溶血磷脂酸通过蛋白激酶C-α/钙离子途径促进大鼠星形胶质细胞增殖

目的：了解溶血磷脂酸（LPA）对星形胶质细胞（AS）活化增殖的影响及其作用机制。方法:原代培养的新生SD大鼠前脑星形胶质细胞分为对照组、PKC-α激动剂（PMA）组、LPA组、PKC-α抑制剂（Ro31-8220）组、Ro31-8220＋PMA组和Ro31-8220＋LPA组，用二苯基四氮唑溴盐（MTT）比色法以及流式细胞仪（FCM）检测AS增殖。以Fura－2/AM标记细胞内钙离子，紫外分光光度计检测其浓度。用蛋白印迹法检测细胞内PKC-α表达。结果:LPA和PMA能明显促进AS的增殖，并增加细胞内PKC-α的表达以及细胞内钙离子（［Ca2+］i）浓度（P<0.01）；Ro31-8220预处理后，显著缓解LPA促AS增殖程度和［Ca2+］i浓度的增加（P<0.01），［Ca2+］i浓度的变化与PKC-α表达量的变化呈正相关。结论:LPA通过PKC-α/Ca2+途径促进AS的增殖活化。     

周期蛋白D1在蛋白激酶C调控哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用

目的：观察蛋白激酶C(PKC)激活后哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)周期蛋白D1(cyclin D1)的表达变化及两者表达相关性，探讨cyclin D1在PKC调控哮喘大鼠ASMCs增殖中所起的作用。方法:卵清蛋白（OVA）吸入制备SD大鼠2周哮喘模型，原代培养ASMCs。采用正常大鼠（N组）和模型大鼠（A组）第3-6代细胞，分别应用PKC特异性激活剂12-肉豆蔻酰-13-乙酸佛波酯（PMA）及抑制剂Ro-31-8220干预ASMCs, 根据不同处理分为4组：（1）空白组；（2）10 nmol/L PMA组；(3)10 nmol/L PMA+5 μmol/L Ro-31-8220组； (4)5 μmol/L Ro-31-8220组。采用流式细胞术，四甲基偶氮唑盐（MTT）法，增殖细胞核抗原（PCNA）染色等方法观察药物对ASMCs增殖的影响。RT-PCR方法检测PKC-α和cyclin D1 mRNA表达水平，Western blotting方法检测PKC-α和cyclin D1蛋白表达水平。线性相关分析评价PKC-α和cyclin D1表达水平的关系。结果:（1）在哮喘组，与空白对照比较，PMA组、Ro-31-8220组S+G2/M期比例、吸光度A值、PCNA阳性表达率，差异显著（P<0.01）。在正常组，与空白对照相比，PMA组、Ro-31-8220组S+G2/M期比例、吸光度A值、PCNA阳性表达率差异均显著（P<0.01）。（2）哮喘组内PMA组、Ro-31-8220组PKC-α以及cyclin D1 mRNA 和蛋白表达水平与空白对照比较，差异显著（P<0.01）。正常组和哮喘组变化趋势一致。(3)在mRNA水平，大鼠ASMCs PKC-α和cyclin D1的表达呈明显正相关(r=0.476，P<0.05)，在蛋白水平两者的表达亦呈明显正相关(r=0.899, P<0.01)。结论:PKC-α能促进正常大鼠和哮喘大鼠ASMCs增殖，其在基因和蛋白的表达水平与cyclin D1的表达呈正相关，提示PKC-α可能通过调节cyclin D1而影响ASMCs的增殖。     

人参皂苷降低β淀粉样蛋白诱导THP-1单核细胞ERK的磷酸化和细胞因子含量

目的观察人参皂苷对β-淀粉样蛋白(-βamyloid,Aβ)1-40诱导的THP-1单核细胞系表达细胞因子和磷酸化细胞外信号调节激酶(ERK)的影响。方法用Western blotting方法测定磷酸化ERK的表达,放射免疫法测定细胞培养上清液中的细胞因子IL-1β、IL-8和肿瘤坏死因子(TNF)-α的浓度。结果Aβ刺激组磷酸化ERK和细胞因子IL-1β、IL-8和TNF-α的表达明显高于对照组。人参皂苷(50、100和150 mg/L可减少Aβ诱导THP-1细胞磷酸化ERK和细胞因子IL-1β、IL-8和TNF-α的表达。与模型组比较,人参皂苷治疗组Aβ1-40诱导的THP-1细胞磷酸化ERK和细胞因子(IL-1β、IL-8和TNF-α)的表达明显降低。结论人参皂苷可抑制Aβ诱导的ERK磷酸化,进一步减少细胞因子的产生。     

ERK在LPS诱导大鼠雪旺氏细胞TNF-α表达中的作用

目的 研究细胞外信号调节激酶（ERK）对脂多糖（LPS）诱导的大鼠雪旺氏细胞肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达的作用。方法 采用Westernblot检测细胞中ERK激酶的活性；用ERK的特异性抑制剂（PD98059）预处理细胞后，ELISA检测细胞中TNF-α水平；RT-PCR检测细胞中TNF-α mRNA的表达；用免疫荧光双标法检测ERK的表达定位。结果 LPS可显著激活雪旺氏细胞中的ERK信号通路，其激活高峰在LPS刺激后30～45min，60min后ERK磷酸化水平开始逐渐下降；用PD98059预处理细胞后，可显著抑制细胞TNF-α以及TNF-α mRNA的产生；LPS刺激细胞后引起ERK磷酸化，PD98059可抑制该过程。结论 ERK信号通路的激活可能是LPS诱导TNF-α表达的前提。通过阻断细胞内信号转导通路来减少TNF-α及其他细胞因子的产生，为抑制周围神经损伤后的炎症以及免疫反应发生提供了一条新的思路。     

Smad通路参与ERK通路诱导血管平滑肌细胞增殖的过程

目的： 探讨Smad通路是否参与细胞外信号调节激酶(ERK)通路诱导血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖的过程及其可能机制。方法：将人脐动脉平滑肌细胞（hUASMCs）分为对照组、血小板源性生长因子（PDGF）组、ERK阻断剂组和PDGF+ERK阻断剂组。用MTT法测hUASMCs的增殖活性(A值)，用免疫组化法测hUASMCs内细胞核增殖抗原（PCNA）、磷酸化ERK和磷酸化Smad蛋白的表达，用RT-PCR法测hUASMCs内Smad2/3 mRNA的表达。结果：PDGF组hUASMCs的增殖活性(A值)及hUASMCs内的PCNA、磷酸化ERK和磷酸化Smad2/3蛋白的表达都明显高于其它各组(P<0.01)；各组hUASMCs内Smad2/3 mRNA的表达没有差异。结论： Smad通路可在蛋白水平参与ERK通路诱导VSMCs的增殖过程。     

蛋白激酶C抑制剂Ro-31-8220逆转高糖诱导乳鼠心肌细胞肥大的作用及其相关机制

目的： 观察蛋白激酶C（PKC）抑制剂Ro-31-8220对高糖诱导的乳鼠心肌细胞肥大的影响,并初步探讨PKC及其下游信号转导途径在其中的作用机制。方法：建立乳鼠心肌细胞培养模型,随机分成对照组（5.5 mmol·L-1）、不同浓度高糖组（10 mmol·L-1、15 mmol·L-1、20 mmol·L-1、25.5 mmol·L-1）、高糖（25.5 mmol·L-1）+PKC抑制剂Ro-31-8220组（50 nmol·L-1）和高糖（25.5 mmol·L-1）+NF-κB抑制剂BAY11-7082（5 mmol·L-1）组,分别测定各组乳鼠心肌细胞直径和蛋白质含量,并应用Western blotting检测乳鼠心肌细胞PKC-α、PKC-β2、p-PKC-α、p-PKC-β2、NF-κB和c-Fos等蛋白的表达水平。结果：高糖可以明显诱导乳鼠心肌细胞肥大,提高乳鼠心肌细胞PKC-α、PKC-β2、p-PKC-α、p-PKC-β2、NF-κB和c-Fos的蛋白表达,与对照组相比差异显著（P<0.01）,并呈现一定的浓度依赖性;而Ro-31-8220能够逆转上述现象,其细胞直径和蛋白表达低于高糖组,并有显著差异（P<0.01）。结论：高糖能够浓度依赖性地诱导心肌细胞肥大,而PKC抑制剂Ro-31-8220则能抑制高糖所诱导的这种反应,其机制可能与PKC/NF-κB/c-Fos途径相关。     

lncRNA MIAT 在巨噬细胞炎症反应中的作用

目的:探索长链非编码RNA心肌梗死转录本(lncRNA MIAT)在巨噬细胞炎症反应中的作用及其可能参与的炎症通路。方法:脂多糖(LPS)刺激小鼠巨噬细胞J774A.1制备炎症反应细胞模型(LPS组),以等体积PBS刺激的J774A.1细胞为PBS对照组(PBS组),实时定量PCR(RT-qPCR)及ELISA法检测两组IL-1β、TNF-α的mRNA及蛋白表达水平,RT-qPCR检测lncRNA MIAT在两组的表达量及亚细胞定位;shRNA敲低lncRNA MIAT,分为shMIAT敲低(KD)组、shNC阴性对照(NC)组,RT-qPCR检测lncRNA MIAT敲低效率及两组IL-1β、TNF-αmRNA相对表达量;Western blot检测KD、NC组的NF-κB、ERK5等多种转录因子磷酸化水平;在LPS刺激J774A.1细胞分别加入ERK5特异性抑制剂(ERK5-IN-2)、ERK5-IN-2溶解液二甲基亚砜(DMSO),分为抑制剂组、DMSO对照组,Western blot检测ERK5磷酸化水平,RT-qPCR检测两组IL-1β、TNF-αmRNA相对表达量。结果:LPS组IL-1β、TNF-αmRNA相对表达水平及蛋白表达水平均高于PBS组(P0.05);lncRNA MIAT在LPS组相对表达量显著高于PBS组,且主要表达于细胞核;lncRNA MIAT在KD组显著低于NC组,其在J774A.1细胞的敲低效率为43%。KD组IL-1β、TNF-αmRNA相对表达量显著高于NC组;KD组ERK5磷酸化程度显著高于NC组,而NF-κB、STAT3、ERK1/2磷酸化水平差异无统计学意义;抑制剂组EKR5磷酸化显著低于DMSO对照组,且抑制剂组的IL-1β、TNF-αmRNA相对表达水平显著低于DMSO对照组。结论:lncRNA MIAT可能通过抑制ERK5磷酸化减少IL-1β、TNF-α合成,从而抑制巨噬细胞炎症反应。     

TCRVβ7.1基因转染对肝癌细胞刺激的外周血单个核细胞ERK信号通路和IFN-γ表达的影响

目的： 研究肝癌特异性识别基因TCRVβ7.1表达重组体转染外周血单个核细胞(PBMCs)后对T细胞细胞因子表达的影响和信号通路的激活作用。方法: 以肝癌特异性T细胞受体Vβ7.1转染PBMCs,流式细胞仪检测TCRVβ7.1表达量;Western blotting检测ERK1/2表达量及磷酸化水平（p-ERK）的改变;用ELISA法检测白细胞介素-4（IL-4）、γ-干扰素（IFN-γ）的表达量。结果: TCRVβ7.1基因转染健康人PBMCs并得到有效表达,转染TCRVβ7.1基因的PBMCs 与肝癌细胞共培养后ERK蛋白磷酸化水平明显高于未转染组(P<0.01)。p-ERK1/2水平与T细胞激活有关。ELISA结果表明,转染PBMCs细胞与肝癌细胞共培养后,IFN-γ水平明显高于未转染组,而IL-4无明显改变。结论: TCRVβ7.1转染PBMCs与肝癌细胞共培养后,ERK信号通路被激活,IFN-γ表达增高。     

酪氨酸激酶在TNF-α诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞MAPKs活化中的作用

目的 研究在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（RA FLS）信号转导中,酪氨酸激酶在TNF－α刺激下丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPKs)活化中的作用。方法 原代培养类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞。应用Western blot检测TNF－α短时间内引起RA FLS蛋白质酪氨酸磷酸化状态改变,及其对MAPKs家族成员活化的浓度效应和时相特点;并应用genistein,酪氨酸激酶（PTK）抑制剂观察对MAPKs活化的抑制情况。结果 TNF－α可以瞬时引起RA FLS蛋白质酪氨酸磷酸化程度增加;并在短时间内激活MAPKs通路（ERK2、JNK2、P38）。不同浓度梯度TNF－α作用显示：10IU／ml时对ERK2、JNK2即可达到峰值活化,100IU／ml时P38达到最大活化。时间上,ERK2、JNK2、P38的活化分别在TNF－α作用后5min、15min、15min最明显;genistein对TNF－α诱导的ERK2活化抑制作用显著,而对于JNK2、P38的抑制则较弱。结论 TNF－α在RA FLS信号转导中,可以瞬时导致蛋白质酪氨酸磷酸化程度增加,并同时激活MAPKs 3条通路,但是对MAPKs 3个亚家族成员的活化具有异质性;PTK在TNF－α导致ERK活化中发挥作用,对JNK、P38活化无明显影响。     

香烟烟雾提取物通过PKC途径促进大鼠肺动脉平滑肌细胞bFGF表达

目的： 研究香烟烟雾提取物（CSE）对大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）表达的影响及蛋白激酶C（PKC）信号转导途径在其中所起的作用。方法: 组织块法培养正常Wistar大鼠PASMCs。5%CSE作用于PASMCs不同时间及PASMCs先与PKC特异性抑制剂Ro31-8220预孵育，然后再暴露于5%CSE，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测PASMCs bFGF mRNA表达，免疫细胞化学检测bFGF蛋白表达。结果: 对照组PASMCs中有少量bFGF mRNA和蛋白表达（分别为0.093±0.034，0.142±0.013）。暴露于5%CSE后4 h细胞内bFGF mRNA和蛋白表达增加，mRNA于8 h达高峰（0.436±0.103，P＜0.01），蛋白于12 h达高峰（0.237±0.031，P＜0.01），此后逐渐下降，但24 h都仍高于对照组。Ro31-8220预孵育可显著抑制5%CSE诱导的bFGF mRNA和蛋白表达增加。结论: 5%CSE可通过激活PKC途径促进大鼠PASMCs bFGF的表达。