人源化Fab段噬菌体抗体库的构建

目的构建人源化Fab噬菌体抗体基因库。方法利用反转录PCR和PCR技术从B细胞淋巴瘤患者外周血淋巴细胞中扩增人IgG抗体重链Fd基因及κ、λ轻链基因,将之克隆入噬菌体载体pComb3,构建人源性Fab噬菌体抗体库,并进行鉴定。结果构建完成了库容量为6.0×108的噬菌体抗体库。结论成功地构建了人源化噬菌体抗体库,为下一步抗CD20抗体的筛选和表达奠定了基础。     

大容量天然人源Fab抗体库的构建及日本血吸虫抗独特型抗体的筛选、鉴定

目的:构建大容量天然人源Fab抗体库,筛选全人源日本血吸虫抗独特型抗体并进行初步鉴定。方法:采集15位健康成人的骨髓淋巴细胞,构建天然人源Fab抗体库。并以日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)及成虫抗原(SWAP)免疫鼠血清IgG包板进行筛选,经ELISA鉴定后,对阳性克隆进行可溶性表达。结果:构建了2×109大容量天然人源Fab抗体库,经核苷酸序列分析,证实插入片段为Fab基因片断。经过6轮筛选后,从富集的次级抗体库中随机挑取80个克隆,用ELISA法鉴定得到4个可与免疫鼠血清(Ab1)特异性结合,而不与SEA及SWAP结合的单克隆抗体(C12、C19、D1、D2),其中C12经SDS-PAGE电泳显示插入片断正确。结论:成功构建了大容量天然人源Fab抗体库,并从中获得人源日本血吸虫抗独特型抗体C12,为研制用于人体血吸虫病免疫预防的抗独特型抗体疫苗奠定了基础。     

人源日本血吸虫Fab抗体库的构建及抗独特型抗体的筛选、鉴定

目的:构建人源日本血吸虫Fab抗体库,筛选出日本血吸虫抗独特型抗体并进行初步鉴定。方法:以3名晚期血吸虫患者切除的脾脏为源,构建人源日本血吸虫Fab抗体库。并以日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)及成虫抗原(SWAP)免疫鼠血清IgG包板进行筛选,经ELISA鉴定后,对阳性克隆进行可溶性表达。结果:构建了人源日本血吸虫Fab抗体库,库容为4.3×106,经核苷酸序列分析,证实插入片段为Fab基因片断。经过5轮筛选后,从富集的次级抗体库中随机挑取60个克隆,用ELISA法鉴定得到4个可与免疫鼠血清(Ab1)特异性结合,而不与SEA及SWAP结合的单克隆抗体(A3、B6、C4、C17),其中B6经SDS-PAGE电泳显示插入片断正确。结论:成功构建了人源日本血吸虫Fab抗体库,并从中获得人源日本血吸虫抗独特型抗体B6,为研制用于人体血吸虫病免疫预防的抗独特型抗体疫苗奠定了基础。     

人源噬菌体抗体库中血管内皮细胞生长因子抗体的筛选及活性 …

目的 从人噬菌体Ｆａｂ抗体库中选抗人血管内皮细胞生长因子（ＶＥＧＦ）抗体克隆,并对其特异性及活性进行分析,为后续工作奠定基础。方法 从不同人群外周血淋巴细胞提取总ＲＮＡ,经逆转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）分别扩增轻、重链抗体Ｆａｂ段,用噬菌体表面呈递技术构建抗体库,经过４轮固相筛选及单克隆差异筛选,获得能结合ＶＥＧＦ的抗体克隆。在此基础上通过ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和＾３Ｈ－ＴｄＲ     

抗广州管圆线虫噬菌体抗体库的构建及初步筛选

目的以广州管圆线虫感染的小鼠脾细胞为源,构建抗广州管圆线虫抗体库,并筛选可用于广州管圆线虫病早期诊断的目的抗体。方法提取感染广州管圆线虫的小鼠脾细胞RNA,并逆转录合成cDNA第一链,PCR扩增出抗体轻链和重链基因,将轻、重链基因先后连接到表达载体pComb3上,转化大肠杆菌XLI-Blue,构建组合文库。用广州管圆线虫排泄分泌抗原(EsAg)作为筛选抗原,进行富集筛选,用ELISA法鉴定阳性克隆。结果成功构建了小鼠抗广州管圆线虫噬菌体抗体文库,库容为2.32×106,滴度为1.7×1013cfu/ml。筛选到了抗广州管圆线虫排泄分泌抗原特异性抗体克隆5株,用过氧化物酶标记的抗M13抗体进行初步鉴定,具有一定的特异性。结论构建的抗广州管圆线虫噬菌体抗体库达到了要求,为研制广州管圆线虫金标诊断试剂盒奠定了基础。     

噬菌体抗体库的构建及抗肝癌抗体的筛选

目的　构建噬菌体抗体库及筛选抗人肝癌特异性噬菌体抗体。　方法　以ＲＴ－ＰＣＲ法从经Ｂｅｌ７４０４细胞免疫的ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠脾淋巴细胞扩增免疫球蛋白的Ｆｄ 段及к链基因,克隆到表达载体ｐＣＯＭＢ３Ｈ－ＳＳ中并将抗体Ｆａｂ 段表达于单链噬菌体表面,构建噬菌体抗体库;以Ｂｅｌ７４０４细胞为抗原对噬菌体抗体库进行４轮“吸附－洗脱－扩增”的亲和筛选,挑取部分克隆检测与抗原的结合活性。　结果　建成容量为２×１０６ＣＦＵ 的噬菌体抗体库,在亲和筛选过程中,噬菌体收获率逐轮得到提高,第４轮为第一轮的２４５ 倍,含Ｆａｂ 基因的克隆比率也由２６％ 增到８３％ ,挑取的１０ 个克隆中有８ 个与Ｂｅｌ７４０４细胞有结合活性。　结论　噬菌体抗体库技术系高效筛选体系,为肿瘤单克隆抗体的制备提供了有效的途径     

人源乳腺癌噬菌体抗体库的构建及初步筛选

目的构建人源乳腺癌噬菌体单链抗体库,并筛选乳腺癌特异性单链抗体(Scfv)。方法利用乳腺癌患者癌旁淋巴组织来构建抗乳腺癌噬菌体抗体库。通过正常乳腺细胞(MCF-10F)和乳腺癌细胞(MCF-7)筛选富集后,用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测噬菌体抗体活性。结果成功的构建了1个4.2×107的噬菌体抗体库,并从该库中筛选到6株对乳腺癌细胞株MCF-7有结合活性的阳性克隆。结论从人源乳腺癌噬菌体抗体库中筛选到6株特异性噬菌体抗体,为下一步进行单链抗体的乳腺癌放射性核素显影及治疗奠定了基础。     

人源肺腺癌噬菌体抗体库的构建及筛选

目的:构建人源噬菌体单链抗体ScFv基因文库,并从中筛选出抗肺癌抗体。方法:提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH 和VL连接得到单链抗体ScFv。将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。以肺腺癌细胞株A549为抗原对抗体库进行“吸附-洗脱-扩增”筛选富集,共进行4轮筛选,鉴定抗体库性能。结果:成功构建噬菌体单链抗体库。在亲和筛选过程中,肺癌单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第4轮为第1轮的115倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中7个与肺癌细胞呈阳性反应,阳性率为70%。结论:通过噬菌体展示技术得到肺癌相关人源单链抗体,筛选后的单链抗体能与肺腺癌细胞A549特异性结合。     

人源性大肠癌自然致敏噬菌体抗体Fab呈现库的构建与筛选

目的 构建大肠癌病人自然致敏淋巴结抗体Ｆab段噬菌体呈现库,初步筛选相关抗大肠癌抗体。方法取大肠癌病 人转移淋巴结,提取淋巴结总ＲＮＡ,逆转录ＰＣＲ扩增重链Ｆｄ和Ｋ轻链ｃＤＮＡ。依次将ＰＣＲ产物插入载体pＣomb３的 相应部位,构建人源性大肠癌噬菌体Ｆab基因库,并应用噬菌体表面呈现技术对该抗体库进行淘选及鉴定。结果所选 ２种Ig亚类的重链 Ｆd片段、２种κ轻链cＤＮＡ得到扩增。 Ｆd片段和κ轻链均插入pＣomb３的重组率为４０％,Ｆab噬菌 体表达库容达１．４８×１０６。经３轮淘选,抗体库得到约１２０倍的富集。３轮抗体库的点印记免疫染色均显示有Ｆab表达;酶 联免疫吸附实验显示其与大肠癌抗原有结合活性。结论成功构建了大肠癌病人自然致敏淋巴结抗体Ｆab段噬菌体呈 现库,利用噬菌体抗体库技术,可筛选相关抗大肠癌抗体。     

人源肺腺癌噬菌体抗体库的构建及初步筛选

目的构建人源肺腺癌噬菌体单链抗体库,并筛选肺腺癌细胞A549特异性单链抗体。方法利用肺腺癌患者癌旁淋巴结组织构建肺腺癌噬菌体单链抗体库。从该抗体库中筛选特异性识别A549细胞的单链抗体,将阳性克隆菌转化E．coliHB2151进行可溶性表达。抗体亲和层析纯化后经SDS—PAGE、Westernblot鉴定,通过ELISA法鉴定其与人肺腺癌细胞结合的特异性。结果成功构建了1个4．6×10^7的噬菌体抗体库。在筛选过程中,肺腺癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第5轮为第1轮的181倍。在E．coliHB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。SDS—PAGE与Westernblot结果显示抗体相对分子质量为30×10^3左右。细胞ELISA测定结果显示可溶性抗体具有较高的特异性,能与A549细胞结合,而不与MDA—MB-435细胞结合。结论从肺腺癌病人癌肿周围淋巴结扩增免疫球蛋白基因成功地构建人源肺腺癌噬菌体单链抗体库,并从中筛选到肺腺癌特异性抗体。     

用于大容量人源天然噬菌体抗体库的表达载体的构建及鉴定

目的构建一个应用于大容量Fab段天然噬菌体抗体库的表达载体。方法用定点突变技术将表面呈现噬菌粒载体pDF上的BssHⅡ酶切位点改为BglⅡ酶切位点,然后分别在抗体轻链和重链位置插入自杀基因SacB,构建含自杀基因的噬菌粒载体pDF-D-SacB;利用抗乙肝表面抗原抗体的基因为模板,PCR扩增重链和轻链基因片段。将PCR扩增的轻链基因和重链基因分别插入载体pDF-D-SacB内,利用电转化的方法将其转入Trans1-Blue大肠杆菌,构建2个初级质粒,再利用初级质粒超感染BSl365菌,使其轻链与重链发生重组,获得重组质粒,进一步获得抗乙肝表面抗原抗体的噬菌体。之后利用该噬菌体感染大肠杆菌Trans1-Blue进行扩增,得到大量抗乙肝表面抗原的噬菌体抗体。最后,通过酶联免疫吸附剂测定检测所获得的抗体。结果通过向pDF重轻链区域插入SacB基因,改造抗体基因克隆位点,构建了pDF-D-SacB载体;经检测,pDF-D-SacB可以表达具有功能的Fab噬菌体抗体,可以在分泌Cre蛋白酶的细菌胞内发生预期的Cre-Loxp介导的定点重组。结论所获得的含自杀基因的噬菌粒载体pDF-D-SacB适用于构建大容量噬菌体抗体库。     

大肠癌相关抗体Fab段噬菌体呈现库的表达和活性鉴定

目的利用阳性重组菌XL1-Blue-Pcomb3 表达出人源性大肠癌Fab段噬菌体原始库,固相化人大肠癌组织及细胞的相关抗原后对其进行筛选,鉴定筛选后的抗体库与人大肠癌有无特异性的结合活性。方法PCR鉴定XL1-Blue- Pcomb3重链Fd段和资链的插入率,表达出人大肠癌Fab段原始库。然后提取3例用于构建原始抗体库的致敏大肠癌组织抗原,13例非致敏大肠癌组织抗原及3种体外培养的大肠癌细胞株LoVo、HT-29、LS-174T的抗原,利用3组混合抗原分别对原始抗体库进行3轮筛选,将筛选后的3个三级库等体积混和后通过ELISA及免疫组化鉴定其与人大肠癌组织及细胞是否具有特异性的结合活性,取胃癌、食管癌及正常肠粘膜组织和胃癌、肝癌细胞进行对照研究。结果Fd片段及资链的插入率分别为40%和70%,Fd片段及资链均插入质粒Pcomb3的重组率为28%,Fab段基因库库容为2.1×106,3组大肠癌混合抗原分别对原始库进行3轮筛选后,抗体库均得到了不同程度的富集,ELISA及免疫组化显示富集后的抗体库对人大肠癌组织及体外培养的大肠癌细胞均有较特异性的结合活性。结论利用噬菌体抗体库技术筛选到了人大肠癌相关Fab段抗体群,且筛选后的抗体群与人大肠癌抗原有较特异性的结合活性。     

大库容量人源性天然单链抗体库的构建

目的：构建一个大库容量（＞10^8）的人类天然单链抗体库。方法：从正常人400mL外周血分离林巴细胞,提取mRNA后反转录出cDNA第一链, 行半套式PCR扩增VH和VL基因片段,依次插入含Loxp和Loxp511序列的pDNA5,电转化TG1大肠杆菌,构建初级库进一步用初级库感染BS1365使其VH,VL发生重组从而获得次级库。结果：所有VH,VL亚类基因都得到了扩增,scFv克隆效率为99．9％,重组效率为每个单克隆BS1365中含至少8种不同的scFv基因。初级库容量为10^7,次级库容量至少为10^11。结论：我们采用细胞内重组的方法构建了10^11的人类天然抗体库。     

正常人天然IgG抗体噬菌体呈现库的构建

目的 建立一个正常人天然ＩｇＧ抗体委员长 菌体呈现库。方法：从一献血员取５０ｍＬ新鲜血液,分离淋巴细胞。提取ＲＮＡ,逆转录合成ｃＤＮＡＰＣＲ扩增重链Ｆｄ和轻链ｃＤＮＡ,依次将ＰＣＲ产物插入载体ｐＣｏｍｂ３Ｈ相应位点。以点印迹检测噬菌体表面Ｆａｂ的表达,结果 所有４个ＩｇＧ亚类的重链Ｆｄ片段、部分κ轻链和λ轻链ｃＤＮＡ得到扩增。先期插入的重链Ｆｄ的实际库容达１．１×１０＾６,插入率２０％。后期插入的