人骨髓间质干细胞向成骨细胞分化的形态学研究

目的：研究人骨髓间质干细胞(hMSCs)体外培养并向成骨细胞表型转化过程中的形态学改变。方法：在成骨特定诱导培养液中培hMSCs。在相差显微镜和电子显微镜下观察细胞形态，苏木精-伊红染色观察形态，组织化学法检测碱性磷酸酶(ATP)、Ca结节染色．免疫组化检测Ⅰ型胶原(COL Ⅰ)、骨钙素(OC)表达。结果：诱导培养的hMSCs形态由成纤维样梭形向多边形转变，透射电镜观察见大量扩张的粗面内质网、高尔基体、线粒体和钙盐沉积，扫描电镜见细胞表面有大量钙盐颗粒。诱导培养后7，14，2ld可见ALP染色、COL Ⅰ免疫组化染色阳性，诱导培养后14，21d可见OC免疫组化染色、Ca结节染色阳性。结论：hMSCs在特定培养液诱导下可表现为典型的成骨细胞形态，可作为骨组织工程的种子细胞。     

兔骨髓基质干细胞诱导为骨髓源成骨细胞的时间及功能特征

目的：观察经体外培养、扩增后的兔骨髓基质干细胞，应用诱导剂促使其转化为功能活跃的成骨细胞的功能及其时间特征。 方法：实验于2004-03／10在为哈尔滨医科大学第一临床医学院实验中心进行。实验动物选择36只日本大耳白兔，均由胫骨髓腔抽取骨髓，每只抽取量为2．0mL，抗凝，将其加入淋巴细胞分离液，密度梯度离心，取有核细胞层，加入DMEM培养液进行贴壁培养、传代，取生长状态良好的第3代骨髓基质干细胞，以适量的地塞米松、β-甘油磷酸钠和抗坏血酸作为诱导剂进行诱导，使其向成骨细胞转化，并通过倒置相差显微镜、透射电镜分别对细胞的形态、细胞的内部显微结构进行观察，并应用反转录-聚合酶链反应方法检测其分泌的碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原。 结果：原代骨髓基质干细胞于24-48h开始贴壁，细胞形态为长梭形，核小，呈椭圆形，核浆比例小，三四天细胞集落形成，逐渐增大，2周时集落边缘融合，细胞呈单层旋涡状分布，形态均一。传代培养的骨髓基质干细胞于24h内开始贴壁，均匀生长，体积大，无集落形成，细胞排列规则。骨髓基质干细胞在加入诱导剂3d后其形态逐渐由长梭形转变为短梭形，1周后变为多角形或鳞片形，其胞体、细胞核和核浆比例逐渐增大；诱导的细胞细胞器不发达，为低分化细胞，突起内见丰富的粗面内质网；在诱导1周后，细胞开始分泌碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原。碱性磷酸酶扩增产物长度为408bp，Ⅰ型胶原扩增产物长度为206bp。 结论：兔骨髓基质干细胞在加入诱导剂1周后，细胞开始分泌碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原，并形成钙结节，细胞功能状态良好，说明诱导1周后骨髓基质干细胞已成功向成骨细胞转化，并形成为功能活跃的骨髓源成骨细胞，是与支架材料构建组织工程骨的最佳时机。     

富血小板血浆诱导人骨髓基质干细胞的体内异位成骨

背景:近年来的研究发现,结合组织工程技术利用经诱导转化的骨髓基质干细胞能成功地在动物体内再生出骨组织,并在大型哺乳动物负重骨缺损的修复实验中取得了较好的修复效果.目的:观察富血小板血浆诱导培养人骨髓基质干细胞在体内的成骨特性,探讨采用富血小板血浆诱导培养的人骨髓基质干细胞与珊瑚羟基磷灰石材料体内异位成骨的可行性.设计、时间及地点:配对样本观察,于2007-10/2008-04在中山大学组织工程实验室完成.材料:4周龄BALB/C裸鼠14只,体质量22～24 g,麻醉后将裸鼠两侧股部切开,于股部肌间隙内制成肌袋模型.方法:14只裸鼠左侧肌袋内植入珊瑚羟基磷灰石复合富血小板血诱导培养的人骨髓基质干细胞,作为实验组;右侧背部肌袋内植入单纯珊瑚羟基磷灰石材料为对照组.主要观察指标:分别于植入后4,8,12周对比观察两组裸鼠活动及进食情况;X射线平片观察阻射率;苏木精-伊红染色观察骨形成情况.结果:14只裸鼠均进入结果分析.①植入材料后裸鼠活动及进食均正常,伤口愈合良好.材料随植入时间的延长无明显吸收,而材料周围的肌肉组织等软组织由外向内逐渐长入材料孔隙内有所增多.②随时间延长两组X射线平片阻射影像密度逐步增加.植入材料后4,8,12周实验组与对照组相比,差异有非常显著性意义(P<0.01).③植入材料后4周,实验组可见珊瑚羟基磷灰石表面有细胞生长,孔隙内有结缔组织长入;对照组仪见珊瑚羟基磷灰石表面有细胞生长.8周时珊瑚羟基磷灰石表面有新生骨形成,孔隙内和孔隙边缘可见骨样组织沉积和少量软骨样组织形成;对照组仅见少量纤维结缔组织长入.12周时珊瑚羟基磷灰石材料表面有较多成熟编织骨形成,部分区域可见髓腔样结构形成,并有血管长入;对照组仍未见新骨及骨样组织形成.结论:富血小板血浆诱导培养人骨髓基质干细胞与珊瑚羟基磷灰石材料在裸鼠体内能够良好的成骨,随时间的延长,成骨特性越明显;体内采用肌袋包裹的方法能有效增加血运及促进组织工程骨血管化生成,促进成骨.     

乙烯雌酚可诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化

背景:关于雌激素对骨髓基质干细胞作用的报道尚不多.目的:观察乙烯雌酚对兔骨髓基质干细胞成骨分化的影响.方法:体外培养骨髓基质干细胞,用0,10-7,10-6,10-5 mol/L浓度乙烯雌酚干预,并设地塞米松10-8 mol/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L、维生素C 50 mg/L为阳性对照.结果与结论:乙烯雌酚干预培养24,48,72 h,10-6 mol/L组显著促进了骨髓基质干细胞增殖(P < 0.01).干预48 h 10-5 mol/L组显著抑制细胞增殖,干预72 h 10-7 mol/L组显著抑制细胞增殖(P < 0.01).10-7 mol/L组乙烯雌酚干预25 d后开始出现钙化结节;10-7,10-6 mol/L组干预14,21 d碱性磷酸酶活性显著增加.证实乙烯雌酚能促进兔骨髓基质干细胞的成骨分化.     

兔骨髓基质干细胞诱导为骨髓源成骨细胞的时间及功能特征

目的:观察经体外培养、扩增后的兔骨髓基质干细胞,应用诱导剂促使其转化为功能活跃的成骨细胞的功能及其时间特征。方法:实验于2004-03/10在为哈尔滨医科大学第一临床医学院实验中心进行。实验动物选择36只日本大耳白兔,均由胫骨髓腔抽取骨髓,每只抽取量为2.0mL,抗凝,将其加入淋巴细胞分离液,密度梯度离心,取有核细胞层,加入DMEM培养液进行贴壁培养、传代,取生长状态良好的第3代骨髓基质干细胞,以适量的地塞米松、β-甘油磷酸钠和抗坏血酸作为诱导剂进行诱导,使其向成骨细胞转化,并通过倒置相差显微镜、透射电镜分别对细胞的形态、细胞的内部显微结构进行观察,并应用反转录-聚合酶链反应方法检测其分泌的碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原。结果:原代骨髓基质干细胞于24～48h开始贴壁,细胞形态为长梭形,核小,呈椭圆形,核浆比例小,三四天细胞集落形成,逐渐增大,2周时集落边缘融合,细胞呈单层旋涡状分布,形态均一。传代培养的骨髓基质干细胞于24h内开始贴壁,均匀生长,体积大,无集落形成,细胞排列规则。骨髓基质干细胞在加入诱导剂3d后其形态逐渐由长梭形转变为短梭形,1周后变为多角形或鳞片形,其胞体、细胞核和核浆比例逐渐增大;诱导的细胞细胞器不发达,为低分化细胞,突起内见丰富的粗面内质网;在诱导1周后,细胞开始分泌碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原。碱性磷酸酶扩增产物长度为408bp,Ⅰ型胶原扩增产物长度为206bp。结论:兔骨髓基质干细胞在加入诱导剂1周后,细胞开始分泌碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原,并形成钙结节,细胞功能状态良好,说明诱导1周后骨髓基质干细胞已成功向成骨细胞转化,并形成为功能活跃的骨髓源成骨细胞,是与支架材料构建组织工程骨的最佳时机。     

兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的不同培养方法

背景：目前传统骨髓间充质干细胞的培养方法是应用异种血清为培养基，但其存在种间疾病传播、潜在免疫排斥反应甚至是伦理学争议等问题；且与卫生部公布的《组织工程化组织移植治疗技术管理规范》的要求相违背。自体富血小板血浆是生物自体的全血提取物，内含多种且含量丰富的生长因子。
　　目的：使用自体富血小板血浆替代传统异种血清，探讨其对兔骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞的影响，方法：从兔髂后上棘穿刺抽出8 mL骨髓并加肝素抗凝，密度梯度离心富集骨髓间充质干细胞，分为自体富血小板血浆组、胎牛血清组，分别加入含10%自体富血小板血浆、体积分数10%胎牛血清。在传至4代时将自体富血小板血浆组和胎牛血清组细胞各自分为实验组和对照组，实验组对培养及成分进行改变；对照组培养基不变。通过生长曲线测定各代细胞的增殖情况；通过对各组细胞进行碱性磷酸酶活性测定，判断其成骨分化状况。
　　结果与结论：骨髓间充质干细胞生长曲线可见各代细胞增殖良好。对第4代各组细胞进行碱性磷酸酶活性检测，培养第12天，第4代自体富血小板血浆实验组及胎牛血清实验组的碱性磷酸酶活性均显著高于其相应对照组；自体富血小板血浆组对照组、实验组碱性磷酸酶活性显著高于胎牛血清组的对照组、实验组，差异有显著性意义(P<0.01)。提示使用自体富血小板血浆替代异种血清培养骨髓间充质干细胞是一种安全可靠、操作简单、纯度活性高的诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化方法。     

富血小板血浆诱导犬骨髓间充质干细胞的体外成骨

背景:富血小板血浆中含有大量骨再生所需的生长因子,且各生长因子的比例是机体自身形成的,具有良好的协同作用.目的:探讨富血小板血浆体外诱导犬骨髓间充质干细胞成骨的效果.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-06/2008-02在中南大学湘雅医院中心实验室完成.材料:健康12月龄雄性比格犬,由中南大学湘雅医学院实验动物部提供.方法:收集第3代犬骨髓间充质干细胞,分为4组:对照组加入标准培养基;成骨诱导培养基组向培养板孔内加入含胎牛血清、地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C的高糖DMEM培养基;富血小板血浆组根据预实验结果,向培养板内加入含体积分数为6.25%富血小板血浆的低糖DMEM培养基;联合组向培养板内加入含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、体积分数为6.25%富血小板血浆的高糖DMEM培养基.主要观察指标:细胞内碱性磷酸酶活性,免疫细胞化学染色检测I型胶原的表达,改进Yon Kossa染色标记钙结节形成情况,RT-PCR检测诱导后骨钙素mRNA的表达.结果:各组碱性磷酸酶活性均随诱导时间的延长而逐渐增高,联合组升高幅度最为明显(P<0.05).诱导7,14 d后,成骨诱导培养基组、联合组I型胶原均呈阳性表达,富血小板血浆组、对照组I型胶原始终呈阴性表达.诱导14 d后,成骨诱导培养基组、联合组可见卵圆形钙结节.诱导7,14 d后,对照组与富血小板血浆组之间骨钙素mRNA表达水平无明显差异(P>0.05),此2组骨钙素mRNA表达水平均明显低于成骨诱导培养基组、联合组(P<0.05);成骨诱导培养基组骨钙素mRNA表达水平明显低于联合组(P<0.05).结论:经成骨条件培养基诱导培养的骨髓基质干细胞,富血小板血浆能在体外显著诱导其成骨指标的表达.     

自体富血小板血浆替代动物血清体外诱导培养人骨髓基质干细胞的实验

目的：应用一种新的人骨髓基质干细胞培养方法，以满足细胞培养过程中对各类细胞因子的需求，同时尽量减少细胞培养过程中动物源性抗原物质的引入，达到组织工程骨临床应用中细胞的数量与生物学特性要求。方法：实验于2004-03／2005-03在南方医科大学组织工程实验室完成。①自体富血小板血浆的获取：将抽取的自体200mL，加抗凝剂混匀，两次离心。第1次在20℃，3000r／min离心10min，取上清及分界面下3mm部分置另一离心管中，第2次在20℃，以3600r／min离心15min。弃12层3／4，剩余部分在旋涡振荡器上轻震荡使混匀，即为富血小板血浆。将富血小板血浆与催化剂溶液（含100g/L氯化钙、400IU／mL凝血酶）以体积比9：1混合，混匀后以0．22μm滤膜过滤即为富血小板血浆复合因子苹取液。②人骨髓基质干细胞的获取和培养：10名成年健康志愿者（排除其他系统疾病），男7名，女3名；15～35岁，平均年龄27．3岁。抽取骨髓5mL。将获得的有核细胞以2&;#215;10^7接种于10cm。培养瓶（100mL／L富血小板血浆配比低糖DMEM）培养。传代细胞用含100mL／L富血小板血浆，50mg／L抗坏血酸，l&;#215;10^-8ol／L地塞米松，1&;#215;10^-3mol／L β-甘油磷酸钠诱导培养，快速扩增后，采用倒置相差显微镜、扫描电镜观察各细胞形态及细胞增值情况，碱性磷酸酶染色与钙结节染色等方法对细胞进行生物学特性检测。结果：①人骨髓基质干细胞形态学观察结果：人骨髓基质干细胞接种后2-4h开始贴壁，24h后细胞完全贴壁，呈多角型、梭型。6～8d后，细胞可长满瓶底并呈现单层细胞融合．传代培养后细胞生长迅速，传代诱导后，接种细胞一两天可长满瓶底。细胞为长梭型或不规则多边形，并有伪足伸出，胞核位于细胞一端。细胞生长至第8代生长明显变缓，10代以后细胞内开始出现颗粒样沉积物，并有细胞脱落飘浮于液体中。扫描电镜观察．黏附细胞为梭型或多角型表现，并有多个突起呈不规则形状。②钙结节茜素红染色结果：第3代细胞培养融合后，继续培养至形成密集的细胞团簇，中心出现细胞基质的沉积，茜素红染色可以清晰的显示钙结节．③碱性磷酸酶染色：细胞诱导培养第3代后可见胞质内有大量灰黑色颗粒或块状沉淀，呈现碱性磷酸酶染色阳性。结论：①以自体富血小板血浆替代动物血清体外诱导培养人骨髓基质干细胞，碱性磷酸酶染色与钙结节染色结果显示细胞具有良好的成骨细胞生物学特性。②其所培养的细胞数量及生物学特性能快速达到临床应用的需求．是一种良好的培养方法。     

体外培养人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的流体剪切应力参数

目的：流体剪切力是骨骼组织中骨骼细胞所感受到的主要应力刺激，可促进骨骼细胞的增殖、分化及保持细胞正常的生理功能。应用流体剪切力刺激体外培养的人骨髓间充质干细胞，观察其向成骨细胞分化的可行性。方法：实验于2004—04／12在第三军医大学西南医院完成，骨髓来源于正常志愿献髓者。进行人骨髓间充质干细胞的分离培养，实验组应用平行平板流动腔对自愿捐献的人骨髓间充质干细胞给予强度为0．3Pa的流体剪切力刺激30min，对照组不加此干预，两组物理环境相同。应用流式细胞仪检测细胞周期，应用透射电镜观察细胞超微结构，检测细胞内碱性磷酸酶含量。评估其向成骨细胞分化和具备功能的特征。放免法检测培养上清液骨钙素含量。评估其是否向成骨细胞成熟晚期分化。并与静态培养对照组作对比。结果：①实验组经流体剪切力作用后，细胞胞体变大，突起较多，多角形细胞较对照组增多；透射电镜观察可见细胞胞浆丰富、核浆比例小，有较多的内质网，高尔基体发达，核仁明显，呈成熟细胞表现。②实验组细胞S期(DNA合成期)比例较对照组明显增高[(13．53&;#177;1．47)％，(7．56&;#177;2．54)％，P&;lt;0．01]。③实验组细胞内碱性磷酸酶含量第9天开始增高，且随时间延长，增高速度加快。④第12天及第24天检测的上清液骨钙素含量两组无明显差别(t=0．263，-0．406，P&;gt;0．05)。结论：本实验发现强度为0．3Pa作用30min的流体剪切力可以使人骨髓间充质干细胞早期的细胞内碱性磷酸酶含量增高，细胞开始向成骨细胞分化，但未能促使晚期的骨钙素表达升高，说明此强度的流体剪切力不能成功促进人骨髓间充质干细胞最终实现向成骨方向分化。需要继续探索能够促进人骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的流体剪切力的更有效的参数。     

富血小板血浆对人骨髓间充质干细胞成骨分化的抑制效应

目的:一些理论质疑富血小板血浆对骨前体细胞成骨分化的作用,本实验拟验证富血小板血浆对体外培养的人骨髓间充质干细胞成骨分化的抑制效应。方法:实验于2005-05/11在南方医科大学组织工程试验室(省级)完成。①实验方法:抽取6名健康志愿者髂前上棘骨髓5mL进行体外细胞培养扩增,静脉血10mL以二次离心法制得富血小板血浆。诱导骨髓间充质干细胞时富血小板血浆与骨髓间充质干细胞均来自同一个体。②碱性磷酸酶染色:取第4代骨髓间充质干细胞,分为两组:富血小板血浆组加入富血小板血浆使终浓度为100g/L,单纯血清培养组仅加入等量胎牛血清。培养后第7天进行碱性磷酸酶染色,阳性细胞为胞质中呈现黑色颗粒或块状沉淀。③矿化结节染色:取第4代骨髓间充质干细胞,分组同上。培养后第19天以0.1%茜素红-TrisHcl(pH8.3)37℃下放置30min,矿盐沉积染色阳性为红色。④Cbfa1基因表达:取第4代骨髓间充质干细胞,分组同上。培养后第3,7,12,16天RT-PCR法检测骨髓间充质干细胞Cbfa1基因的表达。⑤形态学观察:实验过程中使用相差显微镜观察各组细胞生长情况及形态学变化。结果:①骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶染色结果:培养后第7天,富血小板血浆组碱性磷酸酶阳性细胞数量较单纯血清培养组明显减少,且阳性细胞内灰黑色颗粒也明显减少,为弱阳性。②骨髓间充质干细胞矿化结节染色结果:培养后第19天,单纯血清培养组可见细胞表面有较多的矿盐沉积,但未形成明显的矿化结节。富血小板血浆组细胞表面只有稀少的矿盐沉积。③骨髓间充质干细胞cbfa1mRNA的表达:培养后第3,7,12,16天,随着培养时间的延长单纯血清培养组与富血小板血浆组cbfa1基因表达量均逐渐增高,同一时间点两组间cbfa1基因的表达基本相似。④骨髓间充质干细胞形态学变化:富血小板血浆组骨髓间充质干细胞增殖旺盛,细胞达到单层汇合的时间较单纯血清培养组明显缩短。单纯血清培养组细胞在完全汇合后开始出现聚合现象(14～16d),但趋向性不明显,未完全形成团簇;富血小板血浆组细胞在完全汇合后未出现聚合现象,细胞密集生长。培养初期两组细胞以梭形为主,多角形细胞较少,培养至14～16d单纯血清培养组多角形细胞较富血小板血浆组增多。结论:富血小板血浆可抑制人骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶的分泌与矿盐沉积,对人骨髓间充质干细胞成骨分化的直接效应是抑制其分化。     

富血小板纤维蛋白诱导骨髓间充质干细胞向许旺细胞的分化

背景:富血小板纤维蛋白被誉为新一代血小板浓缩物,有研究表明,富血小板纤维蛋白可以诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞。目的:观察富血小板纤维蛋白对骨髓间充质干细胞向许旺细胞分化的影响。方法:分离兔骨髓间充质干细胞,并分为3组:对照组使用传统抗氧化剂诱导,富血小板纤维蛋白1组加入1块富血小板纤维蛋白诱导,富血小板纤维蛋白2组加入2块富血小板纤维蛋白诱导。结果与结论:培养第3,7,14,21天时取各组细胞行CCK-8细胞毒性检测发现,与对照组相比,富血小板纤维蛋白1组各时间点细胞增殖增快(P<0.05),与富血小板纤维蛋白1组相比,富血小板纤维蛋白2组各时间点细胞增殖增快(P<0.05);培养第21天时Real Time PCR检测发现,富血小板纤维蛋白1组细胞内S-100和神经胶质原纤维酸性蛋白mRNA表达较对照组增高(P<0.05),富血小板纤维蛋白1组与富血小板纤维蛋白2组相比S-100和神经胶质原纤维酸性蛋白mRNA表达差异无显著性意义(P>0.05);培养第21天时流式细胞术检测发现,富血小板纤维蛋白1组S-100(+)细胞百分比和神经胶质原纤维酸性蛋白(+)细胞百分比均高于对照组,富血小板纤维蛋白1组与富血小板纤维蛋白2组相比,阳性细胞百分比差异无显著性意义(P>0.05)。结果表明,富血小板纤维蛋白可促进骨髓间充质干细胞增殖,且富血小板纤维蛋白诱导骨髓间充质干细胞分化为许旺细胞的分化率高,优于传统化学诱导方法。     

电针诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

背景:目前经报道的成骨诱导方法很多,为骨髓间充质干细胞的成骨诱导提出很多新的思路及方法.但是电针是否能诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化尚不清楚.目的:尝试应用电针治疗仪诱导人骨髓闻充质干细胞向成骨细胞分化,评价其作为骨组织工程种子细胞的可行性.方法:从患者髂后上棘抽取骨髓.分离培养鉴定为骨髓间充质干细胞后,取第3代细胞进行培养.当细胞铺满培养瓶底90%以上时进行胰酶消化,分别以3.0×103/cm2的浓度接种于6孔培养板中.实验随机分为3组:空白对照组:加入2 mL体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM/F12培养液;化学诱导组:每孔内加2 mL含10%胎牛血清的L-DMEM培养液,当细胞贴壁生长达到60%-70%汇合时,加入骨诱导剂;电针刺激组:加入2 mL体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM/F12培葬液,电针刺激.采取连续波输出,基波脉冲频率为50 Hz,基波脉冲宽度0.5 ms,持续作用30 min,共电针刺激28 d.相差倒置显微镜观察细胞形态变化:茜索红染色结果:细胞诱导14,28 d后碱性磷酸酶活性:RT-PCR测定细胞中骨钙素mRNA的表达:Western Blot测定细胞中骨钙素蛋白表达.结果与结论:①在28 d的诱导过程中,化学诱导组5-7 d细胞汇合成单层,细胞突起互相连接,并可重叠生长而不发生细胞间的接触抑制现象:电针刺激组9 d或10 d发现细胞体积大,呈三角形、多角形或鳞形;空白对照组细胞形态仍然是纺锤状.②化学诱导组和电针刺激组28 d在倒置相差显微镜下均观察到育矿化结节出现,进行茜素红均呈阳性反应,而空白对照组呈阴性反应.③骨髓间充质干细胞在体外进行诱导时化学诱导组和电针刺激组碱性磷酸酶水平在14,28 d高于空白对照组(P<0.05):且化学诱导组碱性磷酸酶14 d时高于电针刺激组(P<0.05),但28 d时差异无显著性意义(P>0.05).④空白对照组骨钙素mRNA及蛋白含量均低于化学诱导组和电针刺激组(P<0.05).提示电针可定向诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化.     

骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的实验研究

目的:采用地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C3种物质作为诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化的基本辅剂,定向诱导犬第2代BMSCs,探讨BMSCs向成骨细胞分化的潜能和成骨细胞的特征性鉴定方法.方法:无菌条件下行犬髂骨穿刺,采集骨髓15～ 20 mL,全骨髓10％ FBS DMEM培养液进行原代培养.将第2代纯化的BMSCs细胞悬液(调整细胞密度为1×105/mL)接种于含地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C的DMEM/FI2培养液的培养瓶(皿)中,体外扩增培养、传代.对细胞形态特征进行观察;行碱性磷酸酶(ALP)染色,骨桥素以及Ⅰ型胶原相关蛋白免疫荧光化学检测鉴定细胞性质.结果:原代培养的BMSCs形态呈长梭形或不规则形,呈均匀分布生长.诱导分化后的细胞形态呈长梭形或不规则形,呈均匀分布生长,传代后细胞体积略变大;BMSCs成骨诱导增殖后电镜下细胞呈多边形,可见ALP染色阳性;经成骨细胞诱导培养14 d后,细胞骨桥素以及Ⅰ型胶原相关蛋白表达阳性.结论:BMSCs易于体外分离培养及扩增,地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C体外定向诱导能够在短时间内获得大量成骨细胞,且所培养的细胞具有典型的成骨细胞形态和功能.     

全反式视黄酸诱导兔骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化

背景：目前,在骨髓间充质干细胞体外向神经细胞分化的实验中,较多采用抗氧化剂法和细胞因子法,但诱导效率低。目的：探讨全反式视黄酸在兔骨髓间充质干细胞向神经细胞分化中的作用。方法：体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,取第4代骨髓间充质干细胞观察细胞形态,实验组用0.4μmol/L全反式视黄酸预诱导24h后,改用神经细胞培养基继续培养。神经细胞培养基培养4,8,16及24h,免疫组织化学检测巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达情况,采用RT-PCR的方法检测巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达水平。结果与结论：骨髓间充质干细胞经培养、传代后,细胞贴壁生长,呈长梭形。免疫组织化学检测结果显示：全反式视黄酸诱导组巢蛋白及神经元特异性烯醇化酶呈阳性,诱导后细胞的活力良好。RT-PCR结果显示全反式视黄酸诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异性烯醇化酶在诱导后16h可见明显的扩增条带,24h后更加明显。提示全反式视黄酸能够在体外促进兔骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。     

全反式视黄酸诱导兔骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化

背景:目前,在骨髓间充质干细胞体外向神经细胞分化的实验中,较多采用抗氧化剂法和细胞因子法,但诱导效率低。目的:探讨全反式视黄酸在兔骨髓间充质干细胞向神经细胞分化中的作用。方法:体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,取第4代骨髓间充质干细胞观察细胞形态,实验组用0.4μmol/L全反式视黄酸预诱导24h后,改用神经细胞培养基继续培养。神经细胞培养基培养4,8,16及24h,免疫组织化学检测巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达情况,采用RT-PCR的方法检测巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达水平。结果与结论:骨髓间充质干细胞经培养、传代后,细胞贴壁生长,呈长梭形。免疫组织化学检测结果显示:全反式视黄酸诱导组巢蛋白及神经元特异性烯醇化酶呈阳性,诱导后细胞的活力良好。RT-PCR结果显示全反式视黄酸诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异性烯醇化酶在诱导后16h可见明显的扩增条带,24h后更加明显。提示全反式视黄酸能够在体外促进兔骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。     

骨髓基质细胞诱导分化成骨方法及相关研究进展

骨髓基质细胞在体外适当的培养条件下,可以向成骨细胞、成软骨细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、成肌细胞等多种间充质来源的中胚层组织细胞分化,取材方便、对机体损伤小,是目前最为合适的骨组织工程种子细胞.现阶段诱导骨髓基质细胞分化成骨的方法人致分为以下6种:在化学药物作用下分化、在细胞因子作用下分化、与骨细胞共培养下的分化、物理方法下的分化、中药提取物作用下的分化、转基因作用下的分化.很多诱导骨髓基质细胞分化为成骨细胞的研究结果对于深入了解诱导分化机制有重要的指导和参考价值,但仍需进一步分析各种微环境因素在诱导分化过程中的作用机制.     

骨髓间充质干细胞诱导分化成骨方法的研究与进展

背景：骨髓间充质干细胞具有良好的成骨分化潜能,移植入体内后可分化为骨、软骨、肌肉、脂肪、肝脏和神经等多种细胞。目的：综述大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化成骨最新方法进展。方法：分别以“骨髓间充质干细胞,成骨细胞,诱导分化”、“bone mesenchymal stem cells,osteoblast cells,osteogenic differentiation”为检索词,应用计算机检索CHKD期刊全文数据库,PubMed数据库和万方数据库1995至2011年有关文章。纳入有关骨髓间充质干细胞的文献。排除内容重复和缺乏原创性文献。保留34篇文献做进一步分析。结果与结论：骨髓间充质干细胞在适当的生长因子诱导下可以快速地向成骨细胞分化和增殖。在体外诱导骨髓问充质干细胞向成骨细胞分化需要特定的诱导条件、优良的诱导剂以及合适的剂量。骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化受许多自身调控因素（控制基因表达的转录因子）和环境调控因素（分泌因素、细胞外基质,化学因素、细胞与细胞间的相互作用）的影响,这些调控因素并不是孤立存在的,而是相互联系、相互作用,共同调控骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。,     

兔骨髓源性神经干细胞分化为成熟神经元样细胞的特征研究

目的:探讨兔骨髓源性神经干细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)经体外培养及诱导分化成的神经元样细胞,能否合成分泌5-羟色胺神经生物活性物质成分。方法:分离兔BMSCs,应用神经干细胞培养液和分化诱导因子进行体外培养和诱导分化,免疫细胞化学鉴定;并应用高效液相色谱法(HPLC)检测其5-羟色胺生物活性物质的含量。细胞培养所涉及的细胞因子主要有脑源性神经营养因子(BDNF)和维A酸。结果:BMSCs培养12d可见大而圆细胞,免疫细胞化学鉴定Nestin抗原阳性;培养20d可见长突起神经元样细胞,神经核蛋白(NeuN)免疫细胞化学检查阳性,高效液相检测BMSCs、空白神经干细胞培养液及L-02肝细胞阴性对照组未测到5-羟色胺生物活性物质,经体外培养增殖14d的神经干细胞及培养液、体外诱导分化20d的神经元样细胞及培养液则可检测到5-羟色胺分别为:每1×107细胞中(1.7940±0.0095),(4.010±0.1170)μg/L,差异有非常显著性意义(t=30.6323,P=0.001)。方差分析显示:随着骨髓基质细胞培养天数的增加,其所含的5-羟色胺浓度也渐增加,组间5-羟色胺含量差异有显著意义(P<0.01)。结论:兔BMSCs能在体外增殖,并表达Nestin抗原;而且,在适宜条件下能分化成神经元样细胞,并表达成熟神经元特异性核蛋白,合成、分泌5-羟色胺神经递质。     

联合应用地塞米松和维甲酸诱导兔骨髓基质细胞向成骨方向的转化

目的:观察维甲酸和地塞米松对兔骨髓基质细胞的成骨诱导影响,探讨二者联合诱导兔骨髓基质细胞向成骨细胞分化的可能性和适当条件,使兔骨髓基质细胞向成骨诱导得以优化,从而为临床治疗骨缺损提供实验基础。方法:实验于2005-12/2006-3在锦州医学院附属第一医院骨科实验室完成。①体外培养兔骨髓基质干细胞。②用不同的诱导剂将其向类成骨细胞诱导。实验分非诱导组(用DMEM培养基培养),地塞米松诱导组(培养基中加入地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C),维甲酸诱导组(培养基中加入维甲酸),地塞米松与维甲酸联合诱导组(培养基中加入地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C和维甲酸)。③通过倒置相差显微镜对细胞的形态进行观察;于第4,6,8,10,12天定量检测其分泌的碱性磷酸酶;应用原位杂交技术检测Ⅰ型胶原的表达情况。结果:①原代和传代培养时不同组别兔骨髓基质细胞的生长情况:地塞米松诱导组细胞形态向类成骨细胞转化,维甲酸诱导组细胞与神经干细胞类似,地塞米松与维甲酸联合诱导组细胞与地塞米松诱导组细胞形态变化大体一致,但细胞更饱满,多角形细胞比例更高,部分区域细胞呈现漩涡状分布。②各组碱性磷酸酶活性检测结果:非诱导组碱性磷酸酶表达量低,随时间略有增加;地塞米松诱导组碱性磷酸酶表达呈曲线升高[6,8,10,12d依次为(265.9±47.3),(445.4±69.4),(650.3±52.0),(703.6±62.5)nkat/L];维甲酸诱导组基本无碱性磷酸酶表达;地塞米松与维甲酸联合诱导组碱性磷酸酶表达趋势与地塞米松诱导组相似,但绝对值有所增高[6,8,10,12d依次为(355.4±62.2),(631.3±84.4),(925.0±69.0),(1039.5±85.2)nkat/L]。③各组原位杂交技术检测Ⅰ型胶原结果:地塞米松诱导组和地塞米松、维甲酸联合诱导组检测Ⅰ型胶原结果发现胞浆内可见大量棕黄色颗粒,非诱导组与维甲酸诱导组为阴性。结论:适当浓度地塞米松可成功的将兔骨髓基质细胞向成骨细胞诱导,维甲酸与地塞米松联合诱导可使成骨能力进一步加强,表现为碱性磷酸酶表达明显增高,并表达Ⅰ型胶原,具体浓度条件有待进一步研究。