人整合素分子α4亚基片段的克隆及大肠杆菌的表达

目的 克隆并原核表达α４亚基笥段。方法 从ＩＬ－６细胞系中提取总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ方法分两段扩增人整素分子α４亚基片段２．０ｋｂ ｃＤＮＡ,将两片段连接,并将其中的１．７ｋｂ基因片段亚克隆至表达载体ＰＧＥＸ－ＫＧ中,ＩＰＴＧ诱导表达。结果 ＲＴ－ＰＣＲ扩增并克隆了α４的两段ＣＤＮＡ,序列分析表明：与文献报道的μ４ＣＤＮＡ序列基本一致。两片段成功连接后将其中的１．７ｋｂ亚克隆至表达载体ＰＧＥＸ－     

人整合素分α４亚基片段的克隆和表达

目的 克隆并表达人整合素分子α４亚基１.2kbcD-NA片段。方法 从ＨＬ－６０细胞系中提取总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ法扩增人整合素分子α４亚基片段１.2kbcDNA(1753-2934bp),并将该片段亚克隆至表达载体pGEX-3X,用ＩＰＴＧ诱导表达。结果 克隆了α４亚基１.2kbcDNA片段。序列分析表明。其所编码的氨基酸序列与文献相比较只有一处错义突变（Ａrg→Ｇln),经分析突变对抗原性影响不大。将该片段亚克隆至表达载体pGEX-3X,经ＩＰＴＧ诱导在大肠杆菌中获得高效表达。结论 获得了α４亚基１.2kbcDNA片段及其原核表达产物。对研究α４整合素的功能具有重要意义。     

人整合素β3亚基真核表达载体的构建及αIIbβ3在细胞表面的表达

目的 :构建人整合素 β3亚基真核表达载体 ,并探讨如何使人整合素αIIbβ3在CHO细胞表面有效表达 ,为进一步研究整合素β3亚基作为汉坦病毒 (hantavirus,HV)受体的特异性奠定基础。方法 :构建编码人整合素 β3真核表达载体 pcDNA3.1 β3。将其与编码人整合素αIIb亚基真核表达载体 ,分别及共转染至中国仓鼠卵巢 (Chinahamsterovary ,CHO)细胞中进行表达。采用间接免疫荧光法 (IFA)检测外源基因的表达。结果 :共转染组目的蛋白呈高效的细胞膜表达。pcDNA3.1 β3单独转染组 β3亚基在细胞膜的表达较共转染组弱 ;而pBJ1 αIIb单独转染组则未见有效的细胞膜表达。结论 :人整合素αIIbβ3在CHO细胞表面的有效表达需要两个亚基共同参与。     

人整合素β3亚基真核表达载体的构建及αIIbα3在细胞表面的表达

目的：构建人整合素β3亚基真核表达载体，并探讨如何使人整合素αIIbβ3在CHO细胞表面有效表达，为进一步研究整合素β3亚基作为汉坦病毒(hantavirus，HV)受体的特异性奠定基础。方法：构建编码人整合素β3真核表达载体pcDNA3．1—β3。将其与编码人整合素αIIb亚基真核表达载体，分别及共转染至中国仓鼠卵巢(China hamster ovary，CHO)细胞中进行表达。采用间接免疫荧光法(IFA)检测外源基因的表达。结果：共转染组目的蛋白呈高效的细胞膜表达。pcDNA3．1—β3单独转染组β3亚基在细胞膜的表达较共转染组弱；而pBJ1—αIIb单独转染组则未见有效的细胞膜表达。结论：人整合素αIIbβ3在CHO细胞表面的有效表达需要两个亚基共同参与。     

人整合素分子β7亚基片段的表达鉴定及多抗制备

目的 在大肠杆菌中高效表达人整合素分子β７片段并制备多抗。方法 ＤＮＡ重组法构建表达质粒,经ＩＰＴＧ诱导在大肠杆菌中获高效表达。表达产物经免疫印迹鉴定后,用８ｍｏｌ／Ｌ尿素溶解包涵体,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ纯化,免疫家兔获得多抗。结果 β７片段在大肠杆菌中训效表达。表达产物以包涵体形式存在。免疫印迹鉴定为目的蛋白。多抗效价达１：１０２４００。结论 制备了抗β７的多抗,对β７整合素的功能研究有重要意义。     

整合素亚基α6、α4、αv、β1、β3在小鼠心脏发育过程中的作用

目的：观察小鼠胚胎发育过程中整合素亚基α6、α4、αv、β1、β3在心脏中的表达，探讨整合素亚基(α6、α4、αv、β1、β3在小鼠心脏发育过程中的作用。方法：取孕9—16天的ICR小鼠胚心脏，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，用免疫组化的方法观察整合素亚基α6、α4、αv、β1、β3的蛋白表达情况，     

α5和β1整合素亚基在肺腺癌细胞系凋亡中的作用

整合素作为细胞外基质蛋白(ECM)的受体,参与细胞的生长、增殖及凋亡的调节。当其被ECM激活后,则可刺激细胞产生生存信号并抑制细胞凋亡。如果整合素与ECM的结合导致细胞内原癌基因的持续激活,肿瘤细胞则可不需要黏附于ECM而生长,因此,其与肿瘤细胞的侵袭性生长及转移等密切相关[1]。为探讨α5、β1整合素亚基对体外培养的人肺腺癌细胞系GLC-82凋亡的作用,研究中我们以α5、β1整合素亚基,观察了GLC-82细胞的凋亡。1材料和方法1.1材料人肺腺癌细胞株GLC-82引自中国医学科学院肿瘤研究所。鼠抗人抗α5整合素亚基mAb1956Z购于CHEMI…     

实验性变态反应性神经炎中整合素α6β4的表达及意义

目的 研究实验性变态反应性神经炎(EAN)中整合素α6β4的mRNA表达变化,探讨α6β4与许旺细胞功能状态的关系,以及其表达变化与髓鞘损伤和修复过程的关系。方法 建立Lewis大鼠EAN动物模型,取18只模型鼠坐骨神经,用原位杂交和半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测模型的不同时期Lewis大鼠神经局部的整合素α6β4表达,以正常鼠(3只)为空白对照。结果 原位杂交结果表明在EAN的发病过程中,α6的表达未见明显变化,而β4的表达在急性期明显减弱,恢复期或后期逐渐恢复。β4表达减弱主要体现为阳性信号的稀疏而不反映为单个信号的量的变化。以GAPDH为内参照,对整合素α6β4的mRNA水平做半定量分析,结果显示：EAN病变过程中,α6的mRNA表达变化不明显,而β4的mRNA呈现早期减少后期逐渐恢复进而高于正常的变化过程。结论 炎症因素造成了许旺细胞变性损伤,影响其整合素的表达,许旺细胞出现了与胚胎发育过程类似的表型转换。从这个意义上,可以把α6β4看作许旺细胞分化状态的一个标志,至少可以看作是标志EAN病变过程的一个重要分子。α6β4表达变化与髓鞘的损伤和修复过程密切相关。     

人TLR4胞外区cDNA克隆及其酵母表达载体的构建

研究表明：TLR4是哺乳动物LPS作用的受体，介导LPS的生理和病理效应[1～3］。有关研究取得明显的进展，但对于其识别的配体目前还未阐明。新近发现并广为应用的酵母双杂交技术给上述研究提供了新的机遇。因此，本研究克隆TLR4胞外区cDNA，并构建酵母双杂交系统的靶基因，为进一     

人FcεRIα亚基的细胞外区的克隆表达和抗血清的制备及功能

为获得有生物活性的FcεRIα亚基细胞外区及多克隆抗体 ,并探知其功能 ,构建FcεRIα亚基的细胞外区的原核表达载体PBAD/gIIIA/FcεRIα,经表达、纯化后用斑点杂交法检测其活性。纯化制品免疫兔子获得抗血清 ,并研究抗血清对FcεRI的作用。结果发现 ,经原核表达出的FcεRIα亚基的细胞外区能与IgE结合 ;获得具有特异性抗FcεRI的抗血清 ,可能抑制嗜碱粒细胞脱颗粒。实验提示原核表达系统能产生有生物学活性的FcεRIα亚基的细胞外区 ,用其制备的抗血清能够识别FcεRIα亚基的细胞外区 ,可能抑制嗜碱粒细胞脱颗粒 ,为研究FcεRIα表达调节、对其的封闭作用及研究过敏性疾病的发病机制奠定物质基础     

胃癌高表达cDNA片段W41的克隆及组织表达谱分析

目的：从人胃癌组织中克隆新的相关易感基因。方法：利用cDNA末端快速扩增PCR技术得到了扩增片段，将其克隆、核苷酸序列分析，并将序列在GenBank进行同源性比较。利用Northern杂交、多组织Northern及基因表达系列分析了所得基因片段的组织表达谱。结果：获得1条533bp带有poly(A)尾的cDNA片段，可见加尾信号AATAAA，与GenBank基因数据库同源比较，该序列未见与任何已知基因同源，登录GenBank(登录号为AF325202）。该序列在胃癌组织的表达强度高于对应正常组织，多组织Northern及基因表达系列分析表明该序列在多种肿瘤组织中高表达，在正常组织中表达减弱。结论：得到了1条与胃癌可能相关的新的cDNA序列。     

人黄体松弛素原基因的克隆及在大肠杆菌中的初步表达

为了加速我国基因工程高技术药物的研制，开发新型、具有生物活性功能的人重组松弛素原，利用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术从人黄体组织克隆了松弛素原的编码基因，包括Ｂ和Ａ链以及连接肽（Ｃ肽）。克隆的松弛素原基因进行序列测定后，再亚克隆到原核表达载体ＬＫＢ２，转化大肠杆菌ＢＬ２１，用ＩＰＴＧ诱导表达。结果表明，克隆的松弛素原基因与已发表的基因序列相同，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示表达蛋白的分子量为２０ｋＤ，为可溶性蛋白，占菌体蛋白的３０％。     

两种人乳腺珠蛋白基因亚型cDNA的克隆及其原核表达

目的 克隆hMAM编码全长cDNA，建立hMAM蛋白原核表达系统及其纯化方法，为进一步研究hMAM的结构、功能及其在乳腺癌免疫诊断中的应用奠定工作基础。方法自乳腺癌组织和乳腺癌细胞株MD-MB453提取总RNA，通过RT-PCR克隆hMAMcDNA，构建pGEX-KG-hMAM表达质粒，在大肠杆菌BL1中表达，鉴定表达产物的形式后建立目的蛋白的纯化方法。结果乳腺癌组织和乳腺癌细胞株中发现两种hMAMcDNA亚型：hMAM和hMAM(Isofornl)，长度分别为279和270bp，二者相差9个连续碱基，其翻译产物相差3个连续氨基酸残基；GST-hMAM蛋白在本原核表达系统中以不溶性包涵体形式存在，通过改良的纯化方案可以获得纯化的复性蛋白。结论获得hMAMcDNA并发现一个新的hMAM突变体；hMAM可在pGEX-KG中与GST融合，实现高效表达；通过本法建立的改良的纯化流程，可获得纯度达96．5％的hMAM的两种融合蛋白，为进一步研究两种亚型hMAM的结构、功能及其在乳腺癌免疫诊断中的应用奠定了工作基础。     

人野生型p53 cDNA的克隆、表达和意义

目的：为探讨肿瘤细胞ｗｔ ｐ５３蛋白功能失活机制的研究,检测肿瘤患者血清抗ｐ５３抗体辅助临床诊断提供人ｗｔ ｐ５３蛋白。方法 将人ｗｔ ｐ５３基因ｃＤＮＡ片段插入到大肠杆菌表达载体ｐＱＥ－３０中,得到重组表达质粒ｐＱＥ３０－ｐ５３,用ｐＱＥ３０－ｐ５３重组质粒转化大肠杆菌Ｍ１５细胞,转化菌落经ＰＣＲ扩增和ＢａｍＨⅠ、Ｘｂａ Ｉ酶切证实ｐ５３基因插入。ＩＰＴＧ诱导大肠杆菌表达ｗｔ ｐ５３蛋白,通过Ｎ     

人白细胞介素-21 cDNA克隆及其在大肠杆菌系统的表达

目的：克隆人细胞因子IL-2l全长cDNA及其在大肠杆菌中表达，并进一步检测其表达产物的功能。方法：抽取外周血，分离淋巴细胞；抗CD3抗体刺激后，提取总RNA，通过RT-PCR获得两个部分重叠的IL-21 cDNA片段(分别为5′端242bp，3′端425bp)，重组PCR扩增出IL-21全长cDNA：DNA测序正确后，将成熟IL-21 cDNA的编码框序列构建到原核表达载体pET28a( )中。卡那霉素平板筛选及PCR鉴定，挑出阳性克隆进行扩增、转化大肠杆菌进行IPTG诱导表达：SDS—PAGE、Western blotting鉴定，亲和层析分离纯化得到M，为18600的带有组氨酸标签重组人IL-21融合蛋白。透析法重折叠复性，MTT法测定其对T细胞增殖活性。结果：成功获得人IL-21全长cDNA，并以包涵体形式表达于大肠杆菌中。重折叠后的rhIL-21融合蛋白具有与抗CD3抗体共刺激T细胞增殖作用。结论：获得具有生物学活性的rhIL-21细胞因子，为进一步研究其功能奠定基础。     

人肺癌中OPB7-1 cDNA片段的克隆定位

目的：寻找肺腺癌发生及转移的相关基因，探讨肺癌发生发展的分子机理。方法：应用细胞培养、逆转录－PCR、RH基因定位及RNA原位杂交方法研究确定肺癌相关基因。结果：OPB7－1 cDNA片段，经RH基因定位方法定位于1p31-1p34。在正常人肺cDNA文库、低转移能力肺腺癌细胞系AGZY83－a cDNA中存在的片段大小一致，但序列中存在个别碱基的差别。OPB7－1 cDNA片段（974bp）与GenBank中已知序列同源性差，但与其有同源性的3个毗连群克隆均位于1号染色体上（1p31-1p34）。24例临床病例分析发现，该片段在肺癌组织中均有不同程度的表达，在正常对照组织中未见明显表达，且在有淋巴结转移病例的肺癌组织中表达程度呈明显增高的趋势。结论：提示OPB7－1可能为新的基因，与肺癌的发生、转移可能有一定的相关性。     

应用套式PCR克隆ST13基因cDNA的5‘端序列

目的获得ＳＴ１３基因ｃＤＮＡ５′端的未知序列。方法应用套式ＰＣＲ方法直接从ｃＤＮＡ文库中扩增该基因的５′端序列,然后将扩增的片段克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ．ｅａｓｙ载体,并进行序列分析。结果第１次ＰＣＲ后得到１条约５５０ｂｐ的片段,经套式ＰＣＲ后获得１条约４８０ｂｐ的片段,经序列分析证实该扩增的片段是ＳＴ１３基因ｃＤＮＡ的５′端未知序列。结论套式ＰＣＲ技术是克隆基因ｃＤＮＡ的５′端未知序列较简捷、有效的方法。