体外"心肌样"环境下5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的探讨在体外"心肌样"环境下5-氮胞苷(5-Aza)诱导能否促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样细胞分化。方法(1)分离、纯化大鼠BMSCs,分组后用5-Aza诱导部分BMSCs。(2)BMSCs标记后与乳鼠心肌细胞共培养。(3)免疫荧光法鉴定BMSCs的肌球蛋白重链(MHC)和心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)。结果免疫荧光结果显示5-Aza单次诱导组与未诱导组比较MHC、cTnI阳性率显著增加,且5-Aza双次诱导组较单次诱导组MHC、cTnI阳性率显著增加。结论(1)体外"心肌样"环境下5Aza能够促进BMSCs向心肌样细胞分化。(2)5-Aza双次诱导较单次诱导效果更好。     

人骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究

目的：研究人骨髓间充质干细胞（hMSCs）在体外分离纯化、培养扩增和向心肌样细胞诱导分化的条件。方法：体外分离培养hMSCs,纯化传代至第三、四代,加入不同浓度5-氮杂胞苷（5-Aza）进行不同时间的孵育,用MTT测定细胞的生长活性,确定最佳的浓度和孵育时间。4周后行电镜,免疫组化染色及逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测。结果：诱导后细胞呈心肌样细胞改变,电镜下可见肌丝形成,免疫组化显示部分细胞胞浆α-横纹肌肌动蛋白（α-sarcomeric actin）、肌钙蛋白-T（troponin-T）阳性。RT-PCR检测显示心肌特异转录因子GATA-4、Nkx2.5有表达。结论：hMSCs是骨髓来源的具有多向分化潜能的干细胞,在5-Aza的诱导下可向心肌样细胞分化,可成为心肌损伤移植治疗的理想细胞材料。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的基因表达

为观察5-氮胞苷在体外诱导人骨髓间充质干细胞（MSCs）转化为心肌样细胞的ANP、BNP、α—skeletal actin、MLC-2v、GATA-4和Nkx2．5基因表达,取非血液疾病的5例胸科手术患者术中已切除掉的肋骨,抽取骨髓;利用淋巴细胞分离液行密度梯度离心法和差异贴壁法进行分离、提纯MSCs,并进行培养扩增。用流式细胞仪对第2代的MSCs细胞表面抗原进行测定。应用10μmol／L5-氮胞苷对第2代的MSCs诱导24h,于诱导后1、2、3、4周,用逆转录-聚合酶链反应（PCR）检测ANP、BNP、α-skeletalactin、MLC-2v、GATA-4和Nkx2．5基因表达。结果表明,3份第2代MSCs样本重复测定,表达CD29、CD44,不表达CD34、CIM5。以5-氮胞苷诱导培养24h后,MSCs形态和排列方式发生明显变化,诱导1周后,细胞体积增大,多呈长梭形,平行排列;诱导2周后,细胞变为短柱状,突起位于两端,相邻细胞的突起紧密接触;诱导3周后,短柱状细胞的突起相互连接,部分细胞可见类肌管样结构;诱导4周后,细胞体积变小,可见由几个细胞连接形成的多核肌管样结构。诱导组细胞ANP、BNP、α—skeletalactin、MLC-2v、GATA-4和Nkx2．5的PCR产物凝胶电泳呈阳性,对照组为阴性;诱导组基因表达量均随着时间延长逐渐增加。结论：5-氮胞苷可诱导MSCs向心肌样细胞转化,处于祖心肌细胞和分化的心肌细胞之间,并可能具有心肌细胞的功能。     

不同浓度5-氮胞苷体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞

为确定5-氮胞苷诱导人骨髓间充质干细胞（MSCs）转化为心肌细胞的合适浓度,取人肋骨来源的骨髓,分离、提纯、培养MSCs,应用0、2．5、5、10、20、40、80μmol／L5-氮胞苷对第2代的MSCs诱导24h,于诱导后1、2、3、4周进行细胞形态学观察;于诱导后2周进行免疫组化鉴定及心肌样细胞转化率的计算和比较。结果表明,5-氮胞苷诱导24h后,小于10μmol／L组仅有少量细胞死亡,其余组约30％细胞死亡;2～3周,相邻细胞间胞膜有接触,逐渐相连呈肌管状;同期未经诱导的MSCs没有出现类似改变。诱导后2周MSCs免疫组化染色,对照组与2．5μmol／L组cTnI表达为阴性,其它组cTnI表达呈阳性。心肌样细胞转化率10μmol／L、20μmol／L、40μmol／L、80μmol／L组之间无明显差异,均明显高于5μmol／L组（P〈0．05）。结论：在体外5-氮胞苷可诱导人MScs转化为心肌样细胞,10μmol／L可能是一种合适的诱导浓度。     

lncRNA IGF2-AS调控IGF2对骨髓间充质干细胞 心肌样分化的影响

目的 探讨长链非编码RNA胰岛素样生长因子2反义转录物（lncRNA IGF2-AS）调控胰岛素样生长因子2 （IGF2）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）心肌样分化的影响。方法 分离培养SD大鼠的BMSCs,倒置显微镜观察原代 细胞、第3代细胞的形态;流式细胞仪检测BMSCs表面抗原CD29、CD90、CD45的表达。将第3代生长良好的BMSCs 分为对照组、空载体组（转染pLVX-IRES-Zs Green1载体）、lncRNA IGF2-AS组（转染pLVX-IRES-Zs Green1-IGF2- AS）、5-氮杂胞嘧啶（5-AZA）组（8 μmol/L 5-AZA 处理）、si-NC 组、si-IGF2-AS 组、si-IGF2 组、lncRNA IGF2-AS+siNC 组及 lncRNA IGF2-AS+si-IGF2 组。实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）检测 IGF2-AS 表达;MTT 法检测细胞活力; Western blot检测IGF2、间隙连接蛋白43（Cx43）、心肌肌钙蛋白T（cTnT）、心肌肌钙蛋白I（cTnI）蛋白表达;RNA下拉 和RNA免疫沉淀（RIP）检测IGF2-AS与IGF2蛋白结合情况。结果 原代细胞在培养初期呈悬浮状态,大多数呈圆 形,培养48 h后开始贴壁生长;第3代细胞呈长梭形,排列不整齐,相邻细胞间紧密连接,呈成纤维细胞样。第3代 BMSCs 高表达 CD29（98.21%）、CD90（92.54%）,低表达 CD45（3.67%）。过表达 IGF2-AS 或 5-AZA 处理均可促进 BMSCs 中 Cx43、cTnT、cTnI 蛋白表达,并降低细胞活力,且 5-AZA 组相应指标明显低于 lncRNA IGF2-AS 组（P＜ 0.05）。沉默IGF2-AS或抑制IGF2表达均可降低BMSCs中Cx43、cTnT、cTnI蛋白表达,并降低细胞活力（P＜0.05）; lncRNA IGF2-AS可靶向上调IGF2蛋白的表达（P＜0.05）;沉默IGF2逆转了过表达IGF2-AS对BMSCs心肌样分化的 促进作用。结论 过表达IGF2-AS通过上调IGF2促进BMSCs心肌样分化。     

体外培养成人脂肪间充质干细胞生物学特性及诱导分化为心肌细胞的研究

目的通过分离、培养脂肪间充质干细胞观察其生物学特性及诱导分化为心肌细胞,为心肌再生提供良好的干细胞来源。方法胶原酶消化分离成人脂肪来源的间充质干细胞并进行传代培养,倒置相差显微镜观察细胞形态,流式细胞仪测定CD29、CD31、CD34、CD44及细胞周期,MTT绘制细胞生长曲线。用第3代细胞进行诱导分化,观察不同浓度5-氮杂胞苷(5-Aza,1,3,5,10,15,20μmol/L)及不同作用时间(12,24,48,72h)诱导其向心肌细胞分化的差别,采用最佳浓度10μmol/L,最佳作用时间24h进行实验,分别在第7,14,21,28天用免疫细胞荧光染色鉴定心肌细胞α-横纹肌、肌球蛋白重链(MHC)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)表达,第14天反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测心肌发育相关基因NKX2.5的表达。结果倒置相差显微镜下观察原代细胞,可见细胞呈梭型、核圆形或椭圆形,偶见双核。传代细胞核原代细胞形态相似,排列有了一定的方向性。流式细胞仪检测结果显示,第1、3、5代细胞均高表达CD29和CD44;而CD31始终表达很弱,可认为呈阴性表达;CD34在第1、3代细胞弱表达,在第5代细胞表达逐渐减弱为阴性。细胞生长曲线显示前3d处于细胞潜伏状态,第4天进入对数生长期,第10天达到顶峰。细胞周期检测结果显示G1期细胞为85.93%,S期为7.24%,G2期为6.83%。10μmol/L5-Aza诱导后7d进行免疫细胞荧光染色,未见有α-横纹肌、MHC、cTnI表达。14d少量细胞α-横纹肌和MHC阳性表达,cTnI阴性表达。21d表达α-横纹肌和MHC的细胞数量增多,并可见少量cTnI阳性表达。28dα-横纹肌、MHC、cTnT阳性表达数目均增多,RT-PCR结果显示NKX2.5呈阳性表达。结论成人脂肪中可以分离出脂肪间充质干细胞并且可以在体外培养传代,经过5-Aza的诱导可以向心肌细胞分化,为干细胞移植治疗和组织工程学种子细胞提供了更多的选择。     

酸敏感离子通道1a在酸诱导的大鼠肝星状细胞活化中的作用

目的：探讨酸敏感离子通道1a（ASIC1a）在酸诱导的大鼠肝星状细胞活化中的作用。方法：体外培养肝星状细胞株（HSC-T6）经处理后,乳酸脱氢酶（LDH）检测细胞毒性变化,RT—PCR检测ASIC1a mRNA表达,Western Blot和RT—PCR分别检测Calpain、Calcineurin蛋白和mRNA表达变化,免疫细胞化学法检测α-平滑肌肌动蛋白（α—SMA）的变化。结果：细胞酸化处理后ASIC1a含量明显上升;随着胞外pH值的下降,LDH释放量逐渐升高,ASIC1a阻滞剂可抑制酸化诱导的肝星状细胞LDH的释放量;酸化组肝星状细胞Calpain、Calcineurin mRNA和蛋白表达水平均明显增高,ASIC1a阻断剂组Calpain、Calcineurin mRNA和蛋白表达水平较酸化组明显降低;与酸化组相比,阻断ASIC1a可以降低HSC—T6中α—SMA的表达。结论：胞外酸化环境下可诱导肝星状细胞活化,阻断ASIC1a能明显降低酸化诱导的细胞活化。     

川皮苷调控miR-145-5p/KLF5轴减轻缺氧复氧诱导的大鼠心肌细胞损伤

摘要：目的:探讨川皮苷对缺氧复氧（H/R）诱导的大鼠心肌损伤细胞发挥保护作用的潜在机制。方法:体外培养大鼠心肌H9c2细胞,CCK-8法检测不同剂量(0,12.5,25,50,100,200μmol·L-1)的川皮苷作用于H9c2细胞48 h后的细胞活力,筛选合适的实验浓度;取对数生长期的H9c2细胞,随机分为对照组、H/R组、mimic-NC组、miR-145-5p mimic组、川皮苷低(12.5μmol·L-1)、高(25μmol·L-1)剂量组、川皮苷+inhibitor-NC组、川皮苷+miR-145-5p inhibitor组,除对照组外,其余组建立H/R损伤模型。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测细胞中miR-145-5p和Krüppel样因子5（KLF5） mRNA的表达水平;CCK-8法检测各组细胞活力;流式细胞术检测各组细胞凋亡情况;并检测细胞上清液中乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶MB同工酶（CK-MB）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）水平;蛋白印迹法（Western Blot）检测细胞KLF5、核因子-κB p65（NF-κB p65）、B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）的蛋白表达。结果:12.5和25μmol·L-1的川皮苷对H9c2细胞的活力未出现明显影响,当川皮苷浓度大于50μmol·L-1时可显著抑制H9c2细胞的活力（P<0.05）。因此,选择12.5和25μmol·L-1的川皮苷用于后续实验。川皮苷可促进miR-145-5p表达,下调KLF5表达（P<0.05）,升高H9c2细胞活力、SOD水平和Bcl-2蛋白表达（P<0.05）,降低细胞凋亡率、LDH、CK-MB、MDA、TNF-α、IL-1β水平和p-NF-κB p65/NF-κB p65比值及Bax蛋白表达（P<0.05）。上调miR-145-5p表达与川皮苷发挥相同的作用,下调miR-145-5p后,川皮苷对H9c2细胞损伤的保护作用被明显削弱。结论:川皮苷可能通过上调miRNA-145-5p,抑制KLF5的表达和NF-κB p65的活化,进而抑制氧化应激和炎症反应,减少H/R诱导的心肌细胞凋亡。     

黄芪甲苷促进脐带血干细胞向心肌细胞分化作用的研究

目的探讨黄芪甲苷对脐带血间充质干细胞向心肌细胞分化的作用。方法采用贴壁法分离人脐带血间充质干细胞,用流式细胞术对细胞表型进行鉴定。通过免疫组化方法观察黄芪甲苷对间充质干细胞向心肌细胞分化的促进作用。结果流式细胞仪检测结果表明,分离的脐带血间充质干细胞表达CD29、CD44和CD105,不表达CD34和HLA-DR。黄芪甲苷（浓度200 mg/L）作用下,间充质干细胞表达特异性心肌细胞蛋白,包括结蛋白（desmin）、α横纹肌肌动蛋白（-αsarcomeric actin）和肌钙蛋白T（C-TnT）。结论黄芪甲苷对脐带血间充质干细胞分化的促进作用,分化的心肌细胞在心肌损伤性疾病的潜在的治疗价值值得进一步研究。     

5-氮胞苷诱导心肌组织中c-kit~+干细胞分化的实验研究

目的:创建小鼠心肌干细胞(cardiac stem cells,CSC)分离、培养的方法,借助干细胞表面标记c-kit纯化CSC,并用5-氮胞苷诱导CSC分化为心肌细胞。方法:用酶定时消化方法分离提取小鼠心脏组织中的细胞,进行体外培养;免疫磁珠法纯化c-kit阳性细胞,并用流式细胞仪检测纯化后细胞表面标记c-kit、lin和CD34的表达;以免疫细胞化学染色法检测诱导后心肌特异性蛋白T、连接蛋白-43、心肌细胞特异性结蛋白;结合形态学变化,分析不同诱导条件作用结果之间的差异。结果:从C57BL小鼠心肌组织中分离消化所得的细胞中,含有一种小而圆形、折光性强的细胞,经传代培养的细胞增殖速度比原代细胞明显为快,存在较多的类似于干细胞增殖和形态学特点的细胞。用免疫磁珠法可以分选出高纯度的c-kit+CSC,这种CSC基本不表达CD34和lin。在不同诱导条件下,此种CSC可以分化为搏动的细胞,并能表达心肌特异性蛋白。结论:从C57BL小鼠心肌组织中可以获得CSC,用免疫磁珠法可以分选出表型为c-kit+-CD34--lin-高纯度的CSC,经5-氮胞苷诱导或改变CSC生长的微环境后,此种细胞可以分化成心肌细胞,且能形...     

骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞迁移能力变化的研究

目的研究体外定向诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经元样细胞的方法,探讨其分化后迁移能力变化的分子机制。方法体外培养BMSCs,以β-巯基乙醇(BME)1 mmol·L-1诱导分化,于诱导后12 h、24 h分别观察细胞形态变化,RT-PCR鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(Neurofilament)、胶质纤维酸性蛋白(β-tubulinⅢ)mRNA的变化。Western blot检测CXCR4表达变化,细胞迁移实验检测BMSCs诱导前后迁移能力的变化。结果诱导后,BMSCs胞体收缩,突起伸出;RT-PCR发现诱导出的神经元样细胞的NSE、Neurofilament、β-tubulinⅢmRNA明显增加;Western blot结果表明神经元样细胞表面CXCR4的表达明显增加,细胞迁移实验发现神经元样细胞向SDF-1α的迁移能力明显增加。用CXCR4特异的抑制剂AMD3100处理后细胞迁移被明显抑制。结论在体外骨髓基质干细胞以BME为诱导剂可定向分化为神经元样细胞,且发现其迁移能力明显增加,其机制可能与其表面CXCR4表达上调有关。     

三叶苷调控miR-539-5p表达保护缺氧缺糖心肌细胞损伤研究

摘要：目的:探讨三叶苷对缺氧缺糖心肌细胞损伤的保护作用及机制。方法:采用不同浓度的三叶苷作用于缺氧缺糖诱导的心肌细胞H9C2,试剂盒检测丙二醛（MDA）含量、乳酸脱氢酶（LDH）和超氧化物歧化酶（SOD）活性,流式细胞术、蛋白质印记（Western blot）检测细胞凋亡以及B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）和Bcl相关X蛋白（Bax）蛋白表达,实时荧光定量PCR（RTq PCR）检测miR-539-5p表达。转染miR-539-5p模拟物至H9C2细胞,检测过表达miR-539-5p对缺氧缺糖诱导的H9C2细胞损伤的影响。结果:三叶苷作用于缺氧缺糖诱导的H9C2细胞后,细胞中MDA含量、LDH释放量、细胞凋亡率和Bax蛋白表达水平显著降低,SOD活性、Bcl-2蛋白和miR-539-5p表达水平显著升高（P<0.05）。过表达miR-539-5p后,缺氧缺糖诱导的H9C2细胞中MDA含量、LDH释放量、细胞凋亡率和Bax蛋白表达水平显著降低,SOD活性、Bcl-2蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。抑制miR-539-5p表达可减弱三叶苷对缺氧缺糖诱导的H9C2细胞MDA含量、LDH释放量、SOD活性、凋亡,以及Bax和Bcl-2蛋白表达的影响。结论:三叶苷可有效降低缺氧缺糖诱导的心肌细胞损伤,其机制与上调miR-539-5p表达有关。     

复方积雪草有效组分干预肾小管上皮细胞Toll样受体4表达的实验研究

目的：探讨复方积雪草有效组分-积雪草苷／大黄素干预肿瘤坏死因子α（TNF—α）诱导的小鼠肾小管上皮细胞（mTEC）Toll样受体4（TLR4）mRNA及蛋白的表达水平。方法：采用mTEC,模型组用TNF—α 5ng／mL诱导,治疗组在TNF-α诱导的同时,以不同浓度的积雪草苷合大黄素进行干预,于24h后分别提取细胞RNA及上清,应用逆转录．聚合酶链反应（RT-PCR）和流式细胞术（FCM）分别检测mTEC TLR4 mRNA和膜蛋白的表达。结果：正常mTEC具有TLR4 mRNA和蛋白表达,经TNF-α诱导后TLR4表达明显上调,当积雪草苷合大黄素干预浓度达4ug／mL＋0．4ug／mL时,能够抑制TLR4 mRNA及蛋白的表达水平。结论：复方积雪草有效组分能够抑制TNF-α上调所致的肾小管上皮细胞TLR4过度表达,从而缓解肾脏局部失控性炎症反应。     

干预NRG-1/ErbB通路对大鼠脂肪干细胞向类窦房结细胞分化的影响

目的探讨在大鼠脂肪干细胞(ADSCs)向心肌样细胞分化的一定时期内,通过干预NRG-1/ErbB通路是否可调控其向类窦房结样细胞或工作肌样细胞分化。方法分离培养大鼠ADSCs,免疫荧光测定细胞相关表面抗原鉴定其干细胞特性。取3代ADSCs加入含10μmol.L-15-氮胞苷(5-Aza)和10μg.L-1bFGF的培养基处理24 h后分3组向心肌样细胞诱导分化,包括对照组、AG1478组、神经调节蛋白-1(NRG-1)组,取正常培养的为ADSCs组。诱导3周后,通过RT-PCR检测各组NKx2.5、HCN4、TBX3、TBX2基因,Westernblot检测TBX3蛋白,膜片钳检测各组动作电位的表达差异。结果 ADSCs加5-Aza诱导3周后表达心脏早期转录因子Nkx2.5及肌钙蛋白,证明5-Aza可以将ADSCs诱导成心肌样细胞。而AG1478组起搏相关基因(HCN4、TBX3、TBX2)的表达明显强于对照组及NRG-1组(P<0.05),TBX3蛋白也强于对照组(P<0.05),并能产生窦房结样动作电位。而NRG-1组Nkx2.5的表达高于对照组及AG1478组(P<0.05),亦能检测到心室肌样动作电位。结论在大鼠AD-SCs向心肌样细胞分化的一定时间内通过干预NRG-1/ErbB通路可使其定向分化为起搏样细胞或工作肌样细胞,这为今后干细胞生物起搏研究做了有益探讨。     

促大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究

目的探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的体外培养和向神经元样细胞分化的方法。方法通过梯度分离获得成年大鼠MSCs,在细胞因子和氧化剂作用下对其诱导分化为神经元样细胞,免疫细胞化学方法检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和神经巢蛋白（Nestin）的表达情况,流式细胞仪检测分析诱导率。结果BMSCs被转化神经元样细胞并表达Nestin。应用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、叔丁基对羟基茴香醚（BHA）所获得的神经元样细胞诱导率高（49.7%）。结论bFGF、BHA能促进大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

骨髓间充质干细胞诱导分化成心肌细胞表型的调控机制研究

目的：通过基因芯片等技术对BMSCs向心肌分化过程的研究，寻找启动心肌分化的特异基因。方法：BM-SCs的体外培养，与乳鼠心肌细胞共培养后0．5周，2周，8周，提取细胞总RNA，以未诱导的BMSCs作对照，进行人类全基因组芯片检测。用RT-PCR检测心肌分化相关的基因的时序表达。结果：基因芯片比较BMSCs诱导前后差异基因的表达水平，发现诱导0．5周、2周和8周时表达明显升高（ratio〉5）的基因分别是54个、572个和634个，表达下调（ratio〈0．2）的基因分别是57个、336个和1874个。TNNT2是三组细胞都表达升高的基因。随着时间的推移．表达上调的基因逐步增加，同时下调基因也增加，尤其是第8周。基因的时序性表达发现HOP，Nkx2．5和GATA4基因在诱导前几乎没有检测到阳性表达，诱导后0．5周表达增强，1-2周表达达到高峰，维持一定水平后到4-8周表达呈下降趋势。心肌特异性基因β-MHC和ANF在0．5周开始出现，表达随时间逐渐增加，2周达到高峰。结论：分化诱导相关基因如IGF，FGF等的表达与心肌发育分化相关，转录因子在心肌分化过程中起重要作用。然而心肌的分化实际上极为复杂，转录因子间相互作用的因素，尚需进一步探讨。     

基于TLR4介导的细胞焦亡通路研究红景天苷预防心肌纤维化的作用机制

目的 探讨红景天苷对小鼠心肌纤维化和焦亡的影响及潜在的作用机制。方法 将小鼠随机分为对照组、模型组和红景天苷低、中、高剂量组，每组各10只。除对照组外，其余各组小鼠皮下注射异丙肾上腺素5 mg/（kg·d）造模。自造模之日起，红景天苷低、中、高剂量组小鼠每日灌胃红景天苷10、30、50 mg/kg，对照组和模型组小鼠每日灌胃生理盐水10 mL/kg，连续14 d。末次给药后处死小鼠，以苏木素-伊红染色法观察小鼠心肌组织病理变化并计算心肌细胞横径，Masson、Sirius Red染色法观察小鼠心肌组织纤维化程度并计算心肌胶原容积分数（CVF），实时荧光定量PCR法检测小鼠心肌组织中Ⅰ型胶原蛋白（ColⅠ）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Toll样受体4(TLR4)、NOD样受体蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸蛋白酶1(caspase-1)、消皮素D(GSDMD)的mRNA表达水平，Western blot法和免疫组织化学法检测小鼠心肌组织中ColⅠ、α-SMA、TLR4、NLRP3、caspase-1、GSDMD的总蛋白表达水平及蛋白阳性细胞积分。结果 与对照组比较，模型组小鼠心肌细...     

硼替佐米联合5-杂氮胞苷抑制JAK/STAT信号通路对T细胞淋巴瘤细胞增殖和凋亡的影响北大核心CSCD

目的研究硼替佐米联合5-杂氮胞苷对T细胞淋巴瘤细胞增殖、凋亡及机制。方法对照组Jurkat细胞以3μmol·L^(-1)5-杂氮胞苷处理,低、中、高剂量实验组以10,30,50 nmol·L-1的硼替佐米+3μmol·L^(-1)5-杂氮胞苷处理,空白组加等量生理盐水。用噻唑蓝(MTT)法及流式细胞术检测细胞增殖、凋亡,用蛋白免疫印迹法检测细胞JAK/STAT信号通路蛋白表达。结果干预72h后,对照组和低、中、高剂量实验组细胞增殖抑制率分别为(39.05±2.63)%,(31.26±2.43)%,(60.12±3.05)%,(72.16±3.64)%。干预24,48,72 h后,中、高剂量实验组细胞增殖抑制率均高于对照组,且随硼替佐米浓度增大及作用时间延长逐渐升高(P<0.05)。干预48 h后,对照组和低、中、高剂量实验组细胞凋亡率均显著高于空白组。对照组和低、中、高剂量实验组细胞增殖指数低于空白组,凋亡率高于空白组(均P<0.05);且实验组增殖指数均低于对照组,细胞凋亡率均高于对照组(均P<0.05)。空白组、对照组和低、中、高剂量实验组Janus激酶1(JAK1)蛋白相对表达量为2.68±0.22,2.15±0.31,1.82±0.25,1.53±0.15,0.89±0.14,TYK2蛋白相对表达量为3.84±0.56,2.25±0.46,2.37±0.39,2.26±0.33,1.28±0.26;对照组和低、中、高剂量实验组Janus激酶1(JAK1)、TYK2蛋白相对表达量均低于空白组(均P<0.05),低、中、高剂量实验组JAK1蛋白及高剂量实验组TYK2蛋白相对表达量低于对照组(均P<0.05)。结论硼替佐米可协同增强5-杂氮胞苷抑制T细胞淋巴瘤细胞的增殖,并促其凋亡,其作用机制与显著抑制JAK/STAT信号通路中蛋白表达有关。     

碱性成纤维生长因子联合丹酚酸B诱导间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的探讨碱性成纤维生长因子(FGF-2)、丹酚酸B(SalB)以及二者联合诱导(FGF-2+SalB)对骨髓间充质干细胞(MSC)定向分化为心肌样细胞的影响。方法取SD大鼠四肢骨骨髓,分离培养MSC,对第2代MSC定向诱导,依次为FGF-2组、SalB组、FGF-2+SalB组以及空白对照组,相差显微镜观察细胞形态变化;免疫细胞化学技术检测诱导4周BMSC结蛋白,α-横纹肌肌动蛋白、心肌肌钙蛋白T(cTnT)及心肌连接蛋白43(Cx43)的表达;透射电镜对分化细胞进行鉴定;以半定量RT-PCR法在诱导后7,14和28 d检测细胞心肌早期转录因子GATA-4,Nkx2.5的表达。结果诱导各组的BMSC均可见结蛋白、α-横纹肌肌动蛋白、cTnT及Cx43的阳性细胞,其中联合诱导组的阳性率均最高。诱导各组与对照组上述四标记物的阳性率均具有显著性差异(P<0.05)。透射电镜观察:分化细胞的胞质内可见平行排列的肌丝,多靠近细胞膜,并富含内质网、线粒体、糖原和核糖体。RT-PCR结果显示,诱导组细胞GATA-4和Nkx2.5于诱导后7 d弱表达,14 d表达增强,28 d表达减弱。结论 FGF-2,SalB以及二者联合,均可将MSC诱导为心肌分化表型,其中FGF-2+SalB组各蛋白阳性表达率最高,其心肌样细胞的转化率亦高于其他组。     

类叶升麻苷调控CREG表达对oxLDL诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用

摘要：目的:探讨类叶升麻苷对氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）损伤的影响及机制。方法:不同浓度(1,10,100μmol·L-1)的类叶升麻苷作用于oxLDL诱导的HUVEC细胞,酶联免疫吸附法检测细胞中丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽还原酶（GSH-Px）活力,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白印迹（Western blot）法检测B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白（Bax）和E1A激活基因阻遏子（CREG）蛋白表达水平,实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测CREG mRNA表达水平。转染CREG过表达载体或CREG小干扰RNA至HUVEC细胞,构建CREG过表达或CREG表达抑制的HUVEC细胞。oxLDL诱导CREG过表达的HUVEC细胞,或类叶升麻苷作用于oxLDL诱导的CREG表达抑制的HUVEC细胞,上述相同方法检测MDA含量、SOD和GSH-Px活力、细胞凋亡率、Bcl-2和Bax蛋白表达。结果:oxLDL诱导HUVEC细胞后,MDA含量、细胞凋亡率和Bax蛋白水平升高,SOD和GSH-Px活力、Bcl-2蛋白及CREG mRNA和蛋白水平降低（P<0.05）。类叶升麻苷或过表达CREG可降低oxLDL诱导的HUVEC细胞MDA含量、凋亡率和Bax蛋白表达,提高SOD和GSH-Px活力及Bcl-2蛋白表达（P<0.05）。类叶升麻苷可促进oxLDL诱导的HUVEC细胞CREG mRNA和蛋白表达（P<0.05）,抑制CREG表达降低了类叶升麻苷对oxLDL诱导的HUVEC细胞MDA含量、SOD和GSH-Px活力、细胞凋亡率及Bax和Bcl-2蛋白表达的影响（P<0.05）。结论:类叶升麻苷通过上调CREG表达降低oxLDL诱导的HUVEC细胞氧化应激和凋亡,减轻细胞损伤。