基因探针没有“针”

医学上有一种诊断方法叫做基因探针检测技术,可用于诊断遗传病及其他用途。这里的基因探针是个啥样子的针呢?虽然叫基因探针,但根本没有什么“针”之类的东西。基因探针实际上是DNA(脱氧核糖核酸)双螺旋状分子结构的两条链子中,一条链子上的一小段序列,用放射性同位素(也叫核素)标记而制成的。     

一种快速诊断甲型H1N1流感病毒的悬浮芯片方法

目的建立一种可快速诊断甲型H1N1流感病毒的悬浮芯片方法,为研制快速检测H1N1流感病毒试剂盒奠定基础。方法针对HIN1特有的NA基因、HA基因、NS基因序列设计引物,在下游引物末端用生物素标记。根据3个基因扩增区内的核酸序列设计特异性探针,探针末端修饰氨基C12,以便把特异性的核酸探针共价结合到用彩色荧光编码的微球表面。采用液态悬浮杂交方法,将微球与生物素标记的目标物进行杂交,通过结合的链霉亲和素藻红蛋白,检测目标物。结果所设计的探针没有交叉反应,单通道检测探针灵敏度HA基因为1.6 nmol/L,NA基因、NS基因均为8.0 nmol/L;多通道检测的探针灵敏度为1.6 nmol/L。结论该方法准确、灵敏度高,可以用于下一步悬浮芯片检测试剂盒的研制。     

A METHOD FOR RAPID DIAGNOSIS OF A(H1N1) INFLUENZA VIRUS BY USING SUSPENSION CHIP

目的 建立一种可快速诊断甲型H1N1流感病毒的悬浮芯片方法,为研制快速检测H1N1流感病毒试剂盒奠定基础.方法 针对HIN1特有的NA基因、HA基因、NS基因序列设计引物,在下游引物末端用生物素标记.根据3个基因扩增区内的核酸序列设计特异性探针,探针末端修饰氨基C12,以便把特异性的核酸探针共价结合到用彩色荧光编码的微球表面.采用液态悬浮杂交方法,将微球与生物素标记的目标物进行杂交,通过结合的链霉亲和素藻红蛋白,检测目标物.结果 所设计的探针没有交叉反应,单通道检测探针灵敏度HA基因为1.6 nmol/L,NA基因、NS基因均为8.0 nmol/L;多通道检测的探针灵敏度为1.6 nmoL/L.结论 该方法准确、灵敏度高,可以用于下一步悬浮芯片检测试剂盒的研制.     

核酸探针技术研究进展

核酸探针技术也称基因诊断或基因探针技术。它不仅是研究核酸结构与功能的重要手段,还为传染病的诊断、流行病调查、食品卫生检验及肿瘤和遗传病的早期诊断等打开了一个新的突破口。1 探针标记 在核酸杂交分析中,制备特异、灵敏的标记探针是该技术成功关键。放射性同位素标     

荧光探针定量聚合酶链反应检测结核分支杆菌比较研究

关于结核病的实验室诊断,近年来报道了一些新的快速诊断方法:如荧光探针定量聚合酶链反应,连接酶链反应,基因探针扩增检测结核分支杆菌复合物等新技术方法,提高了结核分支杆菌(MTB)的检出率.     

TaqMan-MGB探针法快速检测脑膜炎奈瑟菌的研究

目的建立TaqMan-MGB探针荧光定量PCR快速检测脑膜炎奈瑟菌（Nm）方法,为流脑的诊断提供更加灵敏、特异、可标准化、自动化的检测方法;评价TaqMan-MGB探针荧光定量PCR法在健康人群带菌调查中的应用价值。方法根据Nm ctrA基因的3端保守序列设计合成引物和TaqMan-MGB探针,建立快速检测脑膜炎奈瑟菌的荧光定量PCR方法,并对反应条件进行优化。结果TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测脑膜炎奈瑟菌的灵敏度为102cfu/ml,TaqMan-MGB探针法检测900份健康人群咽拭子标本,阳性34例,检出率3.8%,高于培养法（1.2%）。结论该方法特异性强、灵敏度高,能实现脑膜炎奈瑟菌的快速检测,适用于健康带菌检查并可作为临床常规诊断方法的补充,有利于流脑的早诊断、早治疗。     

检测霍乱弧菌的基因芯片的制备

目的研制快速、特异、灵敏的检测霍乱弧菌基因芯片.方法选择霍乱弧菌特异的编码外膜蛋白的ompW基因和毒素ctxA基因,设计引物和探针,并制备检测芯片,通过2次PCR扩增,制备荧光标记的靶序列,并与芯片进行杂交,检测霍乱弧菌和非霍乱弧菌病原体.结果所有霍乱弧菌菌株在采用单一和多重PCR2种方法制备的荧光标记靶序列与芯片杂交,均在芯片相应探针处出现阳性信号,非霍乱弧菌菌株杂交结果均为阴性.结论霍乱弧菌基因检测芯片的研制,为霍乱弧菌感染的诊断提供了准确、快速、灵敏的方法,还可选择更多的基因位点设计探针以提高检测的可靠性,可以达到高通量、集成化和自动化的要求.     

实时荧光定量PCR快速检测无菌性体液革兰阳/阴性细菌感染

目的　探讨将实时荧光定量PCR（qPCR）检测细菌16S rRNA基因用于快速判断无菌性体液革兰阳/阴性细菌感染,并评价其分析性能。方法　以细菌16S rRNA基因为目标设计通用引物、通用探针及革兰阴性（GN）菌探针,对14种标准菌株、20种临床菌株、白色念珠菌、乙型肝炎病毒(HBV)、人基因组及阴性对照进行qPCR检测,评价该方法引物和探针的通用性和特异性及检测限。以104 cfu/ml菌悬液、阴性对照的循环域（Ct）值99%置信区间下限分别作为尿路、其他无菌性体液细菌感染判定的分界值。用271例临床无菌性体液标本评价qPCR法的临床效能。结果　通用探针-qPCR,所有实验菌株检测为阳性。GN探针-qPCR,所有实验革兰阴性菌株检测为阳性。通用探针的检测限为1×101～1×102 cfu/ml。GN探针的检测限可低至1.0×101 cfu/ml。判定尿路、其他无菌性体液细菌感染的分界值分别为23.76、29.37。结论　应用细菌16S rRNA基因通用探针和GN探针的qPCR方法通用性好、特异性强、检测限低,可快速检测临床无菌性体液常见细菌感染,为临床提供准确、可靠的病原学诊断依据。     

TaqMan MGB双探针实时PCR快速检测结核分枝杆菌rpoB基因多位点突变方法的建立

目的建立快速、灵敏的检测结核分枝杆菌rpoB基因常见突变位点的新方法。方法采用TaqMan小沟结合物(MGB)探针技术,检测146例活动性肺结核患者和35例非结核性肺部疾病患者痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况,测序方法为参考方法。结果146例活动性肺结核患者痰标本中,双探针方法检出阳性118例,其中rpoB基因突变56例,与测序方法比较符合率100.0%;35例非结核性肺部疾病患者痰标本双探针方法检测均为阴性,特异性100.0%;该方法最低检出下限为1×103拷贝/ml。结论TaqMan MGB双探针方法能快速、准确地检测结核分枝杆菌rpoB基因位点突变情况,适用于临床对耐药结核分枝杆菌的快速诊断。     

甲型肝炎病毒

283凌甲型肝炎病毒生物素基因探讨的研制及应用/陈勇(生物工程研究所)..·,少浙江省医学科学院学报一1994.5(2).一20~21 本文应用生物素替代放射性同位素.制备甲肝病毒生物素基因探针.并对其特异性、敏感性及应用情况作了系列研究。结果表明.生物素基因探针对病毒RN八的敏感性为102~103TexD:。z斑点.对DN八的敏感性为l~10pg.均与同位素基因探针类似。荃于此.作者认为用安全可靠的生物素基因探针代替同位素基因探针是可行的。它可以用于临床.外环境中甲肝病毒的检测、具有良好的应用前景。2835甲型肝炎病毒龙甲株结构区基因。ONA序列分析…     

2种食源性微生物胶体金银染技术的检测方法研究

目的建立一种可视化快速检测食源性微生物的新方法。方法设计与沙门菌Inva基因,大肠杆菌uid A基因5'端和3'端互补的巯基化探针和氨基化探针以及靶探针。氨基化探针连接醛基化玻片,并与提取的靶DNA或靶探针互补连接,靶DNA或靶探针另一端再与巯基化探针连接形成复合结构;利用胶体金生物亲和性好的特点,让胶体金和巯基化探针连接,银染放大信号,检测微生物。结果靶探针和靶DNA与两种探针杂交时分别选择1 mmol/L、100 nmol/L、1 nmol/L、100 pmol/L、1 pmol/L 5种浓度,并用不同靶DNA作对照;探针最低浓度为1 pmol/L,细菌靶DNA最低浓度为1 pmol/L,银染结果肉眼清晰可见。进一步验证实验结果,扩增Inva基因和uid A基因,分别得到400 kb和300 kb PCR产物,并与探针杂交银染,也得到了肉眼可见的清晰结果。结论该方法可以快速、简便的检测食源性微生物,市场前景广阔。     

应用DNA探针鉴定临床分离的念珠菌

[目的]制备念株菌DNA探针并应用于临床诊断。[方法]应用聚合酶链反应扩增白念珠菌标准株的EO3基因125bp片段,同时合成EO3的25bp特异寡核苷酸,扩增产物用半抗原地高辛标记,合成寡核苷酸用生物素标记制备成探针,检测两种探针显色敏感度,并与23株临床分离的白念珠菌、热带念珠菌,近平滑念珠菌及大肠杆菌等细菌进行斑点杂交试验。[结果]Dig-125bpDNA探针显色敏感度为0.01pg,仅与白念珠菌杂交;Bio-/25bpDNA探针显色敏感度为20pg;与白念珠菌,热带念珠菌及近平滑念珠菌杂交。[结论]Dig-/25bpDNA探针,可用于白念珠菌鉴定;Bio-25bpDNA探针,可用于念珠菌初步鉴定。     

DNA扩增制备探针并用于临床白色念珠菌感染鉴定

目的应用聚合酶链反应技术扩增特异DNA片段,并制备成为可应用于临床鉴定白色念珠菌的基因探针. 方法采用聚合酶链反应技术特异地扩增白色念珠菌标准株DNA EO3 125 bp基因片段,然后用半抗原地高辛配基标记,在完成基因探针显色敏感度检测之后,应用该基因探针分别对血液病病房分离的白色念珠菌、热带念珠菌及大肠埃希菌等多种细菌进行斑点杂交测试. 结果基因扩增制备Dig-125 bp DNA探针显色敏感度为0.01 pg,具有白色念珠菌特异性,与其他念珠菌和细菌不发生杂交. 结论基因扩增制备EO3 125 bp DNA探针方法简便可靠,具有很强特异性,可应用于临床鉴定白色念珠菌感染.     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因分子探针杂交荧光观测

目的针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因扩增片段,设计一种茎环结构的DNA分子探针,运用荧光显微镜观测DNA分子探针与mecA基因扩增产物杂交后的荧光信号。方法采用Beacon designer 7.0软件对mecA基因的特异性扩增片段设计茎环结构的DNA分子探针,应用荧光显微镜检测mecA基因扩增片段与探针杂交荧光信号。结果通过荧光显微镜观测出28株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和8株铜绿假单胞菌对照菌的特异性扩增片段,与DNA分子探针杂交后,荧光信号强度差异有统计学意义;该杂交条件优化:50℃为最佳杂交温度;10 h为最佳杂交时间。结论茎环结构DNA分子探针技术,结合荧光显微镜可高灵敏检测mecA基因的扩增片段,mecA基因是金黄色葡萄球菌耐甲氧西林的主要原因。     

应用DNA分子杂交技术检测乙型肝炎病毒DNA

近年来,由于基因工程技术发展,推动了病毒分子生物学技术的进步。DNA分子探针诊断技术是应用HBV—DNA拼接在大肠杆菌的质粒建立起无性繁殖体系,使HBV—DNA能得到大量复制,并能获得纯系的DNA分子供标记探针应用。由于DNA分子杂交只和同源     

荧光分光光度计液相快速观测发夹探针与katG基因463突变密码子的杂交荧光

目的针对结核分枝杆菌耐异烟肼katG基因463密码子设计发夹DNA探针,尝试运用荧光分光光度计直接观测液相中发夹DNA探针与katG基因463密码子扩增产物杂交后的荧光信号,从而检出该位点突变。方法运用软件Beacon designer设计katG基因包含463密码子的发夹DNA探针,应用荧光分光光度计检测扩增片段与探针杂交后荧光信号,同时对扩增产物测序并作比较。结果通过荧光分光光度计观测到结核标准株及耐异烟肼katG基因463密码子PCR产物与发夹DNA探针杂交后荧光信号差异有统计学意义;16株耐异烟肼组与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较,耐异烟肼组katG基因463密码子突变检出率为34%,测序法突变检出率为37%。结论应用荧光分光光度计直接观测发夹DNA探针液相杂交荧光具简单、灵敏等优特点;katG基因463密码子突变是结核分枝杆菌耐异烟肼的主要原因之一。     

视网膜母细胞瘤的基因分析

视网膜母细胞瘤是一种遗传性恶性肿瘤,应用 Rb 易感基因的 cDNA片段进行产前诊断是防止该病发生的有效途径。本文应用分子杂交技术,以两个克隆的 Rb cDNA 为探针,检测了两个 Rb 病人及其父母的 DNA,发现其中一个病人的 Rb 基因含有1kb 的缺失,为进一步开展 Rb 的产前诊断打下基础。     

16SrRNA基因探针与ctx A基因探针用于霍乱弧菌分型

以地高辛为标记物,利用ＰＣＲ方法制备１６ＳｒＲＮＡａ基因探针与ｃｔｘＡ基因探针,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,对霍乱弧菌进行分型,对广东地区分离自病人的６０株埃尔托型（ＥＶＣ）、１０株Ｏ１３９群和２株标准株进行研究,经１６ＳｒＲＮＡ基因在探针共分为４个类型（Ａ、Ｂ、Ｃ和Ｄ）,ＥＶＣ和Ｏ１３９群均以Ｄ型为优势分为４个类型（Ａ、Ｂ、Ｃ和Ｄ）,ＥＶＣ和Ｏ１３９群均以Ｄ型我隆,经ｃｔｘＡ基因探针Ｓｏｕｔｈｅｒｍ     

肠毒素大肠杆菌LTh－STIb二价基因探针的克隆及其应用研究

在肠毒素大肠杆菌（ＥＴＥＣ）ＬＴｈ－ＳＴＩａ－ＳＴＩｂ三价基因探针的基础上，用限制性内切酶ＥｃｏＲｌ酶切，回收片段．重新构建ＬＴｈ－ＳＴＩｂ二价基因探针的克隆株。用辣根过氧化物酶复合物（ＨＲＰ）直接标记二价基因探针，建立了增强型化学发光反应（ＥＣＬ）检测ＥＴＥＣ的方法．其敏感性可测到０．１ｐｇ的质粒ＤＮＡ或由１０个菌体培养而来的ＥＴＥＣ细胞，与同位素标记杂交方法的敏感性一致．且此探针仅与产ＳＴＩｂ、ＬＴｈ肠毒素的人源性ＥＴＥＣ菌株杂交，与ＳＴＩａ肠毒素菌株及其它非ＥＴＥＣ菌株均无杂交信号．该探针与三价探针及ＬＴｈ单价探针联合使用，能间接将ＬＴｈ、ＳＴＩａ和ＳＴＩｂ３种肠毒素分型。结果表明该方法简便快速、特异敏感，无放射性污染，是ＥＴＥＣ实验室诊断及分子流行病学调查的有效工具。     

膜芯片技术诊断乙型和丙型肝炎病毒与基因分型

[目的]利用膜芯片技术建立乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)联合诊断和基因分型新方法。[方法]根据HBV的前C区、X区及HCV的5'端非编码区(5'UTR)基因序列分别设计引物与分型探针。用生物素标记的引物进行HBV-DNA和HCV-cDNA扩增,将活性氨基标记的分型探针依次固定在尼龙膜上,制成HBV和HCV联合诊断和基因分型膜芯片条。扩增产物与膜芯片条杂交后,经过氧化物酶与底物显色,判断有无HBV和HCV感染并同时进行基因分型。通过经荧光定量PCR和基因测序确定的HBV和HCV单项阳性血清各30份以及HBV和HCV混合血清5份验证该方法的有效性。[结果]膜芯片对HBV和HCV单独感染和混合感染的诊断与荧光定量PCR结果相同,基因分型结果与测序分型结果一致。[结论]利用膜芯片技术可实现HBV和HCV联合诊断和基因分型,并具有准确有效和简便经济等特点,适合用于临床诊断和流行病学调查。