核酸杂交方法：测定与研究药物耐药基因扩散的应用

DNA-DNA 杂交法在生物学和医学方面应用的前景核酸杂交法是当代生物学最革命和公认的方法之一。它是建立在分子的单链互补生成双链杂交特性的基础上,杂交可以在溶液中或固体底垫如硝基纤维或尼龙膜上进行,在后一种情况下,需将 DNA 或消化及游离出核酸的细胞悬乳液固定在膜上,将双链的DNA 变性,生成的单链分子与膜共价结合。当加上 DNA 探针即标记的变性核酸分子时,则在有一定同源性的探针与固定在膜上的DNA 之间产生杂交。探针可以应用研究者感兴趣的基因或任何其它的 DNA 片段,以及基于已知核苷酸序列的 DNA 片段而合成的寡核苷酸。采用大小为10～40个核苷酸组成的合成寡核苷酸可以绝对准确地判断存在于生物材料中的必需基因或核苷酸都份。DNA 探针在不同医学和生物学领域得     

美国食品和药物管理局首次批准DNA探针

美国Gen-Probe公司的DNA探针已最终进入临床实验室。美国食品和药物管理局已批准首批DNA探针型产品。该产品实际上是一种核糖体RNA杂交探针,用于临床诊断军团病。据Gen-Probe公司声称,这是唯一能检测所有22种致病菌的试验。     

分枝杆菌菌种鉴定DNA微阵列的初步研究与应用

目的制备快速鉴定分枝杆菌菌种的DNA微阵列。方法根据19种分枝杆菌标准株的16SRNA序列设计寡核苷酸探针,制备DNA微阵列,通过反向杂交技术鉴定19种分枝杆菌标准株、9种非分枝杆菌标准株和31株分枝杆菌临床分离株带荧光标记的PCR产物。结果该DNA微阵列与9种非分枝杆菌标准株不杂交,具有分枝杆菌特异性;可将19种分枝杆菌标准株鉴定到群或种,具有较高的分枝杆菌种特异性。应用PCR-SSCP分枝杆菌初步菌种鉴定方法对31株分枝杆菌临床分离株进行初步的鉴定,9株为结核分枝杆菌复合群和22株为非结核分枝杆菌。应用DNA微阵列进一步进行菌种鉴定,9株与探针a杂交阳性,为结核分枝杆菌复合群;2株与探针c杂交阳性,为胞内分枝杆菌;8株与探针d杂交阳性,为堪萨斯分枝杆菌或瘰疬分枝杆菌或猿猴分枝杆菌或胃分枝杆菌;1株与探针k杂交阳性,为戈登分枝杆菌;2株与探针p杂交阳性,为龟分枝杆菌脓肿亚种;2株与探针r杂交阳性,为偶然分枝杆菌;1株与探针s杂交阳性,为草分枝杆菌;2株与探针a和p杂交阳性,为结核分枝杆菌和龟分枝杆菌脓肿亚种复合感染株;1株与探针a和r杂交阳性,为结核分枝杆菌和偶然分枝杆菌复合感染株;3株与该芯片杂交阴性。2株临床分离株经基因测序也证实DNA微阵列鉴定的特异性。结论该DNA微阵列有可能简便、快速、准确地     

一种用于检测血清中丙型肝炎病毒的新的连接依赖性聚合酶链反应

作者建立了一种新的连接依赖性聚合酶链反应(LD-PCR)法,利用磁珠简化了分离靶RNA和清除PCR抑制物的操作程序.将靶特异性非扩增半探针和扩增探针相连接.提高了检测的特异性,且能鉴别单个核苷酸差异.LD-PCR检测系统使用2个捕获探针和2个半探针.每个捕获探针的3’端有与靶RNA互补的41个核苷酸,5’端为生物素部分,两者由4个核苷酸相连.两个半探针由完整探针在靶RNA杂交区的中间被切割而成,分别含有21和39个核苷酸的PCR引物杂交区,它们都有30个核苷酸的靶杂交区.裂解剂GTC为5M时,丙型肝炎病毒(HCV)RNA从病毒颗粒中释放;降至2M时,HCV RNA与捕获探针和半探针杂交.杂交体通过捕获探针5’生物素部分与包被于磁珠表面的链霉素亲和素的结合而与磁珠连接.由于磁性分离架的磁场作用,使杂交体吸附于管壁.去除上清,用2MGTC洗除未结合成分,再用连接酶缓冲液除去残余GTC.     

何谓DNA探针技术?其用途如何?

DNA探针技术是近年来新建立的应用于诊断乙型肝炎病毒(HBV)感染的DNA:DNA分子杂交技术。其原理是根据HBV内含有内源性DNA多聚酶(DNAP)活性,以原HBVDNA为模板,使两条具有互补碱基顺序的DNA链在一定条件下重组形成一个双链结构,将放射性核素标记于HBV、DNA上,即为DNA探针(如~(88)P-HBV DNA,~3H-HBV DNA等)。用此探针与病人血清中HBV DNA进行杂交,     

不同鸟嘌呤碱基数目对DNA/银纳米簇荧光强度的影响

目的 通过C-G碱基互补配对的方式,考察不同鸟嘌呤碱基(G)数目对DNA/银纳米簇荧光信号强度的影响,以此来探究新的荧光探针开关构建的方法.方法 利用核酸碱基互补配对原则,设计了一系列银纳米簇的适配体部分的互补序列,考察了银纳米簇的适配体序列中暴露的G碱基个数对荧光信号的影响.结果 碱基G可增强银纳米簇的荧光信号强度,...     

聚合酶链反应在病毒性肝炎研究中的应用

聚合酶链反应(Polymerase Chain Re-action,PCR)是近年来建立的重要分子生物学技术。它是通过体外DNA 复制而完成的基因扩增反应。PCR 的特异性是由于扩增的DNA链始于两个特异性引物与靶DNA 的杂交,因之有靶DNA 序列的特异序列。国内有报道以PCR 扩增HBV DNA,经凝胶电泳、EB 染色、观察荧光带的步骤,可以检出1fg 的HBVDNA;如经~(32)P-HBV DNA 探针杂交可以检出10ag,约3个病毒基因。PCR 的全过程约在2～4小时内完成,因之PCR 又具有快速的特     

基因芯片技术及其在药物研究和开发中的应用

随着人类基因图谱的日益完善和后基因组研究的进展．世界正进入一个以生物信息为重要内容的生命科学时代。药物的研究和开发已经进入基因信息时代，药物基因组学是国际药学界的重要热点研究方向．它将给目前的药物研究和开发应用模式带来一场革命。基因芯片，又称DNA微探针阵列(Microarray)，是在固体基因表面上集成已知序列的基因探针，被测生物细胞或组织中大量标记的核酸序列与上述探针阵列进行杂交，通过检测杂交探针的位置。     

基于石蜡包埋组织荧光原位杂交的技术问题

<正>荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术是一种分子细胞遗传学技术,利用核酸探针杂交原理,通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的待检测的DNA靶序列结合,在荧光显微镜下显示出DNA靶序列的杂交信号的一种技术。FISH技术与传统的放射性核素标记的原位杂交相比,具有快速、检测信号强、杂交特异性高、可进行多重染色以及无放射性污染等优点。目前,FISH技术已经广泛应用于不同的学科领域,如动植物基因组结构研究、染色体结构变异的分析、人类疾病的诊断及发病机制的研究等。     

反义药物的开发与研究进展

反义药物是近20多年来发展起来的一种以反义核酸技术为基础开发的以治疗为目的安全有效的新型药物。反义药物(Antisense drugs)指的是反义脱氧寡核苷酸类药物,主要包括反义DNA(AS-ODN),反义RNA(AS-ON),多肽核酸(PNA),核酶(ribozymer)等。其主要是根据碱基互补配时原则和核酸杂交原理,利用人工合成、天然存在的互补寡核苷酸片段,以反向互补方式特异性地与目的基因(单链、双链)或信使核糖核酸(mRNA)的特定序列相结合,从基因复制、特录、剪接、转运翻译等水平上调节靶基因的表达,干托遗传信息从核酸向蛋白质的传递,从而达到抑制、封闭或破坏靶基因表达,达到治疗疾病的目的。因此,反义药物是对多种疾病都有潜在治疗价值的新型药物。自1978年Stephenson和Zamenick首次报道与病毒核酸序列互补的13met反义寡聚脱氧核苷酸能够抑制Rous病毒复制,提出了反义寡聚脱氧核糖核酸能够抑制特定基因表达的概念,并预测了在活疗病毒性疾病和癌症方面的前景。     

RecA蛋白-互补单链DNA探针提高压电基因传感器灵敏度的实验研究

目的研究利用RecA蛋白-互补单链DNA探针与固定的肽核酸(bis-PNA)探针相结合提高压电基因传感器的灵敏度的可行性。方法基因传感器阵列固定上针对乙肝病毒的bis-PNA探针,加入靶DNA与之反应,然后加入预先处理过的的RecA蛋白-互补单链DNA探针。结果直接加入靶DNA所引起的频率改变为15.83±7.31Hz,反应时间为45.16±12.87min,加入RecA蛋白-互补单链DNA探针(浓度为3.0mg/ml),所引起的频率改变最为明显,为112.16±12.7Hz。结论在反应体系中加入RecA蛋白-互补单链DNA探针,能有效地提高压电基因传感器的灵敏度,明显缩短反应体系时间。     

肽核酸在分子生物学方面的应用研究进展

肽核酸是一种核酸类似物 ,它是由 2 氨基乙基甘氨酸蛋白骨架取代核酸的磷酸戊糖 ,可以高度特异地与所选基因序列的靶点结合。肽核酸能高亲和性、高特异性地与DNA或RNA杂交形成稳定双螺旋或三螺旋结构 ,并且杂合分子表现极强的热稳定性。此文就肽核酸在基因治疗中作为反义药物、杂交探针等分子生物学中的应用研究进展予以综述。     

检测流感疫苗中宿主细胞DNA残留量的地高辛标记探针杂交法的建立

目的  建立地高辛标记DNA探针杂交法,检测基于Madin-Darby犬肾（Madin-Darby canine kidney,MDCK）细胞生产的流感疫苗中宿主DNA的残留量。方法  提取MDCK细胞基因组DNA,制备地高辛标记探针。对地高辛标记DNA探针杂交法进行特异性、灵敏度及稳定性验证, 并用此法检测3批MDCK细胞流感疫苗中的DNA残留量。结果 MDCK细胞基因组DNA的质量浓度为33 ng/μl,260 nm与280 nm波长处的吸光度比值为1.9。制备的探针与非同源细胞DNA无杂交,最低检测限度为10 pg。探针在－70 ℃放置9个月后,检测灵敏度仍可达到10 pg。经检测,MDCK细胞流感疫苗成品中的DNA残留量＜10 ng。结论  建立的地高辛标记探针杂交法特异性强、灵敏度高、稳定好,并且操作简便,可用于MDCK细胞流感疫苗中DNA残留量的检测。     

肽核酸单体骨架修饰的研究进展

肽核酸(PNA)是DNA模拟物,能与DNA和RNA以序列特异性方式结合,在基因研究和基因治疗方面有广泛的应用前景。为了优化肽核酸的性质(如水溶性、对细胞的透膜能力、杂交专一性),许多骨架修饰的PNA被合成出来。该文综述了近年来肽核酸单体骨架修饰的合成研究进展。指出设计新型的PNA结构是改良PNA性能、拓宽DNA应用的主要途径。     

核酸探针技术及其在分子药理学中的应用

核酸探针技术及其在分子药理学中的应用王兴旺，胥彬（中国科学院上海药理研究所，上海２０００３１）中国图书分类号Ｒ９６６核酸探针（ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄＰｒｏｂｅ）是指已知基因的核酸序列，能通过碱基互补原理与被检物的核酸序列退火杂交，从而检测出被检物的同...     

樟脑胺氯乙酸铂对L1210白血病细胞生物大分子的影响

樟脑胺氯乙酸铂(camphoramine chloroacetic platinum,CCP)是一新的抗癌铂类化合物。本文报道其对小鼠L₁₂₁₀白血病细胞DNA,RNA和蛋白质含量及合成代谢的影响,结果表明、CCP可使细胞内DNA,RNA及蛋白质含量有不同程度的下降,并可明显抑制DNA的合成。采用同位素、荧光探针技术初步分析讨论了CCP对DNA的作用方式。结果提示CCP可能是DNA模板损伤型药物,与DNA发生共价及非共价结合。     

反意义核酸有药用潜能

mRNA作为合成蛋白质的模板,称为有意义链。与有意义链互补的RNA称为反意义链。反意义RNA转入细胞内,可以有效地抑制其互补mRNA的功能。有证据表明,细胞内形成的有意义RNA-反意义RNA杂交体降低了mRNA的翻译能力、稳定性及转运等。最近的研究表明有可能利用反意义RNA作为抗病毒     

多重连接探针扩增技术鉴别半夏及其常见混伪品

目的 基于多重连接探针扩增技术(MLPA)建立一种中药材半夏与其常见伪品虎掌、滴水珠的分子鉴定方法,为半夏药材质量控制提供依据。方法 从Genbank数据库下载半夏属核基因组内转录间隔区(ITS)序列,利用MEGA 6.05版软件进行序列比对,依据半夏、虎掌及滴水珠ITS序列中的单核苷酸多态性(SNP)位点设计物种特异性MLPA探针,MLPA反应后采用熔解曲线法对扩增产物进行分析。结果 半夏、虎掌和滴水珠样品DNA与物种特异性MLPA探针可分别产生位于84.84,82.76及80.14℃的单一熔解峰,表明探针具有良好特异性;构建的探针体系可对0.1 ng模板DNA进行检测,并可有效检出半夏中掺混1%的虎掌或滴水珠样品。对市场收集样品进行检测,鉴别结果准确,灵敏度高。结论 该研究建立的多重连接探针扩增方法可准确鉴别半夏和虎掌、滴水珠,具有特异性强、灵敏度高等特点,可为半夏药材质量控制提供技术支持。     

二氯乙酸对ras基因的DNA损伤作用

目的研究二氯乙酸(dichloroacetic acid,DCA)对ras基因的DNA损伤作用,探讨其致癌作用分子机制。方法制备各ras基因外显子单链探针;DCA染毒TK6细胞,提取基因组DNA,再经RDPCR扩增,扩增产物与探针杂交显色。结果成功制备各ras基因外显子单链探针,Southern杂交检测到DCA对N-ras基因外显子2和H-ras基因外显子2的DNA损伤片段杂交条带,未检测出其对N-ras基因外显子1和H-ras基因外显子1的DNA损伤作用。结论DCA可造成ras基因DNA损伤,可能与其致癌作用机制密切相关,属于遗传毒性物质。     

TB AccuProbe、INNO-LIPATM RIF.TB探针和rpoβ DNA测序三种方法鉴定结核分枝杆菌的研究

目的：用3种先进的技术－TB AccuProbe DNA杂交法、INNO－LIPA^TM RIF.TB(LiPA)探针试验和rpoβ DNA基因序列测定的前瞻性研究，以鉴定结核分枝杆菌复合物（MTBC）和非结核分枝杆菌（NTM）及其成本效益。方法：在Bactec MGIT 960培养系统中将获得的105例阳性培养物筛选出70例MTBC和35例NTM，用3种技术鉴定并检测其rpoβ基因序列突变位点。结果：TB AccuProbe杂交阳性率是95．7％（67／70），LiPA DNA探针阳性率是98．6％（69／70），rpoβDNA序列测定阳性率是97．1％（68／70）。3种方法两两比较差异在统计学上均无显著意义（P＞0．05）。每份阳性培养物花费时间：TB AccuProbe杂交法和LiPA DNA探针法在24小时内完成，全部完成需6－37天，平均为15天；rpoβ基因序列测定需4－5天完成，全部完成需8－40天，平均17天。比传统的4－8周鉴定时间减少了很多。每份标本所需费用3种方法各为120、194和96元。在35例NTM中，3种方法均为MTBC阴性，同时rpoβDNA序列测定鉴定了NTM的种类。结论：TB AccuProbe杂交和LiPA DNA探针操作简便，所需时间短，只能鉴定MTBC和NTM。但LiPA DNA探针还能鉴定rpoβ基因位点突变；rpoβ基因序列测定所需时间稍长，要有特定仪器和专门人员，但所需费用较低，除能鉴定MTBC外，还能测定MTB rpoβ基因位点突变，同时能鉴定NTM的种类。