光学及荧光显微镜在细胞凋亡检测中的应用

为观察细胞培养中细胞凋亡的形态及数量，取４℃环境下不同时间培养的小鼠胸腺细胞，用光镜或吖啶橙（ＡＯ），溴化乙淀（ＥＢ）染色后荧光镜观察，光镜下可见凋亡小体，荧光镜下早期凋亡细胞发绿色或暗绿色荧光，伴有核结构的变化，而晚期凋亡细胞发橙红色荧光并有凋亡小体的形成。结果表明：光镜下需出现典型形态变化时凋亡才能确认，ＡＯ和ＥＢ双重荧光染色后荧光镜检在细胞凋亡检测中即可定性，又可定量。     

AO/EB双重荧光染色检测细胞凋亡的研究

目的：检测细胞培养中凋亡细胞的形态及数量。方法：取４℃环境下不同时间培养的小鼠胸腺细胞，用ＡＯ／ＥＢ染色后荧光镜观察。结果：荧光镜下早期凋亡细胞发绿色或暗绿色荧光，伴有核结构的变化，晚期凋亡细胞发橙红色荧光并伴有凋亡小体的形成。结论：ＡＯ和ＥＢ双重荧光染色后，荧光镜检在细胞凋亡检测中既可定性，又可定量。     

洛铂对人胆管癌RBE细胞凋亡显微结构及超微结构的作用观察

目的观察洛铂诱导人胆管癌RBE细胞凋亡显微结构及超微结构的变化,探讨洛铂对诱导胆管癌细胞凋亡作用.方法体外培养RBE-TCHU179人胆管癌细胞,给予不同剂量洛铂处理,瑞氏-姬姆萨染色及AO/EB染色观察细胞形态学和计数细胞凋亡百分率,扫描电镜和透射电镜观察细胞表面超微结构和细胞内超微结构的变化.结果 AO/EB荧光染色观察到洛铂作用24 h后,随洛铂剂量加大,人胆管癌RBE细胞凋亡百分率升高,25μg/mL作用凋亡细胞占47.8%.光镜和扫描电镜可见细胞形态学呈现典型的凋亡变化,可见凋亡小体的形成.透射电镜可观察到细胞核呈新月状改变.结论洛铂能引起人胆管癌RBE细胞凋亡显微结构及超微结构改变,可能与细胞凋亡和侵袭力有关.     

人参皂苷肠道代谢物诱导人肝癌BEL-7402细胞凋亡

目的探讨一种新的人参稀有皂苷20-O-(β-D-吡喃葡萄糖)-20(S)-原人参二醇皂苷(IH-901)对人肝癌BEL-7402细胞的增殖抑制效果和诱导凋亡作用。方法以0、6.25、12.5、25、50、75、100μmol/L的IH-901作用于体外培养的BEL-7402细胞,通过MTT法检测IH-901对细胞生长的抑制作用,相差显微镜观察细胞形态变化,AO/EB的荧光核染色观察凋亡细胞形态,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡。结果MTT实验显示IH-901抑制BEL-7402细胞的生长,呈时间及浓度依赖的方式;显微镜下观察到典型的凋亡形态变化和生化特征:细胞固缩,核染色质凝聚,出现凋亡小体;AO/EB的荧光核染色后,观察到典型的凋亡细胞;流式细胞仪可以检测到凋亡峰,且细胞被阻滞在G0/G1期。结论IH-901能通过诱导细胞凋亡的方式有效地抑制人肝癌BEL-7402细胞的生长,稀有人参皂苷IH-901可能成为一种潜在的抗肝癌药物。     

桦褐孔菌提取物对人胃癌BGC-823细胞株的抑制增殖及诱导凋亡作用

[目的]观察桦褐孔菌提取物对人胃癌BGC-823细胞株的抑制增殖及诱导凋亡作用.[方法]选用人胃癌细胞株BGC-823进行体外培养,用MTT法测定桦褐孔菌提取物对BGC-823细胞株的增殖抑制率,应用倒置显微镜、HE染色光学显微镜、AO/EB双染色荧光显微镜及透射电子显微镜等仪器观察桦褐孔菌提取物对肿瘤细胞形态结构的影响.[结果]10,20,40,80 mg/L桦褐孔菌提取物对胃癌BGC-823细胞株有抑制增殖作用,且表现出浓度依赖关系.HE染色在光学显微镜下可见桦褐孔菌组肿瘤细胞体积变小、变圆,核染色质浓缩或形成块,部分细胞膜形成凋亡小体;在倒置显微镜下可见桦褐孔菌组肿瘤细胞体积变小、变圆,核染色质凝集,细胞间连接疏松,贴壁能力明显减弱;在AO/EB双染色荧光显微镜下可见桦褐孔菌组肿瘤细胞胞核染色质呈橘红色,胞质内的橘红色或橘黄色荧光消失,细胞周围有呈亮绿色的荧光凋亡小体;在透射电子显微镜下可见80 mg/L桦褐孔菌提取物组肿瘤细胞核染色质固缩边集,胞质内可见有空泡,凋亡小体凸出于细胞表面.[结论]桦褐孔菌提取物可抑制人胃癌BGC-823细胞株的增殖,诱导肿瘤细胞凋亡.     

原白头翁素衍生物对人肝癌HepG-2细胞的诱导凋亡作用

[目的]观察原白头翁素衍生物对人肝癌HepG-2细胞的诱导凋亡作用.[方法]应用MTT法、HE染色及AO/EB荧光染色方法观察原白头翁素衍生物对人肝癌HepG-2细胞形态的影响.[结果]原白头翁素衍生物对人肝癌HepG-2细胞增殖抑制作用呈质量浓度依赖性和时间依赖性(P<0.05,P<0.01).倒置显微镜下见,给予原白头翁素衍生物5.0 mg/L后早期细胞出现凋亡,晚期细胞发生碎裂坏死;HE染色和AO/EB荧光染色观察见细胞出现典型凋亡形态学变化.[结论]原白头翁素衍生物对人肝癌HepG-2细胞有抑制增殖和诱导凋亡作用.     

六种染色后光镜观察法检测肝癌细胞凋亡

目的:探讨简便易行的在光镜下通过形态学观察检测细胞凋亡的方法,并对其进行比较。方法:首先用6%的乙醇作用6h诱导人肝细胞癌细胞系HCC-9204细胞凋亡,然后进行未固定细胞的台盼蓝染色、吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)双染色,细胞固定后的Hoechst33258荧光染色、May-Grunwald-Giemsa(MGG)染色和常规HE染色等形态学观察,并进行末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法检测。结果:用低浓度乙醇诱导细胞凋亡后,大部分肝癌细胞为台盼蓝拒染,TUNEL阳性着色。除了台盼蓝染色法以外,AO/EB、Hoechst33258、MGG和HE等染色法,以及TUNEL检测法均能够不同程度地显示典型的细胞变圆,细胞核深染,染色质边集、呈环状、团块或新月体状,以及细胞浆浓缩和“出泡”现象等细胞凋亡的形态学特征。AO/EB双染色法还能够显示呈致密浓染的黄绿色染色或出现黄绿色碎片的早期凋亡细胞,呈致密浓染的鲜红色染色或出现鲜红色碎片的晚期凋亡细胞,以及呈鲜红色膨大状的坏死细胞。结论:上述六种染色方法均可作为检测细胞凋亡的手段。除了台盼蓝染色以外,其余5种染色方法均可用于观察凋亡细胞的形态学变化。其中,从AO/EB双染色法还可以区分早期凋亡。晚期凋亡和坏死细胞。TUNEL法不仅能够通过检测凋亡细胞的DNA片段化来判别细胞凋亡,还可以从形态学上观察凋亡细胞。     

用光镜直接从培养细胞中检测细胞凋亡的研究

目的：观察细胞培养中凋亡细胞的形态。方法：取４℃环境下不同时间培养的小鼠胸腺细胞，与台盼蓝混合制成悬液片，用光镜观察。结果：可见凋亡细胞核形态改变及凋亡小体。结论：光镜下依据典型凋亡细胞形态变化可确认凋亡。     

白屈菜红碱对人胃癌BGC823细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用

目的观察白屈菜红碱(che lerythrine)对人胃癌BGC 823细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用。方法通过M TT实验检测白屈菜红碱对细胞生长的抑制率,AO/EB的荧光核染色观察细胞形态,DNA琼脂糖凝胶电泳及流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡。结果M TT实验显示白屈菜红碱抑制BGC 823细胞的生长呈时间、浓度依赖的方式,显微镜下观察到AO/EB的荧光核染后凋亡的细胞,琼脂糖凝胶电泳出现DNA的片段化,在白屈菜红碱质量浓度为1.5、2.0、2.5μg/mL且培养24 h时,流式细胞仪可以检测到凋亡峰,且细胞被阻滞在S和G2/M期。结论白屈菜红碱能有效地诱导BGC 823细胞凋亡,而且其诱导的凋亡具有周期依赖性。     

葵样细胞：凋亡的特征性形态改变

目的：观察雷公藤红素诱导人肥大细 胞系(HMC-1)细胞凋亡过程中细胞形态的变化,并探讨其意义。方法：在HMC-1细胞培养体系中加入雷公藤红素,用光镜、电镜观察细胞的形态变化,用TUNE L和流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡。结果：细胞在雷公藤红素作用下呈葵 样改变：细胞母体居中,周边围以形成或正在形成的凋亡小体。葵样细胞（sunflower-like cell, SLC）对锥虫蓝拒染,可伴有核染色质浓缩和着边,药物作用20 min即可形成,持续数小时后完全裂解为凋亡小体,或凋亡小体游离,残留细胞母体,最后崩溃;SLC的形成具 有时间和药物浓度依赖性;在8 h内与TUNEL标记和碘化丙啶染色/FCM检测的凋亡结果有显著 相关性;SLC清晰易辨,个体内和个体间计数重复性良好。结论：SLC 是凋亡细胞的特征性形态改变,可作为检测HMC-1细胞凋亡的定性和定量指标。     

二十碳五烯酸协同长春瑞滨对人肺癌A-549细胞的作用

[目的]探讨二十碳五烯酸(EPA)联合长春瑞滨(NVB)对人肺癌A-549细胞株的增殖、凋亡及细胞周期的影响.[方法]选用人肺癌A-549细胞株进行体外培养.应用倒置显微镜、HE染色、AnnexinⅤ-PI双染色荧光显微镜观察细胞凋亡形态学变化.应用流式细胞仪检测EPA和NVB联合作用于人肺癌A-549细胞株后细胞凋亡情况.[结果]在倒置显微镜下,用EPA处理的A-549肿瘤细胞体积变小、变圆,核染色质凝集,细胞膜起泡形成凋亡小体,细胞间连接疏松,贴壁能力减弱.HE染色:在倒置显微镜下,EPA处理组A-549肿瘤细胞体积变小、变圆,核染色质浓缩或染色质块形成,有的细胞核脱落,有的细胞膜起泡形成凋亡小体.MTT实验结果表明,EPA在15～45 mg/L范围内,于24,48,72h对肺癌A-549细胞株均有抑制生长作用且与NVB有协同作用,并表现出质量浓度、时间依赖性关系.在An-nexinⅤ-PI双染色荧光显微镜下,实验组A-549肿瘤细胞核染色质呈红色或A-549肿瘤细胞呈绿色,细胞周围可见亮绿色荧光的凋亡小体.流式细胞仪检测结果发现,EPA联合NVB组的凋亡率较单用NVB组明显增加.[结论]EPA与NVB对人肺癌A-549细胞的抑制具有协同作用,与单用NVB相比,联合应用可减少NVB的用药剂量.     

激光共聚焦显微镜观察FITC-Annexin V/PI双染色法检测人肺癌细胞凋亡

目的激光共聚焦显微镜观察FITC-Annexin V／PI双染色法检测人肺癌细胞凋亡的形态。方法对不同剂量含药血清处理的体外培养人肺癌PGLH7细胞株进行Annexin V／PI双染,激光共聚焦显徽镜观察细胞凋亡的形态特征。结果Annexin V／PI双染色法加激光共聚焦显微镜观察,经含药血清作用的人肺癌细胞ee,凋亡早期细胞呈AnnexinV高染而PI低染,细胞膜呈绿色而细胞核不着色;凋亡中、晚期细胞则AnnexinV和PI均为高染,细胞膜呈绿色而细胞核呈红色;部分细胞的核呈碎片状或梅花状,为典型的细胞凋亡形态。结论FITC—AnnexinV／PI双染色法加激光共聚焦显微镜观察凋亡细胞是目前观察凋亡的理想方法,特别适用于凋亡细胞的早期检测。     

检测Herceptin诱导乳腺癌细胞凋亡的多种显微技术比较

目的:比较多种显微技术在检测细胞凋亡中的应用.方法:以Herceptin诱导乳腺癌SKBR-3细胞凋亡,应用Gieamsa染色光镜,EB和Hoechst染色荧光显微镜,Annexin V/PI染色激光共聚焦显微镜以及扫描和透射电镜分别检测细胞凋亡的发生.结果:在Herceptin作用下,Hoechst染色荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、扫描和透射电镜分别观察到乳腺癌SKBR-3细胞出现不同方面的明显凋亡特征.结论:不同显微技术各有优缺点,要客观地证实凋亡的发生,应联合运用多种检测方法.     

探讨流式细胞仪测定不同浓度维生素K3对肝癌细胞凋亡周期的影响

目的:对维生素K3诱导肝癌细胞分子凋亡机制进行初步探讨从而达到指导临床肝癌治疗的作用。方法:对人类肝癌细胞株HCC-9204进行培养并选取对数生长期的肝癌细胞,不同浓度及时间的维生素K3进行诱导,通过荧光染色法在激光共聚焦显微镜下观察凋亡细胞核形态。CKK-8法对维生素K3抑制HCC-9204细胞增值,使用流式细胞仪检测细胞凋亡率、凋亡周期及细胞膜Fas表达情况。结果:经维生素K3进行诱导CCK-8检验肝癌细胞比率明显下降,自身生长抑制率上升且呈现明显的计量依赖性,荧光染色后发现细胞凋亡中期细胞凋亡细胞核呈现波纹状或折缝样,有部分染色质出现浓缩,中晚期凋亡细胞核染色质呈现高度凝聚且边缘化,细胞核裂解呈现碎块状并产生凋亡小体。流式细胞仪检测不同浓度VK3作用的肝癌细胞珠HCC-9204在48h时2μmol/L凋亡率为31.44%,5μmol/L凋亡率为62.81%,10μmol/L凋亡率为76.89%,20μmol/L凋亡率为89.24%,25μmol/L凋亡率为93.58%。结论:维生素K3诱导肝癌细胞凋亡48h时呈现明显浓度计量依赖性,荧光染色法在能动速度态观察差细胞核凋亡变化并可以进行定量、定性分析。     

刺五加多糖对人白血病K562细胞作用的研究

目的：研究刺五加多糖对体外培养人白血病K562细胞有无增殖抑制和凋亡诱导作用。方法：取培养至对数生长期的K562细胞（密度为5×10^4／mL和1×10^4／mL）分别接种于96孔培养板（100μL／孔）及50mL培养瓶（1．5mL／瓶）中。加入不同浓度的刺五加多糖作用24h后。用CCK-8法检测刺五加多糖对K562细胞增殖抑制作用；荧光显微镜检测细胞凋亡。结果：不同浓度刺五加多糖（0．405、0．810、1．620、2．430、3．240mg／mL）作用K562细胞24h．抑制率分别为16％、27％、48％、50％、55％；荧光显微镜下观察发现培养K562细胞中出现核固缩、凋亡小体。结论：刺五加多糖对体外培养K562细胞生长有明显的抑制作用．可诱导K562细胞凋亡。     

丙戊酸钠对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用及其机制

目的:研究丙戊酸(VPA)对6-OHDA引起的SH-SY5Y细胞凋亡的抑制作用及其机制。方法:采用光镜观察细胞形态,监测其存活状态,Hoechst33342荧光染色检测细胞凋亡。采用Western blotting法检测细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。结果:形态学观察发现,6-OHDA处理SH-SY5Y细胞使大部分细胞胞体皱缩,突起缩短、消失或断裂,细胞存活率显著下降;而VPA(1mmol/L)预处理细胞24h,可提高细胞存活率。Hoechst33258荧光染色后出现染色质固缩等细胞凋亡的特征性改变,而用VPA预处理SH-SY5Y细胞可明显减少SH-SY5Y细胞凋亡。Western Blotting分析证实,6-OHDA抑制Bcl-2蛋白的表达,而VPA预处理Bcl-2蛋白含量明显上调。结论:VPA能抑制6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,Bcl-2可能是VPA神经保护作用的一个重要靶点。     

舒林酸抑制结肠癌细胞株增殖诱导凋亡

目的 研究非选择性环氧化酶(COX) 抑制剂舒林酸对结肠癌细胞株HT-29 生长的影响及其参与引起细胞死亡的可能机制.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT) 比色法检测舒林酸对结肠癌细胞增殖的抑制,激光共聚焦显微镜(LSM)及荧光显微镜观察细胞凋亡,流式细胞仪( FCM) 分析其对细胞凋亡及细胞周期的影响.结果 MTT 显示舒林酸能呈剂量和浓度依赖性抑制HT-29的增殖.TUNEL 染色荧光显微镜下观察凋亡细胞呈棕褐色,AnnexinV/PI染色后LSM观察凋亡细胞胞膜绿染,胞核红染或呈桔黄色, FCM显示此药促进细胞的凋亡,使处于G0 /G1期的细胞比例显著降低.结论 舒林酸可抑制结肠癌细胞株HT-29生长,促进其凋亡,其机制可能与其阻止细胞周期的进展有关.     

柚皮素对人髓系白血病K562细胞增殖的作用

目的:探讨柚皮素(naringenin)对人慢性髓系白血病K562细胞株生长的影响及其作用机制。方法:MTT法检测柚皮素在不同浓度、不同时间对K562细胞的影响;倒置显微镜下,Wight-Giemsa染色(W-G染色),免疫荧光染色和透射电镜下观察细胞形态变化、凋亡发生情况以及超微结构的变化;并用流式细胞仪分析细胞周期分布,用免疫组织化学的方法检测细胞增殖核抗原(PCNA)的表达。结果:柚皮素对K562细胞增殖有明显抑制作用,作用24,48和72 h后的半数抑制浓度(IC50)分别为455,225和175μmol/L;柚皮素处理组细胞在普通光镜和电镜下均见观察到显著的增殖抑制和典型的细胞凋亡形态学改变;流式细胞仪分析证实柚皮素能使K562细胞聚积在G0/G1期,S期细胞减少;在处理组PCNA的表达显著低于对照组。结论:柚皮素对K562细胞具有明显的增殖抑制作用,这一作用可能是通过细胞周期阻滞和诱导凋亡两种机制实现的。