转染组织纤溶酶原激活物及内皮型一氧化氮合酶基因的内皮细胞和平滑肌细胞共同种植于人工血管对内膜增生的影响

背景：前期研究表明，双层细胞种植能有效提高内皮细胞保留率，将组织纤溶酶原激活物基因转染到内皮细胞中能提高其细胞溶解纤维蛋白的能力。 目的：采用双细胞种植及修饰内皮的组织纤溶酶原激活物基因提高内皮细胞保留率和抗栓能力，通过内皮型一氧化氮合酶基因调控平滑肌细胞的增殖，观察对小口径人工血管通畅率的影响。 方法：以4种不同组合细胞(内皮细胞+平滑肌细胞SMC，内皮细胞/组织纤溶酶原激活物+平滑肌细胞，内皮细胞+平滑肌细胞/内皮型一氧化氮合酶，内皮细胞/组织纤溶酶原激活物+平滑肌细胞/内皮型一氧化氮合酶)种植在PTFE管腔面。将新西兰大白兔随机分成4组，4种人工血管经旁路分别移植在4组兔的腹主动脉上。 结果与结论：移植后60 d，种植内皮细胞+平滑肌细胞组和内皮细胞+平滑肌细胞/内皮型一氧化氮合酶组内膜厚度无明显差异(P > 0.05)。与内皮细胞/组织纤溶酶原激活物+平滑肌细胞/内皮型一氧化氮合酶组相比，未转染内皮型一氧化氮合酶组(内皮细胞/组织纤溶酶原激活物+平滑肌细胞）内膜明显增厚(P < 0.05)；未转染组织纤溶酶原激活物组(内皮细胞+平滑肌细胞/内皮型一氧化氮合酶)内膜较薄(P < 0.05)。提示组织纤溶酶原激活物基因转染可以促进血管内膜增生导致血管狭窄，但同时转入内皮型一氧化氮合酶基因可以抑制组织纤溶酶原激活物的促进平滑肌细胞增殖及内膜增生的作用。     

血管细胞外基质在修复输尿管缺损中释放生长因子增强血管化的研究

背景：血管细胞外基质作为来源于血管组织的天然生物支架材料,在植入宿主体内后能迅速刺激血管生成,加速组织工程化组织血管化,但其确切机制还不清楚。 目的：探讨血管细胞外基质在修复输尿管缺损中释放血管内皮生长因子增强血管化的作用。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2009-04/2009-08在武汉大学第一临床医学院生物医学工程实验室完成 材料：成年新西兰兔23只（由武汉大学医学院实验动物中心提供）,其中5只供体兔的腹主动脉经手术取出制备血管细胞外基质：腹主动脉置于PBS和叠氮钠的混合溶液中浸泡搅拌过夜;继续用 EDTA溶液、胰蛋白酶浸泡搅拌;甲醛和戊二醛对组织进行交联保护;用NaCl和 DNA酶DNase溶液搅拌;最后用脱氧胆酸钠和叠氮钠溶液浸泡和搅拌。 方法：用ELISA法体外检测血管细胞外基质在PBS孵育液中血管内皮生长因子的含量,应用MTT法体外检测血管细胞外基质对内皮细胞的增殖作用;应用家兔同种异体血管细胞外基质体内修复输尿管缺损,术后不同时间检测兔输尿管缺损修复情况及血管再生情况。 主要观察指标：血管细胞外基质内血管内皮细胞生长因子含量的检测,血管细胞外基质对内皮细胞的增殖作用及对输尿管缺损修复的影响。 结果：体外实验显示血管细胞外基质在PBS孵育液中血管内皮生长因子含量峰值为(124.10±1.42)ng/L,对内皮细胞有促进增殖作用。体内移植修复试验显示术后2周移植物可见新生毛细血管,腔内面边缘部见移行上皮细胞爬行,管壁有平滑肌细胞长入;第8周移植物内大量毛细血管生成,且管腔增大,移行上皮细胞层增厚,平滑肌规则排列成束;术后16周血管细胞外基质修复区已接近正常输尿管组织结构。 结论：血管细胞外基质作为生物支架材料,在降解的同时能释放血管内皮生长因子刺激血管再生,有可能成为一种理想的输尿管重建材料。 关键词：血管细胞外基质;血管内皮生长因子;输尿管;组织工程     

血管组织工程种子细胞原代培养技术的改良**★

背景：如何获取高质量的种子细胞是构建组织工程血管的先决问题。 目的：改良血管组织工程种子细胞原代培养技术并观察其生物学特性。 设计、时间及地点：以细胞为培养对象，观察性实验，于2006-12/2008-03在江西省分子医学重点实验室完成。 材料：新西兰家兔，体质量2 kg左右，用于血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的原代培养。 方法：以胶原酶胰酶序贯消化法获得血管内皮细胞、快捷贴壁法培养血管平滑肌细胞。 主要观察指标：免疫细胞化学法对两者进行鉴定；流式细胞术检测第2代和第6代血管内皮细胞的增殖指数。 结果：培养的种子细胞符合各自特征，免疫细胞化学鉴定其为血管内皮细胞和血管平滑肌细胞。内皮细胞第2代和第6代细胞增殖指数分别为(20.87±2.05)%和(9.75±1.76)%。 结论：胶原酶胰酶序贯消化法和快捷贴壁法可以较稳定地获取血管内皮细胞及血管平滑肌细胞；第2代的内皮细胞较第6代更适用于构建组织工程血管。     

内皮型一氧化氮合酶基因转染对移植人工血管内膜增生的作用*★

目的：平滑肌细胞增殖移行和血小板激活导致血栓形成是移植血管再狭窄的主要原因，一氧化氮可以抑制上述生物反应，但内皮型一氧化氮合酶基因转染是否抑制种植了平滑肌细胞的人工血管内膜增生还未得到证实。实验拟进一步观察内皮型一氧化氮合酶基因转染对种植平滑肌细胞的人工血管内膜增生的影响。 方法：实验于2006-04/2007-05在西安交通大学医学院中心实验室及分子生物学实验室完成。①实验材料：1月龄新西兰大白兔1只，用来获取平滑肌细胞。成年新西兰大白兔18只，随机数字表法分成3组，每组6只。正常细胞组移植未种植细胞的人工血管；LacZ转染组移植种植转染lacZ的平滑肌细胞的人工血管，内皮型一氧化氮合酶转染组移植种植内皮型一氧化氮合酶的平滑肌细胞的人工血管。②实验方法：构建含有报道基因lacZ和内皮型一氧化氮合酶基因的假型反转录病毒载体小鼠白血病病毒/疱疹性口炎病毒G糖蛋白，并转染平滑肌细胞。将转染了基因的细胞种植在人工血管上，并用血管旁路移植的方法植入兔腹主动脉。③实验评估：测定转染内皮型一氧化氮合酶基因及LacZ基因细胞培养上清中一氧化氮含量。血管植入30，100 d 后X-gal染色及苏木精-伊红染色观察人工血管上的平滑肌细胞，同时显微镜下测量每段血管内膜增生的厚度。 结果：纳入成年新西兰大白兔18只，均进入结果分析。①内皮型一氧化氮合酶转染组一氧化氮含量明显高于未转染的正常细胞组（P < 0.05)。平滑肌细胞转染lacZ基因后经X-gal染色，倒置显微镜下可见转染了基因的细胞被染成蓝色。②血管植入30 d，与正常细胞组比较，LacZ转染组和内皮型一氧化氮合酶转染组内膜厚度差异无显著性（P > 0.05）；100 d后，内皮型一氧化氮合酶转染组内膜厚度与正常细胞组无明显差异，与LacZ转染组相比较，差异显著（P < 0.05）。 结论：内皮型一氧化氮合酶基因转染抑制了种植平滑肌细胞的人工血管内膜增生。     

血管组织工程种子细胞在再生医学中的应用*☆◇

背景：小口径人工血管替代人体小动脉和静脉一直未获得满意的效果，因此研制出一种拥有较高远期通畅率的小口径人工血管成为了一个重要的研究课题。 目的：综述种子细胞在血管组织工程的研究进展。 方法：以 “Vascular tissue engineering, Seeding cells”为检索词，应用计算机检索Pubmed 数据库1960/2009有关文章。纳入有关血管组织工程种子细胞的文献。排除原始文献设计方法简单、结果可靠性差、非英文文献及结果重复的文献，保留35篇文献做进一步分析。 结果与结论：内皮细胞和平滑肌细胞是目前常用的种子细胞。内皮细胞和平滑肌细胞共同培养的体系，模拟体内环境，保持内皮细胞和平滑肌细胞具有正常的分泌功能和表型。骨髓间充质细胞可被有效的分离和扩增，在特定培养条件下可以诱导分化为多种血管细胞。在再生医学和生物组织工程方面有强大的潜力。     

脑动静脉畸形血管内皮细胞和平滑肌细胞的体外培养

目的：探讨脑动静脉畸形（AVM）内皮细胞和平滑肌细胞的分离、培养及鉴定方法。方法：手术获得脑AVM标本后,分别采用组织块贴壁法和酶消化法对脑AVM血管内皮细胞、平滑肌细胞进行培养和形态学观察,采用免疫组化分别检测培养的内皮细胞CD31抗原和平滑肌细胞SMA抗原阳性表达。结果：相差显微镜下,培养的内皮细胞呈扁平梭形,胞核椭圆居中;平滑肌细胞呈长梭形。CD31和SMA分别在两种细胞中免疫阳性表达率超过90％。结论：AVM内皮细胞、平滑肌细胞可以获取和培养增殖,为可供研究脑血管畸形血管生物学的体外模型。     

体内环境培养的小口径组织工程血管

背景：人造血管是临床组织修复领域广泛应用的重要器官,但小口径人造血管易于栓塞、难以长期保持通畅,而组织工程血管虽有永久替代作用,培养时间长,不符合血管修复的临床实际。寻找既能及时修复血管、恢复血运,又能在体内形成生物性血管保持长期通畅,是最理想的血管修复重建方法。 目的：观察以改性猪小肠黏膜下层组织为支架,在体内血流条件下培养小口径组织工程血管的可行性。 方法：自犬隐动脉分离出血管内皮细胞、平滑肌细胞,与胶原蛋白凝胶均匀混合,分别种植于小肠黏膜下层膜表面,包绕 3 mm聚乙烯管制成30个3层管状支架,植入犬股动脉缺损处进行桥接吻合为实验组;植入犬皮下组织为对照组。术后进行彩超、组织学检测评价血管的形成过程和免疫组化鉴定。 结果与结论：术后12周,实验组14个血管支架保持通畅,有明显的血管生物结构形成,种子细胞生长增殖良好,管腔有完整内皮细胞覆盖,平滑肌细胞形态、分布良好;对照组管腔结构不完整,种子细胞增殖弱,腔面无内皮细胞覆盖。结果表明通过体内组织工程技术可在血流条件下培养形成小口径组织工程血管。     

灯盏花乙素干预缺血再灌注损伤人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子与蛋白激酶Cε的表达*☆◆

背景：有关灯盏花乙素的研究多集中在神经细胞、神经元及平滑肌细胞上，但对血管内皮细胞的作用研究尚少。 目的：观察灯盏花乙素预处理后对人脐静脉内皮细胞缺血再灌注损伤后血管内皮生长因子与蛋白激酶Cε表达的影响。 方法：体外培养的人脐静脉内皮细胞，分别设立对照组，模型组和及灯盏花乙素高、中、低剂量组。将人脐静脉内皮细胞予缺氧缺糖3 h/复氧糖5或24 h；灯盏花乙素高、中、低剂量组分别加1×10-5，1×10-6，1×10-7 mol/L灯盏花乙素孵育30 min，然后予缺血再灌注处理。实验结束后取细胞裂解液用Western blot检测血管内皮生长因子、蛋白激酶Cε的蛋白表达。 结果与结论：缺血3 h再灌注5及24 h，较对照组，模型组血管内皮生长因子的表达降低，细胞颗粒部分蛋白激酶Cε的表达明显增加。灯盏花乙素能促进缺血3 h再灌注5 h人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子的表达，尤其以灯盏花乙素高剂量和中剂量组明显，但对蛋白激酶Cε的表达没有影响。     

与胶原浮胶细胞共培养中内皮细胞血管新生相关基因的表达

背景：内皮细胞和平滑肌细胞的相互调节是稳定血管壁结构的关键因素，两者共同培养能够分别影响各自的形态和功能。 目的：利用Ⅰ型胶原浮胶建立人脐静脉内皮细胞与人血管平滑肌细胞共培养体系，分析细胞之间的相互作用。 设计、时间及地点：单一样本观察，于2006-10/2008-01在复旦大学上海医学院分子生物学实验室完成。 材料：新鲜脐带取自国际第一妇婴保健医院，产妇知情同意。 方法：取新鲜脐带，利用胶原酶灌注法分离人脐静脉内皮细胞，组织块培养法分离人血管平滑肌细胞。人血管平滑肌细胞直接种植于培养板表面，人脐静脉内皮细胞种植于鼠尾Ⅰ型胶原表面制成胶原浮胶，并与培养板上的人血管平滑肌细胞共培养。以人脐静脉内皮细胞单独在浮胶底面培养，培养板表面无人血管平滑肌细胞为对照。 主要观察指标：①免疫荧光方法鉴定人血管平滑肌细胞和人脐静脉内皮细胞。光镜和电镜观察人脐静脉内皮细胞形态。②反转录-聚合酶链反应进行基因表达分析。 结果：原代培养的内皮细胞呈铺路石样形态，CD31染色阳性。原代培养的人血管平滑肌细胞免疫荧光染色α-SMA呈阳性。胶原支架上内皮细胞伸展，胶原纤维重新排列，24 h 后出现管腔样结构。在共培养体系中，人脐静脉内皮细胞的金属蛋白酶1和金属蛋白酶9基因表达量显著高于单独培养组人脐静脉内皮细胞的表达量（P < 0.05）。但层粘蛋白γ2和组织因子途径抑制物2的基因相对表达量在两组间未见明显变化。 结论：实验建立的共培养体系，可以观察到与平滑肌细胞共培养的血管内皮细胞形成更加丰富的网络状管腔样结构，更易于血管结构的形成。     

腺病毒介导hRAMP1基因转染血管平滑肌细胞的增殖和凋亡

背景：外源性受体活性修饰蛋白1基因转染可能对血管平滑肌细胞增殖调控具有重要的作用。 目的：探讨腺病毒载体介导人受体活性修饰蛋白1基因对体外培养的兔血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响。 方法：分离培养获得兔主动脉血管平滑肌细胞,分别以携带人受体活性修饰蛋白1基因的腺病毒和空腺病毒转染后,分成人受体活性修饰蛋白1组、空病毒组和对照组。 结果与结论：腺病毒转染细胞后随时间延长,报告基因绿色荧光蛋白表达逐渐增加,72 h表达最强,感染率达80%,96 h时仍有绿色荧光蛋白表达。人受体活性修饰蛋白1组的受体活性修饰蛋白1蛋白表达增加,血管平滑肌细胞凋亡率增加,细胞增殖明显抑制,与空病毒组和对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。提示人受体活性修饰蛋白1基因感染血管平滑肌细胞后明显抑制血管平滑肌细胞增殖,促进细胞凋亡。     

不同浓度细胞种植脱细胞血管基质上构建组织工程血管

摘要 背景：前期研究表明制备的脱细胞血管基质适合平滑肌细胞和内皮祖细胞生长,但是共培养模型中细胞接种密度对血管基质上细胞覆盖率的影响尚不清楚。 目的：观察不同浓度度细胞种植在脱细胞血管基质上的生长情况。 方法：采用两步法进行细胞种植,先将不同细胞浓度血管平滑肌细胞种植在脱细胞血管基质上,培养3 d后再将不同浓度内皮祖细胞接种在平滑肌细胞-血管基质复合体上,构建片状组织工程材料,分别在内皮祖细胞种植后3 d、1周时间段获取标本,扫描电镜观察细胞在材料上的生长情况。 结果与结论：血管平滑肌细胞和内皮祖细胞在脱细胞基质表面生长良好。不同浓度细胞在基质上的排布不同;提高接种的浓度有利于在材料表面快速形成致密的细胞层。提示采用两步法以合适的浓度种植细胞于脱细胞基质上,可以构建组织工程血管。 关键词：内皮祖细胞;平滑肌细胞;组织工程血管;脱细胞血管基质;种植 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.47.010     

组织工程化血管与种子细胞

摘要：血管组织工程学的目的就是在体外构建理想的血管移植物,植入体内后无免疫排异反应,能维持移植血管腔的长期通畅。临床上需要各种口径大小的血管作为手术修补材料或者其他自体或者异体甚至组织工程组织的滋养血管。文章采用了文献搜集和分析的方法,综述了血管组织工程的定义、自体血管壁细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞、内皮祖细胞和平滑肌祖细胞的选择及其在应用中的优缺点。     

骨髓种植人工血管在静脉系统血管损伤中的应用

背景：自从机械法搔刮自体静脉获取内皮细胞种植人工血管的方法获得成功后，为寻找更好的血管代用品指明了一个新的方向，但因可用的静脉较少，以致内皮细胞的数量、质量均明显不够。 目的：观察骨髓种植的人工血管应用于静脉系统后血管腔面的内皮化情况。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2007-03/2008-04在哈尔滨医科大学动物实验中心完成。 材料：新西兰大白兔8只，随机分成实验组和对照组各4只。针织涤纶双绒人工血管由美国Meadox Medicals Inc提供。 方法：实验组采用自体骨髓种植的涤纶双绒人工血管置换肾下段下腔静脉，对照组则采用单纯自体血浆预凝人工血管。术后 10 d获取人工血管标本。 主要观察指标：观察移植人工血管通畅情况；光镜下观察新生内膜厚度，电镜下观察新生内膜表面内皮化情况；放射免疫学检测血栓素A2的代谢产物水平。 结果：动物8只均进入结果分析。实验组全部移植人工血管通畅，对照组2条通畅，另外2条人工血管内充满血栓。光镜下实验组的内膜厚度明显薄于对照组(P < 0.01)；电镜发现实验组人工血管达到完全内皮化，而对照组表面则无成片内皮细胞存在。血栓素A2的代谢产物水平实验组低于对照组(P < 0.05)。 结论：骨髓种植的人工血管在静脉系统10 d时能实现人工血管腔面的快速完全内皮化，新生内皮细胞具有抑制新生内膜增生和抗血栓形成的能力。     

磷酰胆碱接枝Dacron人工血管移植后血管表面的生物相容性

背景：前期研究发现涤纶人工血管经接枝2-甲基丙稀酰氧基乙基磷酰胆碱(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine,MPC)后,可有效抑制吻合口内膜和平滑肌增生,减少吻合口狭窄程度,增加血流量。 目的：通过臭氧活化的方法在Dacron人工血管表面接枝MPC,进一步观察接枝后Dacron人工血管的生物相容性。 方法：通过臭氧活化的方法在Dacron人工血管表面接枝MPC,修建成5 mm×2 mm的椭圆形补片。取新西兰大白兔24只,阻断其腹主动脉,纵形切开腹主动脉前壁,以抽签法随机分为两组：实验组将接枝后的Dacron人工血管作新西兰兔腹主动脉补片移植,对照组移植未接枝Dacron人工血管作对照。于术后1 d,1周,2周,4周,进行人工血管苏木精-伊红、Masson染色及扫描电镜观察Dacron人工血管表面内膜增生、血细胞黏附情况。 结果与结论：与对照组比较,实验组新内膜增生明显减少,由于Dacron人工血管表面的不平整,未能进行新内膜增生厚度的测量。术后第2周,通过Masson染色在对照组人工血管补片表面观察到新内膜的分层,底层多量细胞浸润,浅层细胞浸润不明显;而实验组未见明显分层现象或者也出现了分层,但底层较薄,附着在Dacron人工血管表面而不明显,这现象持续到术后的第4周。证实在Dacron人工血管补片表面接枝MPC,有效抑制了早期补片表面血栓形成,抑制炎症细胞的浸润,抑制纤维蛋白原的沉积,使早期的新内膜增生减少,较接枝前有更好的生物相容性。     

骨髓间充质干细胞定向分化为心脏瓣膜构成细胞及鉴定

背景：心脏瓣膜的组成成分中不是只有内皮细胞发挥作用,成纤维细胞、平滑肌细胞等均参与心脏瓣膜基质成分构建。 目的：建立可以在体外获得大量内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞的简便方法,并对获得细胞进行形态观察及表面标志鉴定。 方法：全髓贴壁法获取大鼠原代骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增,第3代细胞在特定条件下分别向内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞方向诱导分化,每日于倒置显微镜下观察细胞生长情况,并对诱导分化的细胞行免疫细胞化学检测。 结果与结论：骨髓间充质干细胞在特定条件下诱导培养后,诱导后的细胞分别具有内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的特点。提示骨髓间充质干细胞在体外可以定向分化为内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞。     

心血管支架与支架置入后的血管快速内皮化

血管支架已被广泛应用于临床治疗心血管疾病,但由此产生的并发症也日益显露出来,支架置入后血管内皮化是影响支架材料与人体生物相容性的关键因素。支架置入后血管内皮功能异常,引发内皮层剥脱,导致血小板聚集、炎症反应、血管平滑肌细胞增殖迁移、细胞外基质形成等一系列病理反应,造成支架内再狭窄,因此促进血管内皮细胞损伤、修复及功能改变在支架内再狭窄中起着重要作用。为了进一步了解所选用的支架置入人体后如何发生快速的血管内皮化反应及寻找如何解决支架置入后血管内皮化的途径,文章通过检索大量文献,来对支架置入后的快速血管内皮化进行探讨分析,以寻求较好的解决途径。     

组织工程化类金刚石膜复合材料与人血管内皮细胞的相容性研究

目的：验证纳米相类金刚石薄膜复合材料与人血管内皮细胞相容性,为组织工程化机械瓣膜材料的构建提供依据。 方法：利用脉冲激光沉积法在人工心脏机械瓣膜上沉积纳米相类金刚石薄膜,将人脐静脉血管内皮细胞与纳米相类金刚石薄膜复合材料体外复合培养。倒置显微镜及扫描电镜观察细胞在材料表面的生长、附着情况;MTT 法检测细胞在材料上增殖情况;同时分别测定人脐静脉血管内皮细胞在类金刚石薄膜材料和空白对照组中一氧化氮及前列环素分泌水平,以评价其活性。 结果：人脐静脉血管内皮细胞能在纳米相类金刚石薄膜复合材料上良好地黏附、增殖、生长。人脐静脉血管内皮细胞分泌一氧化氮和前列环素水平在类金刚石薄膜材料和空白对照组没有显著性差异(P > 0.05),说明纳米相类金刚石薄膜材料对人脐静脉血管内皮细胞的活性没有影响。 结论：纳米相类金刚石薄膜复合材料具有良好的细胞相容性,有可能作为组织工程化机械瓣膜材料。     

Azathioprine and 6-mercaptopurine alter the nucleotide balance in endothelial cells

Graft vascular disease after solid organ transplantation is a main complication that limits long-term survival of the graft. An injury of the endothelium and subsequent vascular response is considered to be responsible for smooth muscle cell hyperplasia with resulting luminal narrowing. What is less certain are the precise steps leading to endothelial injury and subsequent vessel disease. Since the immunosuppressive drug azathioprine is in clinical use due to its antiproliferative effect on lymphocytes, we were interested in how far it exerts effects on the vascular endothelium. Azathioprine and its metabolite 6-mercaptopurine, a potent inhibitor of purine salvage pathway enzymes, dose dependently led to decreased endothelial cell proliferation as well as to decreases in intracellular purine nucleotides adenosine-triphosphate and guanosine-triphosphate. By increasing the formation of the pyrimidine nucleotide uridine-triphosphate within 24 hours, azathioprine and its metabolite altered the endothelial nucleotide balance. Since not only the formation of toxic thio- and methylthiopurines (thio-guanosine-monophosphate, methyl-thio-inosine-monophosphate) was measured, the activity of the enzyme thiopurinemethyltransferase was induced (3.21+/-2.04 U per 10(9) cells, mean+/-SD). These findings indicate that the vascular endothelium plays an active role in the metabolization of the established immunosuppressant azathioprine that then exerts specific toxic effects on endothelial cells.