形态变化,ELISA法检测诱导细胞碱性磷酸酶活性(ALPase)、RT-PCR、Western blot及免疫化学染色分析其成骨相关基因、蛋白表达变化,茜素红染色法检测其矿化结节形成情况来诱导细胞做对照。结果:矿化诱导14d,细胞形态呈成骨样短突起、多角形改变,诱导7d、14d ALPase活性显著增强。21d,诱导细胞高丰度表达骨桥素(OPN)、骨钙素(OCN)、牙骨质附着蛋白(CAP)及I型胶原(COLⅠ)mRNA,而对照组只有COLⅠmRNA弱表达。同时,Western blot及免疫化学染色均显示诱导细胞分泌骨涎蛋白(BSP)。21d,仅诱导组形成大量矿化结节。结论:人PDLSCs在矿化液诱导下可向成骨细胞分化,具有成骨细胞的形态、表型和功能特点,有望成为牙周及种植体周围骨缺损修复再生的理想的种子细胞。     

人牙周膜干细胞成骨分化过程中P2X7受体mRNA的表达特点及作用研究

目的：探讨P2X7受体在人牙周膜干细胞成骨分化中的作用。方法：将原代培养获得的人牙周膜干细胞分为对照组、三磷酸腺苷组、成骨诱导液组和三磷酸腺苷+成骨诱导液组,比较4组的成骨分化相关基因RUNX2、OCN基因表达和P2X7受体mRNA表达的差异,采用SPSS 16.0软件包进行统计学分析。结果：成骨后1周和2周,三磷酸腺苷+成骨诱导液组的RUNX2和OCN mRNA表达显著高于成骨诱导液组（P<0.05）。三磷酸腺苷+成骨诱导液组成骨后1周的RUNX2和OCN mRNA表达显著高于成骨后2周（P<0.05）。成骨后1周和2周,三磷酸腺苷组和三磷酸腺苷+成骨诱导液组的P2X7受体mRNA表达均显著高于对照组和成骨诱导液组（P<0.05）;成骨后2周,三磷酸腺苷组的P2X7受体mRNA表达显著高于三磷酸腺苷+成骨诱导液组（P<0.05）;三磷酸腺苷组成骨后1周的P2X7受体mRNA表达显著高于成骨后2周（P<0.05）。结论：P2X7 受体明显提高牙周膜干细胞的成骨效果,三磷酸腺苷可激活P2X7 受体的表达。     

细胞骨架及相关蛋白在人牙周韧带细胞成骨分化过程中的表达模式

目的探讨人牙周韧带细胞（PDLCs）成骨分化过程中细胞骨架及相关蛋白的表达模式及其可能的功能作用。方法酶消化法培养PDLCs．免疫细胞化学染色检测vimentin的表达：取诱导前（对照组）及矿化诱导7、14和21d的PDLCs。实时荧光定量RT—PCR检测vimentin、actin、caldeSIllon（CaD）、tropomyosin（Tm）和annexin A4 mRNA的表达变化并进行统计分析，Western blot检测蛋白表达。结果PDLCs表达丰富的vimentin：Vimentin、actin、CaD和Tm mRNA的表达在诱导7d组下调．诱导14d组和21d组逐渐上调：Annexin A4 mRNA的表达在诱导7d组表现为上调，诱导14d组和21d组逐渐下调：Vimentin的mRNA表达在各组间差异均有统计学意义（P〈0．05）：CaD和Tm在诱导7d组与14d组之间的mRNA表达差异无统计学意义（P〉0．05），其余各组间差异均有统计学意义（P〈0．05）：Actin和annexin A4在对照组与诱导21d组之间的mRNA表达差异无统计学意义（P〉0．05）．其余各组间差异均有统计学意义（P〈0．05）；Western blot检测蛋白表达显示类似的表达趋势。结论在PDLCs成骨分化过程中．一组细胞骨架及细胞骨架蛋白相关蛋白呈现相似的表达变化．提示其参与调节PDLCs成骨分化。     

炎症微环境下芦丁对牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的 研究芦丁（rutin）对炎症微环境下牙周膜干细胞成骨分化能力的影响。方法 采用有限稀释法分离纯化获得牙周膜干细胞,采用流式细胞术鉴定牙周膜干细胞。以脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激牙周膜干细胞,建立体外炎症模型。实验分为4组,第1组使用α-MEM培养基培养牙周膜干细胞,第2组使用含有脂多糖的α-MEM培养基培养牙周膜干细胞,第3组在含有脂多糖的α-MEM培养基加入芦丁培养牙周膜干细胞,第4组使用含有芦丁的α-MEM培养基培养牙周膜干细胞。通过碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性测试、茜素红染色、RT-PCR以及蛋白免疫印迹等方法检测成骨分化能力的改变。采用SPSS 17.0软件包对数据进行统计分析。结果 CCK-8和碱性磷酸酶活性测试结果显示,10 μmol/L芦丁对炎症状态下牙周干细胞增殖和成骨分化作用最明显。碱性磷酸酶染色和茜素红染色结果显示,10 μmol/L芦丁可以改善炎症微环境下牙周膜干细胞的成骨分化能力。RT-PCR、蛋白免疫印迹结果显示,芦丁可以增强炎症状态下COL1、ALP、RUNX2等成骨基因和成骨蛋白的表达。结论 芦丁可以增强炎症微环境下牙周膜干细胞的成骨分化能力。     

炎症微环境对人牙周膜成纤维细胞增殖与成骨分化的影响

目的: 观察脂多糖模拟的炎症微环境对体外培养的人牙周膜成纤维细胞（periodontal ligament cells, PDLCs）增殖与成骨分化的影响。方法: 体外培养鉴定人牙周膜成纤维细胞,分别用浓度为0、0.1、10 μg/mL脂多糖作用于细胞,采用MTT法观察脂多糖对PDLCs增殖的影响,运用实时定量PCR和Western印迹法检测脂多糖模拟的炎症微环境对PDLCs成骨分化的影响。采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 0.1 μg/mL脂多糖促进PDLCs增殖,增强成骨标志物mRNA和蛋白的表达;10 μg/mL脂多糖可抑制PDLCs的增殖及碱性磷酸酶、RUNX2、Ⅰ型胶原、骨形态发生蛋白2的表达,其结果有统计学意义。结论: 高浓度脂多糖（10 μg/mL）模拟的炎症微环境对PDLCs增殖及成骨分化有抑制作用,低浓度脂多糖（0.1 μg/mL）对PDLCs的增殖和成骨分化有促进作用。