甲状腺癌组织差异表达cDNA消减文库的构建与鉴定

目的 :应用抑制性消减杂交技术 ,构建人甲状腺癌与正常甲状腺差异表达的cDNA消减文库。方法 :分别从甲状腺癌及正常甲状腺组织中提取总RNA ,应用高效、灵敏的抑制性消减杂交技术 ,构建成功cDNA消减文库 ,再转染大肠杆菌进行文库扩增。结果 :构建成功具有高消减效率的人甲状腺癌组织cDNA消减文库 ,文库扩增得到了 4 0 0个克隆 ,随机挑取 5 0个制备质粒 ,酶切分析均得到 5 0～ 4 0 0bp大小插入片段 ,这些片段可能就是载有高度特异性的目的片段 ,结论 :人甲状腺癌组织cDNA消减文库的建立为进一步克隆甲状腺癌特异性表达的新基因奠定了基础。     

肿瘤敏感相关基因克隆cDNA消减文库的构建

目的：烷堪磷脂类化合物（十六烷基磷酸胆碱，HePC)诱导人上皮性肿瘤细胞系产生交叉耐药。方法：用抑制消减杂交技术。构建KB和KBrcDNA消减文库，KB为testercDNA与过量的KBrcDNA消减杂交，非特异性cDNA片段被有效消减，特异表达的文库得到富集。结果：扩增后得到127个克隆。挑取质粒，酶切分析均得到400-800bp插入片段，在获得可分析的78个克隆中，27%没有同源基因挑取质粒，酶切分析均得到400-800bp插入片段，在获得可分析的78个克隆中，27%没有同源基因片段或同源性很低，暂定为“新基因”；14%具有染色体明确定位，应该认为是化疗敏感肿瘤KB细胞所特有的cDNA片段；19%在人类EST文库MGC和CGAP中出现，可能是肿瘤细胞所特有基因；发现与耐药性相关的已知功能基因高达40%。结论：探索伴随肿瘤细胞耐药发生基因丢失。以开拓抗性逆转措施的新途径。     

应用抑制性消减杂交技术克隆人肺鳞癌差异性表达基因

目的 克隆人肺鳞癌肿瘤差异性表达基因。方法 应用抑制性消减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH)构建人肺鳞癌cDNA消减杂交文库，筛选后挑选阳性克隆进行测序，并在Gen Bank数据库中进行同源性比较，最后经RT－PCR验证。结果 成功克隆10个差异基因片段，其中2个为新基因（GenBank登录号分别为：C20：AF363068；C34：AY032661）。结论 抑制性消减杂交技术是克隆差异表达基因及发现新基因的有效方法。     

哈萨克族食管癌差异表达基因的研究

 目的 筛选并克隆在哈萨克族食管鳞癌与正常食管组织之间差异表达的基因。方法 (1)应用抑制性消减杂交(SSH)进行基因差异表达分析，构建哈族食管鳞癌组织和正常食管黏膜组织之间差异表达的cDNA消减文库；(2)克隆、鉴定食管癌组织特异表达的基因；(3)登录Genbank．运用Blastn程序进行同源性分析。结果 成功构建了消减效率高的哈族食管鳞癌cDNA消成文库．对其中6个克隆的插入cDNA片断进行测序，经检索Genbank表明：这些差异表达基因与跨膜受体、乳腺癌转录因子、蛋白剪接基因及染色体1、8不同区域有较高的同源性。结论 通过抑制性消减杂交技术构建了哈族食管鳞癌cDNA消减文库，并分析鉴定了部分差异表达基因，为进一步筛选鉴定食菅鳞癌特异性基因及其全长克隆、功能研究等提供了依据。     

肿瘤敏感相关基因克隆cDNA消减文库的构建

目的 :烷基磷脂类化合物 (十六烷基磷酸胆碱 ,HePC)诱导人上皮性肿瘤细胞系产生交叉耐药。方法 :用抑制消减杂交技术 ,构建KB和KBrcDNA消减文库。KB为testercDNA与过量的KBrcDNA消减杂交 ,非特异性cDNA片段被有效消减 ,特异表达的文库得到富集。结果 :扩增后得到 12 7个克隆 ,挑取质粒 ,酶切分析均得到 4 0 0～ 80 0bp插入片段。在获得可分析的 78个克隆中 ,2 7%没有同源基因片段或同源性很低 ,暂定为“新基因” ;14 %具有染色体明确定位 ,应该认为是化疗敏感肿瘤KB细胞所特有的cDNA片段 ;19%在人类EST文库MGC和CGAP中出现 ,可能是肿瘤细胞所特有基因 ;发现与耐药性相关的已知功能基因高达 4 0 %。结论 :探索伴随肿瘤细胞耐药发生基因丢失 ,以开拓抗性逆转措施的新途径。     

抑制性消减杂交构建肺腺癌及同源正常组织cDNA文库

目的：分离肺腺癌及同源正常组织中的未知特异性基因片段，并建立相应的cDNA文库，为研究肿瘤基因疫苗打下良好的基础。方法：从肺腺癌及同源正常组织中分别提取总RNA，磁珠分离mRNA并逆转录为dsDNA，经RasI消化酶切将Adaptor-1和Adaptor-2R适配子分别与肺腺癌消化后的cDNA连接（作为tester），再与正常同源组织（作为driver）进行正向杂交和逆向杂交。具有上述2种不同适配子的杂交后cDNA分子，通过初次PCR和巢式PCR富集未知的cDNA片段，此PCR产物与TA克隆载体pGEM连接，转化Top10大肠杆菌，获得白色菌落并经菌液PCR扩增出未知基因片段。结果：经正向抑制性消减杂交和逆向抑制性消减杂交分别获取了肺腺癌组织及同源正常组织的特异性cDNA文库。结论：抑制性消减杂交是一种快速、方便、有效的建立cDNA文库的方法。     

K562细胞消减cDNA文库的构建及初步鉴定

背景与目的:消减杂交技术是一种寻找和克隆差异基因的方法。本研究目的是通过快速、高质量构建消减cDNA文库,筛选K562细胞中差异表达基因。方法:以用限制性显示(restriction display,RD)技术制备的K562细胞cDNA片段作为消减对象,以正常人淋巴细胞的Sau3AⅠ酶解cDNA片段对其进行消减。经过消减后的RD片段被分组扩增出来,并克隆于T载体中,挑选阳性克隆进行测序并进行初步分析。结果:构建的K562细胞消减cDNA文库,包含360个阳性克隆,插入片断大小范围在200～800bp之间,选取50个克隆进行测序分析,结果为来源于42个已知基因。结论:利用自行建立的消减杂交法,成功构建了特异性K562细胞消减cDNA文库,文库质量可靠,可用于进一步筛选及克隆K562细胞中差异表达基因。     

在肝母细胞瘤中筛选XTP6的反式调节基因及其意义

目的: 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建XTP6反式激活相关基因差异表达的cDNA文库,筛选XTP6蛋白反式激活相关基因.方法: 构建XTP6真核表达载体pcDNA3.1(-)-XTP6,并将其转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;48h后收获细胞后提取mRNA并逆转录成cDNA,tester cDNA经RsaI酶切消化后分成两组,分别与两种不同接头衔接,再与过量的driver cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR反应,第二次PCR产物与pGEM-Teasy克降载体连接,构建cDNA消减文库,转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR鉴定后进行测序及同源性分析.结果: 成功构建人XTP6蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA文库.扩增后得到70个200-1000bp插入片段的克隆,随机挑选其中20个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得11种已知功能编码基因.结论: 筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞周期调节、生物代谢和炎症修复密切相关的蛋白编码基因.     

nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株抑制消减cDNA文库的构建

背景与目的 已有的研究表明,nm23-H1基因是一个重要的肺癌转移抑制基因,为了筛选与该基因表达相关的差异表达基因.本研究拟构建nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)差异表达基因的抑制消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆与nm23-H1转移相关的基因奠定基础.方法利用抑制消减杂交(suppressive subtractive hybridization,SSH)技术构建nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)间差异表达基因的正向和反向消减cDNA文库,经蓝白菌落筛选克隆,并PCR反应鉴定.结果 成功构建了该两株细胞株差异表达基因的正向和反向消减cDNA文库.经蓝白菌落筛选,正向消减文库总共获得约300个白斑克隆,反向消减文库总共获得约400个白斑克隆,从正反向消减文库中各挑选96个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段,结果显示在挑选的正向文库中有84个克隆有插入片段,反向文库中有83个克隆有插入片段.其片段大小范围为(300-750)bp.结论 抑制消减杂交是克隆差异表达基因的有效方法,我们应用SSH法和T/A克隆技术成功建立了nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)差异表达基因的抑制消减cDNA文库.nm23-H1基因在肺癌细胞中的表达可能影响某些转移相关基因的差异表达.     

人胃印戒细胞癌组织差异表达基因克隆的研究

目的：分离胃印戒细胞癌组织差异表达基因。探讨人胃印戒细胞癌发生的分子机制。方法：采用抑制性消减杂交技术(SSH)．构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库；随机挑选部分阳性克隆测序，与GenBank中的已知序列进行基因同源性分析，并进一步探讨基因功能。结果：成功构建高消减效率的人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库，并分离出多个差异表达基因片段：其中1条与染色体序列相似，可能代表未知的新基因序列，已被GenBank接收(注册号：CN446913)；其他多为已知的肿瘤相关基因的部分片段。结论：1)SSH技术是分离差异表达基因的有效方法；2)胃印戒细胞癌的发生发展与多种基因表达异常有关。     

人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因消减cDNA文库的构建和初步筛选

背景与目的 筛选肺癌转移相关基因有助于阐明肺癌侵袭转移的分子机理.为了筛选不同转移潜能肺癌的转移相关差异表达基因,本研究构建不同转移潜能的人大细胞肺癌细胞株NL9980和L9981间差异表达基因的消减cDNA文库,并对消减文库进行初步筛选.方法 应用抑制消减杂交技术构建人大细胞肺癌高低转移株NL9980与L9981间差异表达基因的正向消减cDNA文库和反向消减cDNA文库,利用α互补原理,经蓝白菌落初步筛选获得阳性克隆,应用斑点杂交的方法对正向和反向消减cDNA文库进行杂交筛选.结果 成功构建了人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因的正向消减cDNA文库和反向消减cDNA文库.经蓝白菌落筛选和斑点杂交,正向消减文库获得了307个阳性克隆,反向消减文库获得了78个阳性克隆.结论 抑制消减杂交是克隆差异表达基因的有效方法,利用此方法可以成功构建人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因消减cDNA文库.不同转移潜能人大细胞肺癌细胞株中存在可能与转移相关的差异表达基因.     

高淋巴系统转移能力小鼠肝癌细胞株差异表达基因的筛选

目的 筛选高淋巴系统转移能力小鼠肝癌细胞株差异性表达基因。方法 应用抑制性消减杂交(SSH)技术,构建高淋巴系统转移能力小鼠肝癌细胞株Hca-F及其同源低转移细胞系Hca-P的cDNA消减杂交文库,筛选阳性克隆进行测序,并在GenBank数据库中进行同源性比较。结果 成功克隆10个差异基因片段,其中2个为新基因。结论 SSH技术是克隆差异表达基因及发现新基因的有效方法。     

高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞间抑制性消减杂交文库的建立

目的:以抑制性消减杂交技术分离高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞HcaF和HcaP间差异表达的基因。方法:采用抑制性消减杂交技术,以高低转移力小鼠肝癌细胞HcaF为检测子,以低转移力HcaP细胞为驱赶子,分离高转移力癌细胞中高表达的基因的cDNA片段。将差异表达基因的cDNA片段插入T/A克隆载体,并通过热转化的方法转化大肠埃希菌DH5α,建立了高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞间抑制性消减杂交文库。以菌液PCR的方法检测随机挑选的白色菌落中插入片段的出现频率。提取14个重组质粒进行序列分析。结果:在消减文库中共获800个白色菌落,对随机挑选的160个白色菌落进行菌液PCR扩增,发现95%的白色菌落中含有100～700bp的插入片段。对重组质粒的序列分析和同源性比对发现,所获的14个序列中3个为已知基因,分别来自小鼠热休克蛋白、ribosomalproteinS13、ethanolinduced6基因;4个可能来源于新基因;3个与3个不同的EST同源。结论:成功构建了高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞间抑制性消减杂交文库,为今后高通量筛选癌淋巴道转移相关基因,奠定了坚实的基础。     

人胃印戒细胞癌组织差异表达基因克隆的研究

目的:分离胃印戒细胞癌组织差异表达基因,探讨人胃印戒细胞癌发生的分子机制。方法:采用抑制性消减杂交技术(SSH),构建人胃印戒细胞癌组织cDNA 消减文库;随机挑选部分阳性克隆测序,与GenBank中的已知序列进行基因同源性分析,并进一步探讨基因功能。结果:成功构建高消减效率的人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库,并分离出多个差异表达基因片段:其中1 条与染色体序列相似,可能代表未知的新基因序列,已被GenBank 接收(注册号:CN446913);其他多为已知的肿瘤相关基因的部分片段。结论: 1 )SSH技术是分离差异表达基因的有效方法;2)胃印戒细胞癌的发生发展与多种基因表达异常有关;     

正常肝组织与肝硬化组织差异表达基因的削减cDNA文库的构建及差异基因的初步筛选

目的构建人正常肝组织与肝硬化组织差异表达基因的削减cDNA文库.方法采用抑制削减杂交技术,以正常肝组织及有肝癌背景的肝硬化组织作为对比材料.分离出mRNA,经反转录后,通过两轮杂交、两次PCR和T/A克隆构建了两种组织间差异表达基因的cDNA削减文库.结果挑取70个克隆进行酶切和PCR鉴定,显示65个克隆有250～2000 bp插入片段.结论用SSH和T/A克隆技术成功构建了正常肝组织与肝硬化组织差异表达基因的削减cDNA文库.该文库的建立为进一步筛选、鉴定出肝癌发生过程中的相关调控基因奠定了基础,也有助于阐明肝硬化在肝癌发生过程中所起的作用.     

鼻咽癌组织差异表达cDNA序列的克隆与鉴定

目的：分析鼻咽癌组织中的差异基因,寻找与鼻咽癌病理过程相关的新的癌基因的抑癌基因。方法：应用抑制性消减杂交法,构建了鼻咽组织与正常鼻咽组织的消减库;用差异筛选技术筛选出阳性克隆;用Southern blot和Northern blot杂交证实了阳性克隆的可靠性,用序列分析确定了阳性克隆的性质。结果：从消减库中获得了12个阳性克隆;序列分析表明,8个克隆与已知基因高度同源,2个为新的候选基因,2个新的候选基因在两个不同的消减库中确实存在差异,而其中的一个新基因在鼻咽癌组织和细胞系中下调表达。结论：抑制性消减杂交是分析相关基因的较好的方法,发现了两个与鼻咽癌病理过程有关的新的cDNA。     

应用抑制消减杂交技术筛选人肾癌差异表达新基因

背景与目的：认识肾癌差异表达基因有助于阐明肾癌发生,发展的分子机制。但至今有关肾癌差异基因尤其肾癌特异相关基因的研究仍不令人满意,本实验应用抑制消减杂交技术筛选入肾癌组织与正常肾组织间差异表达的新基因,以期克隆出新的肾癌特异相关基因。方法：以肾癌组织mRNA为检测对象（Tester)。正常肾组织mRNA为驱赶者（Driver)。构建cDNA消减文库,随机挑取文库克隆进行酶切及测序,所得结果在GenBank中做同源性比对分析。对感兴趣的片段进行电子定位确定其在染色体的位置,用Northern blot,半定量RT-PCR方法检测新基因在肾癌组织与正常肾组织中的差异表达。结果：文库包含414个阳性克隆;随机挑取280个克隆提取质粒并酶切分析,其中265个有插入片段;将其中80个克隆进行测序,初步显示28、158、170、249号4个克隆为新基因片段,电子定位表明上述4个基因分别位于染色体21q^22,4q^15.3,9q^34,22q^11.2。已在GenBank中登录（BM181083,BI784487,BI863835,BI863386）,对其中28、170号克隆用Northern杂交,半定量RT-PCR检测,证实新基因在肾癌组织中表达较正常肾组织显著增高。结论：抑制消减杂交技术是筛选,克隆肾癌差异表达新基因的有效手段;筛选到的新基因片段为进一步克隆其全长,研究基因功能提供了实验基础。     

人前列腺癌高低转移细胞株差异表达基因的筛选

目的：筛选高低转移能力人前列腺癌细胞株PC3M-1E8和PC3M-2B4间差异表达基因。方法：应用抑制性消减杂交（SSH）技术,对高转移能力人前列腺癌细胞株PC3M-1E8及其同源低转移细胞株PC3M-2B4进行2次消减杂交,第1次SSH实验,以PC3M-2B4细胞株为实验方,PC3M-1E8株为驱动方,构建正向消减文库。第2次实验则以PC3M-1E8株为实验方,PC3M-2B4为驱动方,构建反向消减文库。筛选出来的阳性克隆进行测序,并在GeneBank数据库中进行同源性比较后从中选取若干序列进行实时定量PCR验证。结果：2个消减文库共得到238个阳性克隆,从中各随机选取8个克隆测序并进行同源性分析,发现其中12条序列来自于11个已知基因,另外4条序列为新的未知功能的基因序列标签（EST）。结论：成功构建了高低转移力人前列腺癌细胞株的双向消减杂交文库。     

应用mRNA差异显示技术克隆甲状腺癌相关基因

目的：筛选并克隆甲状腺乳头状癌、甲状腺未分化癌与其正常甲状腺组织之间差异表达的基因。方法：应用mRNA差异显示技术克隆与鉴定出差异的cDNA片断，并对其进行NCBI GenBank数据库同源性检索。结果：成功亚克隆出8个基因片段，进行GenBank数据库同源性检索，这些基因可能与甲状腺癌的发生相关，尤其在甲状腺未分化癌及乳头状癌中均见与LMAN1基因同源的差异带，提示LMAN1基因很可能为甲状腺癌相关基因。结论：获得的差异表达片段为进一步克隆甲状腺癌相关基因及功能研究奠定了良好的基础。     

人源性食管鳞癌cDNA文库的构建及鉴定

目的:构建人源性食管鳞癌cDNA噬菌体表达文库。方法:从人食管鳞癌组织中提取总RNA并分离纯化mRNA,用RT-PCR合成cDNA单链,LD-PCR扩增双链cDNA,除去<500bp的小片段,与载体λTriplEx2噬菌体左右臂连接,经体外包装即构成全长cD-NA噬菌体表达文库。转化E.coliXL1-Blue感受态细胞,测定文库的滴度,确定文库的容量大小,用蓝白筛选测定文库的重组率,PCR鉴定cDNA插入片段的大小。结果:构建的人源性食管鳞癌cDNA噬菌体表达文库滴度为1.64×106pfu/mL,重组率为98.6%,cDNA插入片段的大小为0.7～2.5kb,平均长约1.5kb。结论:成功构建1个人源性食管鳞癌cDNA噬菌体表达文库,适合于大批量筛选cDNA克隆的食管鳞癌肿瘤抗原基因。