含胸苷激酶的不同细胞对丙氧鸟苷敏感性的差别及死亡途径初探

目的 探讨含单纯疮疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶（ＨＳＶ－ＴＫ）基因细胞对丙氧鸟苷（ＧＣＶ）敏感度不均一的原因以及在ＧＣＶ作用下细胞被杀伤的途径－坏死或凋亡。方法 将表达ＨＳＶ－ＴＫ基因的重组逆转录病毒载体,分别直接导入生长速度不同的３个系统系,胰腺癌细胞系（ＰＣ－２,ＰＣ－７）和猪肾小管上皮细胞系（ＬＩＣ－ＰＫ１）,计算机染肖后细胞倍增时间,ＭＴＴ法检测５０％细胞生长受抑制时的ＧＣＶ浓度（ＩＣ５０值）;     

THE STUDIES ON DEGRADATIVE KINETIC OF MEDICAL CHITOSAN

ＴＨＥＳＴＵＤＩＥＳＯＮＤＥＧＲＡＤＡＴＩＶＥＫＩＮＥＴＩＣＯＦＭＥＤＩＣＡＬＣＨＩＴＯＳＡＮＴＨＥＳＴＵＤＩＥＳＯＮＤＥＧＲＡＤＡＴＩＶＥＫＩＮＥＴＩＣＯＦＭＥＤＩＣＡＬＣＨＩＴＯＳＡＮＳｕｎＤｕｏｘｉａｎ；ＤｏｎｇＡｎｊｉｅ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ...     

单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因对人胰腺癌细胞的杀伤作用

构建了能表达单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶（ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ，ＨＳＶ－ＴＫ）的逆转录病毒质粒ｐＮＴＫ，经病毒包装细胞ＰＡ３１７包装后成为具有感染力的重组病毒，用该病毒感染人胰腺癌细胞系ＰＣ－２细胞，经Ｇ４１８筛选得到稳定的转化细胞系。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交证实转化ＰＡ３１７细胞及转化的ＰＣ－２细胞中均有重组病毒的表达。ｐＮＴＫ转化的ＰＣ－２细胞能使无毒性前身药物ａｃｙｃｌｏｖｉｒ（无环鸟苷，ＡＣＶ）或ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ（ＧＣＶ）具有明显的细胞毒性，细胞杀伤率＞９０％，而对照组ＰＣ－２细胞杀伤率＜１０％。同时还观察到“旁观者效应”现象。     

17-β-雌二醇对大鼠垂本前叶细胞转化生长因子基因表达的影响

实验采用无血清原代培养大鼠垂体前叶细胞及原位杂交方法，观察了不同剂量（１０１０、１０８和１０６ｍｏｌ／Ｌ）的１７β雌二醇（ｅｓｔｒａｄｉｏｌ，Ｅ２）对大鼠垂体前叶细胞转化生长因子α（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒα，ＴＧＦα）和转化生长因子β１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒβ１，ＴＧＦβ１）基因表达的影响。结果表明：１０１０ｍｏｌ／ＬＥ２作用２４ｈ后，对两种生长因子的表达均无显著影响；而１０８ｍｏｌ／Ｌ和１０６ｍｏｌ／ＬＥ２则显著升高ＴＧＦαｍＲＮＡ，分别为对照组的１５倍和１６倍（ｐ＜０００１）；同时明显降低ＴＧＦβ１ｍＲＮＡ，使ＴＧＦβ１ｍＲＮＡ水平分别降低为对照组的７０％和５５％（ｐ＜０００１）。说明一定浓度的Ｅ２对正常大鼠垂体前叶细胞ＴＧＦα和ＴＧＦβ１基因表达有明显影响，提示这两种生长因子可能以自分泌／旁分泌机制，参与Ｅ２对垂体前叶细胞功能的部分作用     

单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因在大肠杆菌中的融合表达

用ＥｃｏＲ Ⅰ和Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切已构建的含单纯疱疹病毒Ｉ 型胸苷激酶（ ＨＳＶ１ ＴＫ） 基因的ｐ ＵＣ１８／ＴＫ 质粒，将切出的ＴＫ 基因片段克隆入原核表达载体ｐ ＷＲ４５０１ 中，构建成ＨＳＶ１ ＴＫ 基因重组表达质粒ｐ ＷＲ４５０１／ＴＫ。以ＨＳＶ１ ＴＫ 特异性引物ＴＫ１ Ｆｏｒ 和ＴＫ２ Ｒｅｖ 进行ＰＣＲ 鉴定可扩增出预期的５０３ ｂｐ 的ＴＫ 基因编码区部分序列；ＥｃｏＲ Ⅰ和Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切质粒ｐ ＷＲ４５０１／ ＴＫ， 可切出约１１５０ｂｐ 的ＤＮＡ 片段， 表明重组质粒中已插入ＨＳＶ１ ＴＫ基因片段。用ＩＰＴＧ 诱导ｐ ＷＲ４５０１／ＴＫ／ＪＭ１０９ ，表达出相对分子质量（ Ｍｒ） 约为９７ ０００ 的ＴＫ 和β半乳糖苷酶（ Ｍｒ５５ ０００） 融合蛋白。薄层扫描显示，该融合蛋白含量占菌体蛋白总量的２７ ．４７ ％ 。     

胸腺嘧啶核苷激酶/丙氧鸟苷自杀基因系统旁观者效应机制的探讨

目的 探讨用单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶／丙氧鸟苷系统进行基因治疗时发生的旁观才效应机制。方法 构建表达ＨＳＶ－ＴＫ和β－半乳糖苷酶基因的重级逆转录病毒载体,将其分别直接导入胰腺癌细胞,细胞计数检测ＧＣＶ对ＨＳＶ－ＴＫ基因转化细胞的抑制作用;以Ｌａｃ Ｚ基因转化细胞为旁观细胞,唑蓝法检测旁观者效应,并通过上清移换实验１维拉帕米抑制实验及电镜观察超微结构。结果 ＧＣＶ对ＨＳＶ－ＴＫ基因转化细胞的生长     

胰岛素样生长因子1的免疫调节作用的体外实验研究

目的：探讨胰岛素样生长因子１（ＩＧＦ１） 的免疫调节作用。方法：随机抽取健康个体８２ 名和肿瘤个体１２６ 名,体外提取外周血淋巴细胞后将ＩＬ２ 和或ＩＧＦ１ 共同培养,用３ ＨＴｄＲ 掺入法、３ ＨＴｄＲ 释放法及流式细胞仪检测淋巴细胞增殖活性、杀伤活性和ＣＤ４＋ ＣＤ８＋ 比率。结果：适当浓度的ＩＧＦ１（５０ ｎｇｍｌ）在体外能协同ＩＬ２ 促进ＬＡＫ细胞的增殖,增强其杀伤Ｒａｊｉ细胞的活性,提高淋巴细胞亚群ＣＤ４＋ ＣＤ８＋ 的比率。结论：ＩＧＦ１ 在体外对人体外周血免疫细胞起正向调节作用。     

THE CURATIVE EFFECT OF HIGH EFFICIENCY HEMODIALYSIS AND THE GRADIENT CHANGE OF PLASMA OSMOTIC PRESSURE(Report of 27 Cases)

ＴＨＥＣＵＲＡＴＩＶＥＥＦＦＥＣＴＯＦＨＩＧＨＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹＨＥＭＯＤＩＡＬＹＳＩＳＡＮＤＴＨＥＧＲＡＤＩＥＮＴＣＨＡＮＧＥＯＦＰＬＡＳＭＡＯＳＭＯＴＩＣＰＲＥＳＳＵＲＥ（Ｒｅｐｏｒｔｏｆ２７Ｃａｓｅｓ）ＣｈｅｎＨｕａｊｉ（ＣｅｎｔｒａｌＨｏｓ...     

G CSF 在ATRA 诱发高白细胞症中的作用观察

全反式维甲酸（ＡＴＲＡ）治疗急性早幼粒细胞白血病（ＡＰＬ）,完全缓解率虽高达８５％以上,但可引起重要的高白细胞症,往往危及患者生命。自１９９３年我们对此特殊现象已进行了多方面探讨,比较肯定的是血清ＧＣＳＦ与外周ＷＢＣ升高具相关性。本文对ＧＣＳＦ与其白细胞之间关系做了进一步观察。按２×１０５ｍｏｌ／Ｌ和２×１０６ｍｏｌ／Ｌ两个ＡＴＲＡ浓度在体外进行ＨＬ６０细胞常规细胞培养,ＭＴＴ法测定增殖性变化。０１ｍｌＨＬ６０细胞（２×１０６／ｍｌ）在ＡＴＲＡ１０６ｍｏｌ／Ｌ（终浓度）条件下,本…     

虎杖甙对正常人血管平滑肌细胞内钙和膜电位的调节作用

目的和方法：观察虎杖甙（ＰＤ）对人脐带动脉平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）内游离钙、细胞膜电位的变化,以探讨ＰＤ对血管平滑肌的调节机制。用Ｆｌｕｏ－３－ＡＭ、ＤｉＢＡＣ４（３）标记培养的ＶＳＭＣ,在激光共聚焦显微镜上测定细胞内游离钙和膜电位变化。结果：给ＰＤ（０５ｍｍｏｌ／Ｌ）１０ｍｉｎ后,ＶＳＭＣ内游离钙浓度升高５６％±５６％。当ＰＤ加入前用维拉帕米和ＥＧＴＡ预处理后,则游离钙不再升高;ＥＧＴＡ和肝素预处理也抑制ＰＤ的升钙作用,而ＥＧＴＡ和普鲁卡因预处理则使细胞内钙显著升高。ＰＤ还可使ＶＳＭＣ膜电位去极化,加入钠通道阻断剂河豚毒素（２５μｍｏｌ／Ｌ）可完全阻断ＰＤ的去极化作用：加甲氰咪胍、维拉帕米、优降糖和利及丁预处理不能阻断ＰＤ去极化作用。结论：：ＰＤ可通过细胞外钙内流来增加细胞内游离钙浓度,并促进细胞外钠离子内流而导致细胞去极化     

Bystander-mediated regression of murine neuroblastoma via retroviral transfer of the HSV-TK gene

Selective introduction of genes conferring chemosensitivity into proliferating tumor cells may be used to treat cancer. We investigated the bystander effect of retrovirus-mediated gene transfer of herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) gene to murine neuroblastoma cell line (neuro-2a) in vitro and in vivo, and we examined whether the mechanism of bystander effect in neuroblastoma would also depend on connexin-dependent gap junction and/or immune response. A strong bystander effect was observed in vitro, whereby nontransduced tumor cells in proximity to transduced cells acquired susceptibility to ganciclovir (GCV) killing. Implanted mixtures of wildtype cells and HSV-TK transduced cells showed a potent bystander effect upon administration of GCV in A/J mice. HSV-TK/GCV system in murine neuroblastoma induced systemic immunity. Immunohistochemical staining showed many CD4+ and CD8+ cell infiltration but did not show anti-connexin 43+ cells. In conclusion, a strong bystander effect was observed in vitro and in vivo. The bystander effect in murine neuroblastoma might be dependent on immune response and/or on other mechanism such as protein phosphorylation or transfer of apoptotic vesicle, rather than connexin-dependent gap junction.     

HSV-TK/GCV自杀基因系统治疗宫颈癌的研究

目的探讨HSV-TK/GCV自杀基因系统对人宫颈癌细胞系Hela体外及体内杀伤作用及其产生的旁观者效应.方法采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317.取病毒上清液感染人宫颈癌细胞Hela,得到带有HSV-TK基因的Hela/TK细胞,并将其分别用于体外和体内实验.结果载体HSV-TK导入了PA317细胞.体外实验结果显示,当Hela/TK细胞数占混合细胞10%时,低浓度(10μg/ml)的GCV就可将50%左右的肿瘤细胞杀死.体内实验结果显示GCV可明显抑制Hela/TK细胞在BALB/C小鼠体内的肿瘤形成.经GCV治疗后,肿瘤体积分别较对照组肿瘤体积缩小约11.1%、30.6%和47.2%(均P＜0.001);RT-PCR检测HSV-TK基因在肿瘤组织中有表达;实验组肿瘤组织与对照组相比存在明显的病理学改变.结论逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入人宫颈癌细胞Hela并获稳定表达,HSV-TK/GCV自杀基因系统在体内外对宫颈癌细胞均有杀伤作用,且存在明显的旁观者效应.     

单纯疱疹病毒胸苷激素酶基因在骨肉瘤细胞中的表达和作用

目的：观察单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV－TK）及其底物丙氧乌苷（GCV）的基因治疗系统对骨肉瘤细胞株SAOS－2的杀伤作用。方法：用DOTAP将含有HSV－TK基因的真核表达质粒tgCMV-HyTK导骨肉瘤细胞株SAOS－2;提取阳性转染细胞（SAOS－2TK）的总RNA,用斑点杂交的方法检测HSV－TK基因的表达;用MTT比色法测定SAOS－2TK细胞对GCV的敏感性及“旁观者效应”。结果：SAOS－2TK细胞能产生稳定的TK基因的转录物;SAOS－2TK细胞在GCV的作用下呈现明显的生长抑制效应,且观察到强效的“旁观者效应”。结论：HSV－TK／GCV系统能够选择性杀死骨瘤细胞。     

Osteosarcoma and chondrosarcoma as targets for virus vectors and herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir gene therapy

Osteosarcoma and chondrosarcoma, the most prevalent primary malignant tumors of the bone, have been demonstrated to be potential target diseases for herpes simplex virus type 1 thymidine kinase (HSV-TK)/ganciclovir (GCV) suicide gene therapy. However, the utility of this gene therapy form for bone tumor cells has not been studied systematically. In this report we show, with the aid of three osteosarcoma cell lines (Saos-2, U-2-OS and MG-63) and one chondrosarcoma cell line (SW1353) that: i) these tumor cells were permissive for adenovirus- or lentivirus-mediated gene delivery; ii) the cell lines appeared to be good or excellent targets for HSV-TK/GCV gene therapy; and iii) the extent of HSV-TK/GCV cytotoxic effect correlated with the presence of the 'bystander effect' in these cells. Our results also suggest that lentiviruses are potential vectors for bone cancer gene therapy. They transduced all four cell lines with high efficiency and provided HSV-TK expression level that was sufficient for cytotoxicity and bystander effect comparable to that obtained with adenovirus vectors.     

单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷系统对人骨肉瘤细胞杀伤作用的研究

目的:观察单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)基因治疗系统对骨肉瘤细胞株OS732的杀伤作用并研究其作用机制。方法:构建含HyTK基因的逆转录病毒载体DORHyTK,用DOTAP将其转入骨肉瘤细胞株OS732;提取阳性转染细胞(OS732TK)的DNA和总RNA,分别用PCR和斑点杂交的方法检测转染的效果;用MTT比色法测定OS732TK对GCV的敏感性及旁观者效应;Hoeschst332258染色,电镜和流式细胞仪分析HSV-TK/GCV系统对OS732TK细胞杀伤作用的机制。结果:成功构建含HyTK基因的重组逆转录病毒载体DORHyTK。OS732TK细胞整合了TK基因并有稳定的转录产物。5mg/LGCV作用5d即可杀伤所有OS732TK细胞。旁观者效应在高、低两种细胞密度接种条件下均存在,且前者强于后者。Hoeschst332258染色及电镜均显示典型的细胞凋亡特征,但也有少量坏死细胞的存在。流式细胞仪分析的结果说明在GCV作用下,OS732TK细胞阻滞于细胞周期的G₀-G₁期。结论:HSV-TK/GCV基因治疗系统对骨肉瘤细胞株OS732有很强的杀伤作用,且存在明显旁观者效应。此系统导致了OS732细胞周期的紊乱,引起细胞的凋亡和坏死。HSV-TK/GCV基因治疗系统为骨肉瘤的治疗提供新的思路。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因介导GCV治疗人膀胱癌的实验研究

探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶(Herpes simplex virous thymidine kinase,HSV-TK)基因介导的丙氧鸟苷(Ganciclovir,GCV)系统对人膀胱癌细胞(T24)生长的抑制作用。利用电穿孔技术将携有HSV-TK基因的重组逆转录病毒载体(pLXSN-TK)导入包装细胞PA317,获得转染后的逆转录病毒包装细胞PA317／TK。将BALB／c裸鼠24只随机分为4组(每组6只),建立人T24裸鼠荷瘤模型。治疗1,2组分别瘤内注射病毒悬液或PA317／TK细胞后再经GCV处理。对照1,2组则分别瘤内注射等量生理盐水或：PA317／TK细胞后再经等量GCV或生理盐水处理。观察各组肿瘤体积和瘤重的变化;采用原位杂交技术分析HSV-TK基因在肿瘤组织中的表达;采用流式细胞仪技术(Flow cytometry,FCM)和末端脱氧核苷酸介导的X-dUTP缺口末端标记技术(Termininal deoxynucleofidyl trasferase-mediated dUTP nick end labelling technigue,TUNEL)检测膀胱癌细胞凋亡。结果表明：(1)逆转录病毒介导的HSV-TK基因在体内能转染T24细胞,联合运用GCV后,肿瘤的生长速度明显减慢;(2)HSV-TK／GCV治疗后膀胱癌细胞凋亡现象明显增强。以上结果提示T24荷瘤裸鼠内HSV-TK／GCV系统对T24细胞的生长有明显的抑制作用,且可能与细胞凋亡引起的“旁观者效应”有关。HSV-TK／GCV系统在人类膀胱癌治疗方面具有明显的临床运用前景。     

Regression of experimental liver tumor after distant intra-hepatic injection of cytosine deaminase-expressing tumor cells and 5-fluorocytosine treatment

Cytosine deaminase (CD) gene of E. coli converts the non-toxic compound 5-fluorocytosine (5-FC) into 5-fluorouracil. We have introduced a vector expressing the CD gene in a rat colon carcinoma cell line. Expression of the CD gene confers 5-FC sensitivity to these cells in vitro and in vivo. In a bifocal model consisting in a simultaneous engrafment of a CD+ tumor on one lobe of the liver and a wild-type parental tumor on the opposite lobe, treatment with 5-FC results in regression of both type of tumors, indicating the existence of a distant bystander effect.     

低氧反应元件调控的腺病毒-胸苷激酶对肝癌细胞HepG2的体外杀伤作用

目的： 构建携带受低氧反应元件(HRE)调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因的重组腺病毒载体, 探讨该重组腺病毒对体外培养的肝癌细胞HepG2的特异性杀伤活性。方法: 采用AdEasy system 构建携带受HRE调控TK基因表达的腺病毒Ad-HRE-TK, 体外感染肝癌细胞系HepG2后分别在正常和低氧条件下培养。分别采用反转录－聚合酶链式扩增（RT-PCR）及蛋白质印迹（Western blotting）技术检测TK mRNA及蛋白表达情况,并用不同浓度的丙氧鸟苷(GCV)处理后以MTT法检测细胞的增殖情况。结果: RT-PCR及Western blotting结果显示,仅转染重组腺病毒Ad-HRE-TK并在低氧条件下培养的HepG2细胞特异性表达TK基因及蛋白。HepG2 细胞感染Ad-HRE-TK后,在低氧培养条件下对GCV 的敏感性明显增加, 在感染复数(MOI)为 100 并用 50 mg/L GCV 处理时, 则有 95% 以上HepG2 细胞被杀死。而正常氧浓度下培养组,未能观察到GCV的杀伤作用。结论:低氧条件下,HRE可特异性地促进HSV-TK 基因的表达,从而诱导GCV的毒性作用。