反义寡核酸体外抗丁型肝炎病毒的初步研究

以质粒为模板，通过聚合酶链反应扩增得到条１３９ｂｐ的片段，它含有丁型肝炎病毒基因组ＲＮＡ中核酶区的ｃＤＮＡ，该核酶具有自身裂解功能，将上述片段插入到ＰＧＥＭ３Ｚ中，经筛选鉴定，得到一重组质粒，经测序发现有２个碱基变异，以该质粒为模板，通过Ｔ７ＲＮＡ聚合酶，转录出酶的前体，并观察到其自身裂解产物，自裂率达７１％。     

脂质体介导反义寡核苷酸体外抗乙型肝炎病毒作用的研究

 目的 研究脂质体介导的反义寡核苷酸在体外对乙型肝炎病毒基因复制和表达的抑制.方法 以2.2.15细胞为靶细胞,针对HBV S基因和PreC基因翻译起始区设计合成了16聚硫代反义寡核苷酸(Phosphorothioate AntiflenseOllgormcleotides,PS-ASON),脂质体促进转染.用放射免疫测定法(RLA)测乙型肝炎病毒HBsSg、HBeAg含量.结果 脂质体介导PS-ASON在浓度1μmol/L时特异性抑制90%HBsAg和92%HBeAg的产生,同时未见对细胞的毒性作用.脂质体介导反义寡核苷酸(Antisense Oligonucleotides,ASON)的抗病毒作用显著高于单独用ASON(P<0.01).结论 脂质体介导的ASON是一种很有潜力的抗HBV药物.     

半乳糖修饰的反义硫代寡核苷酸的肝细胞导向及抗乙型肝炎病毒…

人工合成两种半乳糖多聚赖氨酸导向配体，与荧光素标记的互补于ＨＢＶｍＲＮＡ多聚腺苷酸信号部分的２１－聚反义硫代脱氧核苷酸（ＡＳＯＤＮ）电性结合，与２．２．１５细胞共同孵育，４０ｍｉｎ后配体组对ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ的抑制率为４１％～４７％和２８％～３１％，单纯ＡＳＯＤＮ组为１１％和５％，３ｄ后配体组为８８％～８９％和７１％～７４％，单纯组为６４％和５３％，经流式细胞分析，配体组使２．２．１５细胞荧光     

超声空化脂质体微气泡促反义寡核苷酸转染的体外实验研究

目的: 探讨超声空化脂质体微气泡转染反义寡核苷酸HA2741的有效性与安全性.材料和方法: 12孔板培养人乳腺癌细胞并分为: (1)单纯超声照射;(2)单纯造影剂;(3)单纯HA2741;(4)超声照射 HA2741;(5)造影剂 HA2741;(6)造影剂 HA2741 超声照射;(7)脂质体 HA2741;(8)脂质体 HA2741 超声照射.声波发射强度-18.0～0 dB,照射时间5～240 s,给予实验刺激后,荧光显微镜观察HA2741的转染率及细胞的活性,免疫组化检测HER-2蛋白的表达.结果: 第(6)组HA2741转染率显著高于其余各组,约94.6%,造影剂浓度2%、5%时转染效率最高,提高造影剂浓度,转染效率无改变,但细胞活性显著下降.声波发射强度-3.0～-6.0dB,照射时间30～60s,细胞转染效率最高.乳腺癌细胞的HER-2蛋白表达下调,其程度与HA2741转染率呈正相关.结论: 超声空化微气泡造影剂显著增加了基因的转染,安全、简便具有良好的靶向性.     

Bax反义硫代脱氧寡核苷酸的体外抗辐射效应研究

目的 :Bcl_2 Bax蛋白比值降低是辐射所致细胞凋亡启动的检查点。本研究拟用Bax反义核酸干预Bax基因的表达 ,提高Bcl_2 Bax蛋白比值 ,抑制辐射所致凋亡 ,促进细胞存活。方法 :人胚肺成纤维细胞 (HELF)和小鼠受γ射线照射后 ,立即用Bax反义脱氧寡核苷酸处理HELF细胞和小鼠骨髓细胞 6h(终浓度均为 10 0nmol L) ,用MTT法、SRB法和小鼠骨髓中性粒细胞_巨噬细胞系祖细胞 (CFU_GM)集落形成法 ,确定细胞的存活状况。用RT_PCR方法和流式细胞仪检测BaxmRNA的表达状况、细胞周期的变化 ,分析其作用机制。结果 :HELF细胞的存活率分别增加 2 4 .4 % (MTT法 ,P <0 .0 1)和 12 .8% (SRB法 ,P <0 .0 1) ;骨髓细胞处理组CFU_GM集落形成数量远高于照射对照(72± 17vs 13± 6 ,P <0 .0 1) ;RT_PCR检测显示 ,处理组的目标条带和内标条带的灰度比值 (Bax β_actin)低于对照组(分别为 4 3.9%和 6 8.6 % ) ;流式细胞仪检测表明 ,处理组总S期细胞的比例高于对照组 ,分别为 2 4 .2 %和 7.7% ,提示处理组细胞内BaxmRNA拷贝数量低于对照组 ,细胞增殖活动较强。结论 :靶向BaxmRNA的反义硫代脱氧寡核苷酸 ,能够促进γ射线辐射后细胞的存活 ,其机制与破坏靶mRNA分子 ,继而造成Bax蛋白表达减少 ,抑制凋亡启动并促进细胞增殖活动有关。     

Sanger测序法确证硫代修饰反义脱氧寡核苷酸的序列

目的：建立一种简便、可靠的硫代修饰反义脱氧寡核苷酸序列确证方法，为反义药物的质量控制及新药研究与开发奠定基础。方法：选择含有待测反义脱氧寡核苷酸序列在内的一段靶基因为模板，以待测序的硫代修饰反义脱氧寡核苷酸作为下游引物，同时在其上游设计一条引物，进行PCR扩增，使待测序的反义序列以修饰形式掺入到PCR扩增产物中；以上述掺入反义序列的PCR扩增产物为模板，利用Sanger双脱氧链终止测序法对其进行自动序列分析。结果：该方法可对不同长度硫代修饰的反义序列进行测定，并且可有效地检测出合成过程中产生的突变和缺失序列，与质谱法相比，仪器和试剂更普及，方法易于掌握且测序成本低，用样量少。结论：该方法可用于硫代修饰反义脱氧寡核苷酸药物的序列确证。     

脂质体包99 Tcm标记Survivin反义寡核苷酸的制备和体外研究

目的研究脂质体包裹99Tcm标记Survivin反义寡核苷酸(ASON)的制备方法及其在肝癌细胞中的表达.方法合成20碱基单链Survivin ASON,全程硫代修饰,5'末端经氨基修饰,以双功能联结剂联肼尼克酰胺(HYNIC)为螯合剂,ASON与HYNIC偶联后用99Tcm标记,经P4柱纯化后,用阳离子脂质体(lipofectamine2000)对纯化产物进行包裹,并对其标记率、放化纯、比活度、稳定性、细胞摄取率进行研究.结果99TcmO-4比活度为18.5、14.8和7.4 MBq/μg时,标记率分别为(63.10±1.15)%、(62.40±1.05)%和(58.90±3.01)%.脂质体包裹的99Tcm-HYNIC-ASON放化纯为(99.47±3.32)%,以生理盐水、新鲜人血清孵育4 h后放化纯分别为92.51%和92.70%.转染后6 h,经脂质体包裹99Tcm-HYNIC-ASON的肝癌细胞摄取率达(66.21±0.46)%,明显高于未经脂质体包裹的ASON[(25.17±1.08)%,t=23.979～98.858,P＜0.01)].结论以HYNIC作为螯合剂标记ASON方法可行,脂质体能明显增加细胞摄取ASON.     

碘标记c-myc反义寡核苷酸乳腺癌显像的实验研究

用反义核酸为示踪剂 ,靶组织必须具有特异的或高表达的靶分子 ,即ＤＮＡ/ＲＮＡ。在正常组织中 ,一般基因都是单拷贝的 ,而肿瘤组织中绝大部分细胞都有某种或几种癌基因的扩增和高表达。因此 ,利用反义核酸进行肿瘤显像在理论上是可行的。 1994年 ,Ｄｅｗａｎｊｅｅ等[1]首先报道利用111Ｉｎ标记的ｃ ｍｙｃ反义寡核苷酸探针进行ＢＡＬＢ/ｃ乳腺癌动物模型显像 ,实验结果证实了该方法的准确性和灵敏性。参照该实验和131Ｉ标记反义寡核苷酸的方法[2 ] ,我们研究了12 5Ｉ标记的反义和正义寡核苷酸在正常津白Ⅱ号小鼠和乳腺癌自发瘤模型中的分…     

WT1反义寡核苷酸对白血病细胞的抑制作用

造血细胞的增殖受多种因子的调控 ,白血病的发生与基因的异常表达有关。Ｗｉｌｍｓ肿瘤基因(ＷＴ1)位于染色体 11ｐ13,编码一个具有激活和抑制双重功能的转录调控蛋白。ＷＴ1可以作用于许多与造血细胞增殖有关的基因 ,在不同的肿瘤发生和发展过程中起重要作用〔1、2〕。ＷＴ1在成熟细胞中未见表达或表达很低 ,而在大多数白血病细胞中则高度表达 ,且与白血病患者的预后有关 ,表达增高并持续阳性者 ,预后较差 〔3、4〕。本研究应用ＷＴ1反义寡核苷酸 (ＷＴ1ＡＳＯ)封闭白血病细胞ＷＴ1基因的表达 ,然后观察其对白血病细胞增殖的抑制作用 ,以探…     

腺病毒表达Ribozyme在细胞内对HBV的免疫作用

了解利用腺病毒腺体表达针对乙型肝炎病毒（HBV）的核酶在细胞内对HBV表达的抑制作用。将针对HBV的多位点核酶克隆入腺病毒载体中，利用包装细胞包装出含核酶及突变核酶的重组腺病毒，将腺病毒感染2．2．15细胞（含HBV），检测感染细胞中核酶及突变核酶的表达，利用ELISA，打点杂交及激光共聚光共聚焦等方法，检测核酶对细胞内乙型肝炎病毒表达的抑制作用。结果显示核酶及突变核酶的确被克隆入腺病毒载体，并经过包装后可形成包装腺病毒，感染2．2．15细胞后可表达出目的核酶，并发挥核酶的剪切作用，其对HBV表达的抑制率最高可达87．1％。证实包装腺病毒表达的多位点核酶对HBV的复制有明确的抑制作用，支持核酶的抗病毒效果，有希望成为HBV治疗的潜在方法之一。     

抗HCV不同位点核酶细胞内对病毒基因的抑制作用

为探讨核酶细胞对HCV基因表达的抑制作用，笔者设计合成了两个针对HCV5′NCR213位点和C区498位点的锤头结构核酶，并插入真核表达载体pcDNA3。应用WISH－nc转基因细胞模型，通过脂质体法转染核酶表达载体，经发光检测仪测定荧光素酶报告基因的表达变化以反应病毒基因的抑制率。结果显示，核酶213和核酶498均能在细胞内降低荧虫素 表达，转染后7日内的抑制率为42.94%－67.81%。提示增加核酶作用位点可防止病毒基因突变后的切割失效，但不能显著提高抑制率。     

反义核酸抑制荷瘤裸鼠乙肝病毒基因表达

应用２．２．１５细胞转种裸鼠，建立荷瘤裸鼠ＨＢＶ动物模型。受种裸鼠皮下可迅速长出移植瘤并分泌ＨＢＶ多项标志物至外周血液中。应用互补于ＨＢＶｍＲＮＡ ＳＰⅡ增强子区的１５聚反义硫代寡核苷酸以２０ｕｇ／ｇ鼠体重剂量连续治疗１０ｄ，结果治疗组荷瘤裸鼠血清中ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及ＨＢＶ－ＤＮＡ均受到明显抑制。证明该反义核酸在动物体内同样具有良好的抗病毒效应，为从基因水平研制新一代抗乙肝病毒药物奠定了基础     

半乳糖修饰的反义硫代寡核苷酸的肝细胞导向及抗乙型肝炎病毒活性研究

人工合成两种半乳糖多聚赖氨酸导向配体，与荧光素标记的互补于ＨＢＶｍＲＮＡ多聚腺苷酸信号部分的２１－聚反义硫代脱氧核苷酸（ＡＳＯＤＮ）电性结合，与２．２．１５细胞共同孵育，４０ｍｉｎ后配体组对ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ的抑制率为４１％～４７％和２８％～３１％，单纯ＡＳＯＤＮ组为１１％和５％；３ｄ后配体组为８８％～８９％和７１％～７４％，单纯组为６４％和５３％。经流式细胞分析，配体组使２．２．１５细胞荧光染色率达７５．３％和８３．８％；单纯组为２４．３％。结果表明，两种人工配体均具有良好的导向ＡＳＯＤＮ入肝细胞的功能，且可以明显提高ＡＳＯＤＮ抗ＨＢＶ的活性。     

重型肝炎病人中乙型肝炎病毒C基因变异研究

通过对１１例重型肝炎病人中扩增的ＨＢＶＤＮＡ直了列分析,研究重型肝炎病人中ＨＢＶ Ｃ基因的变异及其特点,每个病例的ＨＢＶＣ基因均有数量不等的变异,产生１－１２个氨基酸替代。慢性重型肝炎病人的ＨＢＶ Ｃ基因 明显多于亚急性重型肝炎病人。     

应用基因表达谱芯片筛选丙型肝炎病毒核心蛋白反式调节基因

应用基因表达谱芯片技术对HCV核心蛋白表达质粒pcDNA3.1(－）-core转染的HepG2细胞和空载体处理的相同细胞差异表达的mRNA进行检测。基因表达谱芯片所检测的1152条目的基因均与GenBank中登录的基因，HCV核心表达质粒转染的细胞有95条差异表达基因，其中45条基因表达增强，50条基因表达降低。这些核心蛋白反式调节基因与细胞增殖、分化、凋亡、信号转导及免疫调节密切相关。本实验结果为进一步阐明HCV核心蛋白致病（癌）的分子生物学机制提供了理论依据。     

双位点核酶细胞内抑制乙型肝炎病毒基因表达的初步研究

构建针对乙型肝炎病毒Ｃ区基因的双位点核酶的真核表达载体,以观察核酶在细胞内对ＨＢＶ基因表达的抑制作用。结论该双位点核酶可能通过针对ＨＢＶＣ区基因的剪切作用,阻断Ｃ区基因的表达,抑制ＨＢｅＡｇ的合成。     

军队散发性急性病毒性肝炎的流行病学研究

1993年3月～1994年2月对驻川某部队进行病毒性肝炎发病情况监测,并对其散发病例。经确诊急性病毒性肝炎患者血清标本72份,用ELISA方法进行分型检测,并作流行病学分布研究。结果:以甲肝为主(占52.78％)、乙肝为次(占20.83％)、丙肝最少(占1.39％),丁、戊肝两型均为2.7％。监测结果表明:该部病毒性肝炎年发病率为191.88/10万;干部肝炎发病率略低于战士,然乙肝发病率则较战士为高(P<0.05);新兵明显高于老兵,且甲肝发病率亦远较老兵为高(P<0.01)。提示:在肝炎防治中,应突出以甲、乙两型为重点,应以干部和新兵为主的预防对象。     

恒河猴感染戊型肝炎病毒的保护性研究

该文报告恒河猴感染戊型肝炎病毒(HEV)后数月再次攻击HEV的保护性研究。实验组4只猴在第1次静脉注射HEV后25～30天,均出现了典型的ALT升高。肝组织呈现血型的急性肝炎特征,急性期粪便中检查到典型的27～34nm的病毒颗粒。对照组3只猴静脉注射一种致细胞病变的肠道病毒后未发生ALT升高。6个月后,上述7只猴一起攻击同等剂量、同样来源的HEV,并经过1个多月的观察。实验组4只猴全部未发生ALT升高,而对照组3只猴分别在攻击HEV后24、26和26天出现了典型的ALT升高,ALT升高的潜伏期和升高的持续时间与实验组4只猴第1次感染HEV的ALT升高情况完全一致。免疫电镜结果表明,实验组4只猴在第1次感染HEV后ALT升高期间以及恢复正常后2～3个月内,血清中存在集聚HEV的抗体。     

丙型肝炎病毒致病的分子生物学机制

丙型肝炎病毒（HCV）属于黄病毒属，基因组与单股正链RNA，其致病机制与DNA病毒和逆转录病毒截然不同。由于诱导中和抗体的抗原表位恰好位于其包膜抗原E2蛋白的高变区1（HVRA1），因而容易逃避机体的免疫监视，形成慢性感染，同时造成发展广谱预防性疫苗的困难。噬菌体表面展示技术和模拟表位的理论和技术，是构建新型蛋白或基因疫苗，克服这一困难的可能途径。HCV基因复制和翻译有关的调节基因序列与肝细胞来源的蛋白质之间相互作用的研究，将有助于阐明HCV调节机制和相对嗜肝特性的分子生物学基础；HCV特异性受体的研究，将有助于阐明HCV感染并进入肝细胞的各个细节；酵母双杂交技术对于HCV结构和非结构蛋白结合的肝细胞蛋白的筛选，以抑制性消减杂交（SSH）技术对HCV蛋白调节的肝细胞靶基因的筛选，将有助于阐明HCV与肝细胞大分子之间相互作用的分子机制。所有这些，将为最终揭密HCV感染引起慢性病毒性肝炎、肝纤维化、肝细胞癌、肝脏脂肪变、B细胞淋巴瘤、冷球蛋白血症等的分子生物学机制，并为反义技术、人源化单链可变区抗体与目的基因的细胞内免疫基因治疗和治疗性基因疫苗等抗HCV治疗新型方法的研究奠定了坚实的基础。