人甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2 N端片段的原核表达

目的 在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)相关丝氨酸蛋白酶2(MASP2)N端片段.方法 应用PCR技术从含人MASP2 cDNA的质粒pGEM-MASP2中扩增MASP2-N端基因片段,将其克隆至pGEX4T-1原核表达载体,转化BL21(DE3)感受态菌诱导表达MASP2-N端蛋白,通过GSTrap亲合层析柱纯化目的蛋白,以SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,并以ELISA分析了目的蛋白与MBL-CLR结合的活性.结果 从pGEM-MASP2中扩增得到约840 bp的基因片段,构建成重组载体经酶切出现约4 900 bp和840 bp片段,测序结果与预期的完全一致.纯化蛋白经SDS-PAGE可见Mr 60 000蛋白带,该蛋白可与抗GST抗体反应并能与重组人MBL-CLR蛋白结合.结论 获得了表达人MASP2 N端片段的大肠杆菌菌株和重组人MASP2N端片段/GST融合蛋白,为MASP2分子的进一步研究提供了条件.     

人MASP1和MASP2 C端片段的原核表达

目的在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)相关丝氨酸蛋白酶1、2(MASP1、MASP2)C端片段。方法采用PCR技术从分别含人MASP1、MASP2cDNA的质粒pGEM-MASP1、pGEM-MASP2中扩增MASP1、MASP2C端基因片段,将其插入原核表达载体pET17b,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达MASP1、MASP2C端蛋白,通过Ni2+-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白,以SDS-PAGE、Western blot和ELISA进行鉴定。结果分别从pGEM-MASP1和pGEM-MASP2中扩增到约1300bp的基因片段,构建成重组表达载体,经酶切出现约3300bp和1300bp片段,测序结果与预期的完全一致。纯化蛋白经SDS-PAGE可见Mr40000蛋白带,该蛋白可与抗His抗体反应。结论获得了重组人MASP1和MASP2C端片段蛋白及其表达菌株,为MASP分子的进一步研究提供了条件。     

人MBL-CLR表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素（MBL）胶原样区（CLR）蛋白。方法：应用PCR技术,从含中国人野生型MBLcDNA的质粒pGEM-MBL中扩增CLR基因片段,将其克隆至pET32a原核表达载体后,转化E.coliBL21（DE3）感受态菌株诱导表达CLR蛋白。通过Ni^2＋-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白,以SDS-PAGE、Western blot和ELISA法进行鉴定。结果：从重组质粒pGEM-MBL中扩增到长约180bp的DNA片段。构建的重组表达载体经BamHⅠ和HindⅢ酶切后出现约5900bp和180bp的片段,测序结果同预期的结果完全一致。重组质料在大肠杆菌中诱导表达后,纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳出现Mr约为30000、60000和120000的3条带。Western blot分析表明,3条蛋白带均可与抗His抗体起反应,3条蛋白带对应于融合蛋白的单体和寡聚体。ELISA检测证实,纯化的蛋白能与鼠抗重组人MBL蛋白抗体结合。结论：获得可表达人MBL-CLR的大肠杆菌菌株和重组的人MBL-CLR-Trx融合蛋白,为MBL分子结构、功能关系的进一步研究提供了条件。     

重组人N端缺失MBL的原核表达及其活性研究

目的 原核表达具生物学活性的重组人N端缺失甘露聚糖结合凝集素(rhMBLΔN)蛋白.方法 应用PCR技术,从含中国人野生型MBL cDNA的质粒pGEM-MBL中扩增rhMBLΔN基因片段,插入pET43.1a载体后,转化E.coli BL21(DE3)感受态菌诱导表达rhMBLΔN蛋白.应用Ni2 -NTA琼脂糖柱纯化目的 蛋白,以SDS-PAGE、Western blot和ELISA进行鉴定.结果 从pGEM-MBL中扩增到长约620bp的DNA片段,构建的重组表达载体经Bam HI和Eco RI酶切后出现约7270bp和620bp的片段,测序结果与预期的完全一致.表达的重组蛋白纯化后,经SDS-PAGE鉴定为Mr97000的蛋白.ELISA证实,纯化蛋白能与抗重组人MBL抗体结合,具备配体结合活性并能与人甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶1、2的N端片段结合.结论 获得了可表达rhMBLΔN的菌株和具活性的rhMBΔN蛋白,为进一步研究提供了条件.     

人组蛋白H1基因的原核表达、纯化及其活性检测

目的:克隆人组蛋白H1全长编码区基因,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化以及活性检测.方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人组蛋白H1全长编码区基因,将其克隆到pGEX-KG载体中,在大肠杆菌Rossate中表达后,利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化,以SDS-PAGE和Western blot鉴定表达与纯化产物.结果:从人乳腺文库中扩增获得约650 bp的DNA片段,并成功克隆至pGEX-KG载体上,经测序与目的序列完全一致;在Rossate菌中诱导表达出相对分子质量(Mr)约为52 000的目的蛋白,经纯化后获得了纯度较高的重组蛋白GST-H1,激酶实验证明该蛋白活性良好.结论:成功获得了活性良好的重组蛋白GST-H1,为后续研究细胞周期蛋白调控奠定了实验基础.     

杀菌/通透性增加蛋白N端片段在原核细胞中的表达及其临床应用的初步探讨

目的：构建编码杀菌，通透性增加蛋白(BPI)N端片段基因原核表达载体，并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法：采用RT-PCR技术，从人外周血中性粒细胞的总RNA中扩增BPI蛋白N端片段cDNA编码区基因，DNA序列分析鉴定；将测序证实的BPI蛋白N端片段编码区基因PCR产物直接克隆于原核表达载体pBAD／Thio-TOPO中，再次测序鉴定；通过在大肠杆菌中以L-阿拉伯糖进行诱导表达，然后以SDS-PAGE、Westerm blot对表达的重组蛋白进行分析。重组蛋白经初步纯化处理后，进行生物学活性检测。结果：RT-PCR扩增出一个835bp的DNA片段，DNA测序表明为所需目的基因。限制性内切酶酶切和DNA序列分析表明，BPI蛋白N端片段正确克隆到大肠杆菌表达载体pBAD／Thio-TDPO中，SDS-PAGE和Wester blot结果表明在大肠杆菌中成功表达了BPI蛋白N端片段。对该蛋白进行初步活性测定显示其可与BPI单克隆抗体结合并具有杀灭耐药铜绿假单胞菌的活性。结论：成功构建了BPI蛋白N端片段编码区基因原核表达载体，并在大肠杆菌中进行了表达，表达的重组蛋白具有一定的生物活性。     

猪链球菌2型四川人源分离株ZYH24细胞外蛋白因子的原核表达及活性分析

目的：克隆、表达猪链球菌2型四川人源分离株ZYH24细胞外蛋白因子基因片段，分析蛋白活性。方法：根据GenBank S.suis 2 epf基因序列设计引物，克隆ZYH24株epf基因片段并进行序列分析；构建原核表达质粒pGEX4T-2-epf，在大肠杆菌中诱导带有谷胱苷肽转移酶（GST）标签的融合蛋白EF-GST的表达；亲和层析法纯化融合蛋白EF-GST，用凝血酶切除重组蛋白中的GST，获得纯化的EF抗原；SDS-PAGE和Western blot分析诱导表达及纯化的重组蛋白。结果：序列分析表明，获得的epf基因片段长895bp；原核表达的融合蛋白EF-GST分子量约62000，凝血酶处理后的EF抗原分子量约35000，两者均可与制备的EF多克隆抗血清发生特异性反应。结论：成功克隆了人源分离株ZYH24 epf基因片段，在原核系统实现高效的功能性表达，为开展EF蛋白的相关研究奠定了基础。     

β-hCG蛋白在大肠杆菌系统的表达、纯化及活性鉴定

目的 获得β-人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)融合蛋白β-hCG/GST并验证其抗原活性.方法 利用PCR法扩增β-hCG全长基因,将其克隆至原核表达载体pET-42a中,构建重组质粒pET-42a-β-hCG,将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,亲和层析法纯化融合蛋白,目的蛋白用Western blot法鉴定,ELISA检测纯化得到的融合蛋白的抗原活性.结果 测序结果证实成功扩增出目的基因β-hCG;酶切和测序结果证实pET-42a-β-hCG原核表达载体构建成功;转化后可以成功诱导并纯化出大小与预期一致的蛋白;Western blot法及ELISA检测证实纯化后的β-hCG/GST融合蛋白具有良好的免疫原性.结论 成功获得β-hCG/GST融合蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,为以β-hCG为靶位的抗肿瘤主动免疫治疗研究奠定了基础.     

MAGE-n的原核表达与分离纯化

目的　构建MAGE n的原核表达质粒 ,在大肠杆菌中进行表达 ,并通过谷胱甘肽巯基转移酶 (GlutathioneS trans ferse,GST)纯化系统进行分离纯化。方法　用ANTHEPROTV5 .0软件预测MAGE n的生物学特性 ,从中选择抗原性及特异性较强的一段。利用PCR方法扩增MAGE n基因片段 ,连入原核表达载体pGEX 4T 1,构建MAGE n的原核表达质粒pGEX MAGE n并测序。将该质粒转化大肠杆菌DH5α进行诱导表达和分离纯化。结果　成功地扩增了MAGE n基因片段 ,测序结果表明与GenBank公布的序列一致 ,成功地构建了pGEX MAGE n原核表达质粒 ,含有该质粒的大肠杆菌经异丙基 β D 半乳糖苷 (Isopro pyl beta D thiogalactopyranoside,IPTG)诱导后表达一Mr 约为 4 30 0 0的蛋白 ,经GST融合蛋白纯化系统纯化 ,得到了MAGE n的重组蛋白。结论　首次获得了新的肿瘤抗原MAGE n的重组蛋白 ,并进行分离纯化 ,为进一步研究MAGE n抗原在肿瘤免疫治疗中的作用奠定了基础     

小鼠PGRP-L分子N端基因片段的克隆与原核表达

采用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠肝组织总RNA中扩增到长约500bp的小鼠长型肽聚糖识别蛋白(mPGRP-L)分子N端基因片段,将其克隆入pUCm-T载体构建重组质粒pmGN,DNA测序表明该基因片段长530bp,序列与GenBank中的完全一致。应用PCR技术,从重组质粒pmGN中扩增目的基因片段,插入表达质粒pET-28a构建重组表达载体pET-GN,导入大肠杆菌BL21中诱导表达目的蛋白,表达产物以Ni+-NTAagarose层析柱纯化。SDS-PAGE和Westernblot分析发现,表达产物主要以包涵体形式存在,相对分子质量约29000。ELISA表明,重组蛋白能被抗mPGRP-L分子N端单表位多克隆抗体所识别。为mPGRP-L分子的研究奠定了一定基础。     

人瘦素基因在胎盘中的分离鉴定及在大肠杆菌中的融合表达

目的 克隆人瘦素(leptin)基因,构建融合表达载体,实现在大肠杆菌中的高效表达.方法 从人胎盘中提取RNA,利用反转录聚合链式反应(RT-PCR),克隆到人的leptin基因编码序列,对该基因片段进行T载体克隆、酶切和PCR鉴定,并且对其进行序列分析.将leptin基因插入到原核表达载体PET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析,并利用脱氧胆酸钠对表达蛋白进行纯化.结果 DNA序列分析表明,从胎盘中克隆的人leptin序列与文献报道的一致,酶切鉴定证实leptin基因正确地插入到了表达载体中,经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳分析,人leptin基因在大肠杆菌中实现了高效融合表达,表达产物的分子量为20kD,经过纯化,得到了较纯的融合表达蛋白.结论 从人胎盘中成功克隆了leptin基因,构建了原核表达载体,实现了在大肠杆菌中的高效表达,为进一步研究leptin的生物学功能奠定基础.     

白细胞介素-24基因重组表达载体的构建及原核表达

目的：构建人白细胞介素-24(hIL-24)基因的表达载体并在大肠杆菌中表达。方法：用PCR从质粒TRAP-IL-24中扩增hIL-24 cDNA片段，并将该片段插入pGEX-KG原核表达载体中，实现插入基因的融合表达。用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。采用MTT法检测GST-IL-24融合蛋白的生物学活性。结果：酶切结果证实，成功地构建了pGEX-KG-IL-24原核表达载体，并在大肠杆菌中获得稳定的表达，表达产物的相对分子质量(M1)同预期值相-致。GST-IL-24融合蛋白能够抑制THP-1细胞的生长。结论：成功地构建了重组表达载体pGEx-KG-IL-24，并在E．coli BL21中表达了具有生物学活性的GST-IL-24融合蛋白，为下-步研究人IL-24的功能奠定了基础。     

人源N-末端脂多糖结合蛋白(NH-LBP)的原核表达及抗原性分析

目的 在大肠杆菌表达系统中大量表达、纯化N-末端脂多糖结合蛋白(NH-LBP)并检测其抗原性.方法 构建pET28a-NHLBP质粒,转入大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导表达成功后扩大培养、提取包涵体、亲和层析分离纯化,并将纯化得到的NH-LBP融合蛋白经Western blot鉴定.结果 成功构建pET28a-NH-LBP表达质粒并转入BL21细菌进行诱导表达,目的 蛋白以包涵体形式表达为主;经扩大培养、分离纯化产物大小与NH-LBP融合蛋白理论计算值一致,经Western blot检测具有B细胞表位.结论原核表达人源N-末端脂多糖结合蛋白(NH-LBP)是制备抗原的一种可行方便的方法,为筛选针对NHLBP的人源性小分子抗体提供了材料.     

人TREM-1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的系统地研究TREM-1的生物学功能,克隆TREM-1的cDNA,构建原核表达载体后,使其在大肠杆菌中得到表达。方法用RT-PCR从临床患者外周血白细胞中扩增TREM-1 cDNA,将其克隆到克隆载体pGEM-3Z上。经酶切及PCR扩增鉴定、测序后,再克隆到原核表达载体pT7-PL上,转化大肠杆菌BL21(DE3 plys),以IPTG诱导大肠杆菌表达带有氨酸和人TREM-1蛋白组成的融合蛋白,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳初步鉴定,并对融合蛋白进行纯化。结果酶切电泳和DNA测序结果表明,成功地克隆了人TREM-1 eDNA;SDS-PAGE电泳结果显示相应分子质量37ku处有含人TREM-1融合蛋白的初步表达,证明了TREM-1原核表达的可行性。     

大鼠脂联素基因的克隆、载体构建及其在嗜酸乳杆菌中的表达

目的构建大鼠脂联素基因(AdipoQ)乳杆菌原核表达载体,为脂联素及重组益生菌的进一步研究奠定基础。方法用TRIzol试剂从大鼠脂肪组织提取总RNA,经RT-PCR方法扩增全长的AdipoQ cD-NA片段,将PCR产物亚克隆入质粒pMG36e载体,对重组质粒pMG36e-AdipoQ进行序列验证后,将重组子经电穿孔转化嗜酸乳杆菌,经SDS-PAGE初步分析重组菌Lb-PMG36e-AdipoQ对目的基因AdipoQ的表达情况。结果从大鼠脂肪组织中扩增得到735bp片段AdipoQ基因,经双酶切鉴定及测序分析,证明AdipoQ已插入pMG36e载体中。构建的pMG36e-AdipoQ原核表达载体被成功转入乳杆菌,并成功表达出分子量约为30ku的蛋白质,与核苷酸序列推断的蛋白大小相符。结论成功构建了大鼠脂联素基因乳杆菌原核表达载体,并在乳杆菌中获得蛋白表达,为脂联素及重组益生菌的进一步研究提供了可能。