重组汉坦病毒核壳蛋白的制备及其单克隆抗体的研制

将ＰＣＲ扩增的ＨＴＶ７６－１１８ＲＮＡ小片段的ｃＤＮＡ克隆插入到ｐＤＳ ５６／ＲＢＳⅡ－（Ｏ）－６Ｈｉｓ中,通过ＩＰＴＧ诱导表达以及镍螯合层析纯化重组ＮＰ,经过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,免疫转印和ＥＬＩＳＡ方法分析其蛋白特征,证实该重组ＮＰ与毒粒ＮＰ相同,均为４９．６ｋｕ,能与肾综合征血热（ＨＦＲＳ）患者血清产生特异性反应,以此重组ＮＰ作为抗原制备抗ＮＰ单克隆抗体,获得两株持续稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细     

应用噬菌体肽库技术对汉滩病毒核衣壳蛋白N端主要线性抗原位点的识别及其基因定位

0引言核衣壳蛋白（nucleocapsideprotein，NP）是汉坦病毒（hantavirus，HV）的主要结构蛋白．近年国内外虽然对汉坦病毒NPN端蛋白的原核表达产物的抗原性及免疫原性进行了许多研究，并已用于肾综合征出血热的血清学诊断，但该抗原表位的精确一级结构及其基因定位迄今尚未明确．噬菌体肽库技术的出现为大量快速地筛检基因一多肽片段文库提供了可能．我们应用多株抗HV单克隆抗体对表达汉坦病毒属汉滩型病毒76一工18株S基因随机多肽片段的噬菌体文库进行筛选，并确定了该病毒核衣壳蛋白N端的一个主要线性抗原表位．1材料和方法1．卫单克…     

汉坦病毒核衣壳蛋白血清学分型研究进展

汉坦病毒所引起的出血热肾综合征(HFRS)和汉坦病毒肺综合征(HPS)是一类以发热、出血、肾损害或肺水肿为主要临床特征的急性传染病。该病的疫源地遍及世界五大洲，我国是世界上受其危害最为严重的国家，我国流行的主要病毒为HTN型和SEO型。由于这两型病毒的动物宿主、流行特点和所引起的临床疾病轻重程度明显不同，对其进行分型检测非常必要。作者就汉坦病毒核衣壳蛋白在血清学分型中的应用研究作一综述。     

骨形成蛋白生物活性位点单克隆抗体的制备及意义

骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein,BMP)是一种具有高效骨诱导活性的多肽类物质,在动物体内能诱导血管周围的未分化间充质     

抗人肺表面活性物质相关蛋白A单克隆抗体的制备及其特性的鉴定

目的 制备抗人肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)单克隆抗体并对其特性进行鉴定。方法 以自行制备的SP-A蛋白作为抗原免疫Balb／c小鼠，建立分泌抗人SP-A单抗的杂交瘤细胞株，诱发小鼠产生单抗腹水，用(NH4)2SO4盐析纯化腹水，用间接ELISA法测定单抗效价，用Westemblotting测定抗体特异性。结果 建立了3株能持续分泌抗SP-A单抗的杂交瘤细胞株，其中286杂交瘤细胞株抗体效价最高，其染色体数目均大于100条。间接ELISA法测定腹水和细胞培养上清效价，分别为l：50000和l：10000。用Westem blotting在SP-A蛋白泳道上相对分子质量3l000左右位置出现明显的一条染色条带。结论 自行制备的抗人SP-A单抗，其具有特异性强、效价高的特点。     

汉坦病毒重组蛋白检测血清中特异性IgA、IgM抗体的动态变化

目的：探讨重组蛋白检测血清中特异性IgA、IgM抗体的动态变化。方法：用杆状病毒表达的汉坦病毒重组核蛋白（rNP）和糖蛋白（rGP）为抗原，检测14例61份急性期SEO型病人系列血清中的特异性IgA、IgM，寻找HFRS病人igA、IgM抗体的动态变化规律。结果：几乎所有HFRS病人早期即有强烈的IgA、IgM应答，尤其是针对rNP的抗体出现早且滴度高．抗rGP出现亦早，但滴度偏低。结论：应用rNP和rGP为抗原，在发病早期检测IgM的同时，检测IgA，可以起到互补的作用，特别是对HFRS早期临床表现不典型的病例。     

抗人肺表面活性物质相关蛋白A单克隆抗体的制备及其特性的鉴定

目的制备抗人肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)单克隆抗体并对其特性进行鉴定。方法以自行制备的SP-A蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠,建立分泌抗人SP-A单抗的杂交瘤细胞株,诱发小鼠产生单抗腹水,用(NH4)2SO4盐析纯化腹水,用间接ELISA法测定单抗效价,用Western blotting测定抗体特异性。结果建立了3株能持续分泌抗SP-A单抗的杂交瘤细胞株,其中2B6杂交瘤细胞株抗体效价最高,其染色体数目均大于100条。间接ELISA法测定腹水和细胞培养上清效价,分别为1∶50 000和1∶10 000。用Western blotting在SP-A蛋白泳道上相对分子质量31 000左右位置出现明显的一条染色条带。结论自行制备的抗人SP-A单抗,其具有特异性强、效价高的特点。     

汉坦病毒重组蛋白检测血清中特异性IgA、IgM抗体的动态变化

目的:探讨重组蛋白检测血清中特异性IgA、IgM抗体的动态变化。方法:用杆状病毒表达的汉坦病毒重组核蛋白(rNP)和糖蛋白(rGP)为抗原,检测14例61份急性期SEO型病人系列血清中的特异性IgA、IgM,寻找HFRS病人IgA、IgM抗体的动态变化规律。结果:几乎所有HFRS病人早期即有强烈的IgA、IgM应答,尤其是针对rNP的抗体出现早且滴度高,抗rGP出现亦早,但滴度偏低。结论:应用rNP和rGP为抗原,在发病早期检测IgM的同时,检测I-gA,可以起到互补的作用,特别是对HFRS早期临床表现不典型的病例。     

人血管生成素相关蛋白2单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备人血管生成素相关蛋白2(angiopoietin-related protein 2,ARP2)的单克隆抗体.方法:用RT-PCR方法获取人脾脏组织ARP2基因序列,构建pET32a-ARP2,经电穿孔导入大肠杆菌诱导表达,获得可溶蛋白样品和包涵体蛋白样品,回收、纯化蛋白,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术建立产生ARP2抗杂交瘤细胞株,Western印迹鉴定.结果:获得融合蛋白的相对分子质量为570 000,与理论计算值相符,纯化后蛋白浓度＞90%,杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1:104,腹水抗体效价为1:107～1:108,抗体亚型为IgG2a类,Western印迹示目的蛋白相对分子质量为570 000,免疫组化显示该抗体能特异结合人ARP2.结论:制备的抗ARP2单克隆抗体可用于ARP2蛋白鉴定.     

抗乙型肝炎病毒X蛋白单克隆抗体导向治疗肝癌

探讨抗乙型肝炎病毒Ｘ蛋白（抗ＨＢｘ蛋白）单克隆抗体（单抗）作为原发性肝癌（ＨＣＣ）导向治疗载体的可能性。方法用分子量为１７０００乙型肝炎病毒Ｘ蛋白免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，制备抗ＨＢｘ单克隆抗体（单抗）。该单抗经大量制备、纯化、鉴定、放射性核素标记后，分别在荷人肝癌裸鼠模型和２例原发性肝细胞癌病人中进行实验和临床研究。裸鼠用１８．５ＭＢｑ（１ｍＣｉ＝３７ＭＢｑ）１３１Ｉ－抗ＨＢｘ腹腔给药。２例病人通过肝动脉导管给药，１个疗程２次，共给药１３８７．５ＭＢｑ。结果在动物实验中，裸鼠生存期明显延长，肿瘤生长明显抑制。在临床试验中，２例患者经治疗后症状明显改善，甲胎蛋白（αＦＰ）明显下降，Ｂ超及ＣＴ显示肿瘤显著缩小。１例患者因而获得二步手术切除。切除标本除边缘尚存少量癌细胞外，其余部分均呈干酪样坏死。结论抗ＨＢｘ单抗在肝癌导向治疗中有良好的应用前景，具有一定的理论及实际意义。     

抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的制备及其病毒蛋白特异性的识别

应用呼吸道合胞病毒(RSV)武汉地方株滴鼻加用病毒感染的Hela细胞免疫Balb/C鼠,取脾细胞与来自实体瘤的SP2/0细胞融合,培育出分泌抗RSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株8株其中3株有中和病毒作用。应用RSV感染Hela细胞作为RSV抗原建立了RSV的免疫转印方法,并应用免疫转印对各单抗的病毒蛋白特异性进行了初步识别:发现1株单抗识别RSV M蛋白,1株识别22 K蛋白,2株识别G蛋白,另外4株单抗的蛋白特异性尚待进一步研究确定。     

抗戊型肝炎病毒重组蛋白单克隆抗体的制备和初步应用

目的:制备抗-戊型肝炎病毒的单克隆抗体,并将其用于分析戊型肝炎病毒不同毒株结构蛋白的抗原表位。方法:采用来自墨西哥株(Mexicanstrain)的戊型肝炎病毒重组蛋白(p166Mex)免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经酶联免疫吸附试验(ELISA)法筛选阳性克隆,并将获得的单克隆抗体与戊型肝炎病毒缅甸株(Burmastrain)和美国株(USAstrain)的重组蛋白(p166Bur、p166US)进行交叉反应测定。结果:最终获得4株能稳定分泌抗-p166Mex的杂交瘤细胞株,即D8G10、E5E12、D4A3、B7E6。其中D8G10,E5E12和B7E6细胞株的培养上清液,还能分别与p166Bur和p166US重组蛋白发生阳性反应。结论:利用已获得的抗-p166Mex单克隆抗体,初步确定3种不同的戊型肝炎病毒重组蛋白(p166Bur、p166US、p166Mex)含有一种共同的抗原表位。     

抗腺病毒载体单克隆抗体的制备及其初步鉴定

目的 研制抗腺病毒载体(Adv)表面蛋白的单克隆抗体(McAb).方法 将Adv以Al(OH)3佐剂化,常规免疫BALB/c小鼠.采用细胞融合技术制备抗Adv McAb;采用ELISA、免疫细胞化学及Western blot法对McAb进行筛选与鉴定.结果 共获得6株可稳定分泌特异性McAb的细胞(A4H11、A8C7、F1H5、G1D2、G4E3、H2G8),其染色体数目为102～106条,所分泌McAb均属IgG1亚类,持续3个月适应培养仍能保持其稳定的抗体分泌能力.腹水抗体的ELISA效价在1∶106～1∶108之间;Western blot结果显示6株McAb均与来自腺病毒载体及野生3、5、7型腺病毒抗原提取物中分子量约为114 kD的多肽反应,据此推测它们均是抗ADV-TK六邻体蛋白的McAb.结论 成功制备出6株抗腺病毒载体六邻体单克隆抗体,为腺病毒载体应用于肿瘤基因治疗的临床前研究提供物质基础.     

轮状病毒单克隆抗体的研究和鉴定

运用杂交瘤技术,制备出7株分泌抗人轮状病毒短型S_2株单克隆抗体的杂交瘤,其中6株分泌IgG_(2a),1株分泌IgG_(2b)抗体。7株杂交瘤培养上清的免疫荧光抗体(IFA)滴度为1:32～256,腹水IFA滴度为1:8000～25600。双夹心ELISA腹水抗体滴度达10~(-4)～10~(-6)。7株McAb均与HSV、CMV、RSV、ADV等其它常见病毒无交叉反应。7株McAb均能与HRV长型Wa株反应,滴度为10~(-3)～10~(-6)。将其中二株或数株McAb混合后用ELISA检测其相应的OD值较每一单株为高,但相加指数(AI)值均在10%左右。结果表明,7株McAb均属RV群特异性抗体,但各自作用的抗原决定簇可能稍有差异。     

抗人IgM单克隆抗体的制备及其特征研究

以人IgM作为抗原免疫Balb/C小鼠,采用杂交瘤技术获得5株分泌抗人IgM单抗的杂交瘤细胞株.通过酶联免疫吸附试验、免疫双向扩散试验证明:该组单抗仅与人IgM起反应,而不与其他各类免疫球蛋白反应。间接免疫荧光试验证明:该组单抗测得不同人群外周血淋巴细胞阳性数与用抗B细胞单抗和直接免疫荧光法测得的结果接近.免疫转印试验证明抗体作用的分子量为50～70kd(dalten法定单位为u,换算系数0.9921,下同).提示为IgM.本文还对单抗应用价值进行了讨论。     

心钠素单克隆抗体的制备及鉴定

将心房肽Ⅲ(APⅢ)与牛血清白蛋白(BSA)偶联成大分子复合物,免疫BALB/C小鼠,制备出三株分泌心房肽Ⅲ单克隆抗体(APⅢ-McAb),行亚类鉴定为IgG_1型,琼脂双向扩散与BSA未出现沉淀线。应用APⅢ-McAb制备的亲和层析柱对心钠素有很高的亲和力,其洗脱峰管,有明显的降压作用。     

DEN2重组E蛋白单克隆抗体的制备及其生物学活性

[目的]研制登革病毒E蛋白特异性单克隆抗体,鉴定其各种生物学特性.[方法]用纯化的Pichia pastoris酵母表达的DEN2重组E蛋白作为抗原,免疫Balb/c小鼠,采用传统的细胞融合、有限稀释法克隆化杂交瘤细胞,制备稳定分泌McAbs的细胞株.采用硫酸铵沉淀法纯化腹水中的McAbs,用ELISA、IFA、Western Blot和空斑减数中和实验等鉴定McAbs的各种生物学活性.[结果]用ELISA、IFA检测证实5株杂交瘤细胞产生的McAbs与DEN2重组E蛋白和DEN全病毒均有较高的亲和力;Western Blot分析发现其中3株杂交瘤细胞(3G3,6G11,4E3)分泌的McAbs能与其相对分子质量Mr=(66～69)×103的DEN2重组E蛋白结合.空斑减数中和实验证实所获得的单克隆抗体具有中和登革病毒感染C6/36细胞的作用.[结论]成功地制备了5株抗登革病毒E蛋白特异性的McAbs,为进一步研究E蛋白的结构和功能及临床诊断试剂盒研发打下了基础.     

抗人甲状腺素单克隆抗体的制备及其初步的临床应用

本文用甲状腺素(T_4)甲酯—BSA抗原免疫BALB/C小鼠,获得4株分泌抗人甲状腺素单克隆抗体的杂交瘤细胞系。亚类鉴定均属IgG_1型。将单克隆抗体应用在放射免疫分析(RIA)中,取代多克隆抗体,证实其在甲状腺疾病诊断中,甲状腺机能亢进的诊断符合率高于多克隆抗体,显示其特异性强、灵敏度高、亲和力好(亲和常数K=1.26x10~(10)L/M)、反应平衡时间短等优点。     

抗肠型胃癌单克隆抗体的制备及意义

制备2S株McAb(MGc1及MGd1),免疫组化染色能分别与82.4％和81.0％的胃癌发生阳性反应。其中MGd1在肠型胃癌的阳性率为92.9％,强阳性率84.6％,在胃型胃癌分别为57.1％和25.0％。MGd1在肠型胃癌的强阳性率较胃型胃癌高(P<0.05)。用MGd1和/或MGc1对胃癌作免疫组化分型,有可能弥补病型形态学分型的某些不足。     

基因免疫制备抗SARS病毒N蛋白单克隆抗体

目的通过基因免疫方法,制备抗SAILS病毒N蛋白的单克隆抗体并对单抗进行初步鉴定。方法将含有N蛋白的编码基因的真核重组质粒pSecTagB／N免疫BALB／c小鼠,然后取鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,用原核表达的SARS病毒N蛋白筛选阳性克隆。然后通过免疫印迹法进一步证明抗体对N蛋白的特异性,用ELISA方法检测抗体对灭活SARS全病毒的免疫反应。结果筛选得到10株抗N蛋白的单克隆抗体,ELISA和免疫印迹结果表明这些抗体特异性针对N蛋白上的抗原决定簇,且有7株抗体对SARS灭活病毒有阳性反应。结论所得的单克隆抗体特异针对N蛋白。