干细胞若干定义的相关探讨

背景：近10年来干细胞研究所取得的巨大进展,不仅影响和促进了生物学及其相关基础科学,而且还在医学、药物开发、农业等许多领域得到广泛的应用,目前已成为研究的热点问题。 目的：在干细胞的定义上还存在一些需要探讨的问题,明确定义将有利于干细胞研究的快速发展。 方法：回顾干细胞的发展和概念提出,特别是通过中英文权威定义的比较,提出作者的看法。 结果与结论：干细胞的定义上还存在一些问题值得探讨,特别是一些中英文表述不同影响了理解。例如,“多能干细胞”对应译成两个单词：Pluripotent Stem Cell和Multipotent Stem Cell,然而Pluripotent和Multipotent两个单词的英文意义不同。为了学术交流和沟通,作者提出将Pluripotent Stem Cell称为“万能干细胞”,而保留Multipotent Stem Cell为“多能干细胞”的定义。以上结论供广大同仁探讨,以利于抛砖引玉。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

胚胎干细胞诱导发育为树突状细胞的研究

目的：探讨胚胎干细胞（ESC）诱导分化为树突状细胞（DC）的实验方法，实现体外大规模扩增高纯度DC用于临床免疫治疗。方法：E14小鼠胚胎干细胞系在GM-CSF与IL-3联合作用下经胚胎体（EB）诱导分化为DC。不成熟DC （im-DC）流式细胞仪检测CD11c、CD80、CD86、MHC II-DR表达。用磷酸脂多糖（LPS）促进DC的成熟，收获细胞后观察细胞形态及摄片并做扫描电镜检查，分析细胞表型并与不成熟DC细胞表型做对比，异体淋巴细胞增殖实验行功能检测。结果：ES细胞来源DC呈典型DC形态学表现。im-DC CD11c、CD80、CD86、MHC-II表达低,m-DC CD11c、CD80、CD86、MHC-II的表达均较前明显升高。功能检测发现，ES细胞来源的DC具有强烈的激发同种异体淋巴细胞增殖的作用，证实ES细胞来源的DC具备正常的免疫学功能。结论：使用GM-CSF联合IL-3能成功诱导E14胚胎干细胞发育为DC。故ES细胞可作为DC来源的一条新途径，对于体外大规模制备DC用于免疫过继治疗提供了一个较好的方法。     

含人AGM区基质细胞培养体系定向诱导胚胎干细胞为造血干细胞的实验研究

目的： 体外模拟胚胎早期AGM区造血微环境，诱导胚胎干细胞（ESCs）分化为造血干细胞（HSCs）。方法：将小鼠E14 ESCs在含BMP-4及VEGF的半固体培养基中诱导为拟胚体（EB），分别于3、6、9、12、15 d时收获EB，流式细胞术检测Flk-1+细胞含量。取Flk-1+ 细胞处于高峰期的EB细胞，在人AGM区基质细胞饲养层上进一步诱导分化，并设无饲养层对照，分别于3、6、9、12 d时收获细胞计数、流式细胞术检测Sca-1+c-kit+ 细胞含量，并分析造血细胞集落形成能力。结果：诱导E14细胞形成EB过程中添加BMP4+VEGF的因子组Flk-1+细胞在第9 d达峰值（27.53%± 2.84％），与未添加因子组（8.77%± 1.12％）比较差异显著(P<0.05)。将培养9 d的EB细胞在hAGMS3、hAGMS4饲养层上进一步诱导分化，第6 d时Sca-1+c-kit+细胞达峰值，分别为7.31%±1.21％、7.62%±1.52％，其绝对数分别扩增(2.57±0.48)倍、(2.35±0.36)倍，与无饲养层组比较显著差异（P<0.05）。该分化阶段的Sca-1+c-kit+细胞具有形成各系造血细胞集落的能力。结论：人胚早期AGM区基质细胞能促进小鼠ESCs定向分化为HSCs，为研究ESCs分化为HSCs的分子机制提供了实验模型。     

人多能干细胞的冷冻与保存

背景：人多能干细胞的出现与发展是近年来生物医学研究领域的重大突破。但其在基础/临床研究中的广泛应用还有诸多限制,建立安全有效标准化的冷冻保存方案是人多能干细胞广泛应用面临的重大挑战。 目的：回顾人多能干细胞冷冻领域的研究进展,探索造成冷冻损伤的原因和机制及改进方式,致力于促进新的更有效的冷冻方案形成。 方法：以“人多能干细胞、人胚胎干细胞、人诱导多能干细胞、玻璃化、程序化冷冻、慢冻法、冷冻保存”为中文检索词,以“human pluripotent stem cells,human embryonic stem cell,human introduced pluripotent stem cell,vitrification,programmed cryopreservation,slow-freezing,cryopreservation”为英文检索词,应用计算机检索中国知网全文数据库、万方全文数据库、维普(VIP)期刊全文数据库、PubMed数据库有关人多能干细胞冷冻保存技术的文献,排除与研究目的无关及重复文献,保留58篇文献进一步总结分析。 结果与结论：了解人多能干细胞冷冻过程中造成冷冻损伤的原因和机制,是寻找高效的冻存方案的关键。需要更清晰的了解冷冻过程中损伤的原理,改进和创新低温生物技术来避免各种冷冻损伤的发生并致力于探讨可重复的,高效的,符合GMP要求的,能大规模冻人多能干细胞的方案。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

体外分化胚胎干细胞为造血干细胞重建造血功能的研究

目的：探讨体外定向分化胚胎干细胞（ESCs）为造血干细胞（HSCs）对体内造血功能的重建作用。方法：将小鼠E14.1胚胎干细胞采用“三步诱导法”在体外分化发育为HSCs，造血克隆形成(CFU)实验观察其体外造血集落形成情况，免疫磁珠分选纯化HSCs移植给经亚致死剂量γ射线照射的雌性SCID小鼠，观察其植入及小鼠造血功能恢复情况。结果: 经过分阶段诱导，多种造血刺激因子联合应用能有效促进ESCs定向分化发育为HSCs,流式细胞仪检测HSCs特异性表面标志物CD34+/Sca-1+表达最高为（58.64±4.20）%，CFU培养能形成较多的红系、粒系/巨噬细胞系及混合细胞集落, Wright-Giemsa 染色显示为原始的造血细胞。此阶段的HSCs经分选纯化后移植给经γ射线照射后的小鼠，移植组小鼠+10 d造血功能开始恢复，观察40 d后除血小板恢复较慢外，白细胞、红细胞、血红蛋白等指标已接近正常，植入率为71.4%，存活率为43.0%，染色体检测证实已由受体鼠的XX转为供体鼠的XY。结论: 采用分阶段诱导的方法，可在体外定向诱导小鼠ESCs分化发育为HSCs，此来源的HSCs可以有效重建体内造血功能。     

肿瘤干细胞与胶质瘤细胞起源

经过过去20年的努力,癌基因和抑癌基因在神经胶质瘤形成及发展中的核心地位已达共识.然而,在生命科学研究突飞猛进、肿瘤诊断与治疗手段日新月异的今天,我们尚未确立这些核心分子在胶质瘤中作用的靶标,因此,胶质瘤的细胞起源-这一决定着人类最终克服胶质瘤的根本问题再度引起人类的关注.     

持续Wnt信号通路激活促进胚胎干细胞源造血干细胞的增殖

背景：如何提高胚胎干细胞诱导效率、促进胚胎干细胞源造血干细胞体外增殖成为目前急需解决的课题。目的：以外源性Wnt3a作为诱导剂,激活培养中的小鼠胚胎干细胞Wnt/β-catenin信号通路,观察该通路的激活是否促进胚胎干细胞向造血祖细胞的定向分化。方法：用外源性wnt3a(100 µg/L)持续作用ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞21 d,通过细胞免疫荧光及蛋白免疫印迹检测细胞内β-catenin蛋白含量,QRT-PCR检测Wnt下游靶标基因的表达量来确定经典Wnt/β-catenin信号通路是否被激活,然后采用单层贴壁培养法诱导其向造血干细胞分化,流式细胞仪检测造血发育相关表面标志CD34⁺/Sca-1⁺,同时以QRT-PCR法检测造血相关基因的表达情况。结果与结论：ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞经wnt3a(100 µg/L)连续培养21 d后发现β-catenin蛋白在细胞内积累;Wnt信号通路的下游靶标基因Pitx2、Frizzled、Sox17、Oct4的表达量均出现不同程度的增加,可见经典Wnt/β-catenin信号通路有被激活;单层贴壁培养法诱导其向造血干细胞分化的过程中检测到CD34⁺/Sca-1⁺细胞含量在14 d时占总细胞量高达20.2%,而对照组的仅占11.9%。造血相关基因骨形态发生蛋白4、FLK2及CD34的表达量均增加,而Smad5的表达则明显受到抑制。说明Wnt3a持续作用可激活Wnt/β-catenin信号通路,并促进ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的定向分化。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

间充质干细胞调节树突状细胞相关功能的研究进展

树突状细胞(DCs)作为体内最强大的抗原提呈细胞,是适应性免疫应答的始动者,在较多疾病的发生发展过程中起着重要作用.间充质干细胞(MSCs)是具有多向分化潜能的成体干细胞,由于其强大的自我修复、抑制炎症以及免疫调节作用已成为研究的热点.大量的研究表明MSCs能通过影响DCs的成熟及功能,达到缓解疾病的目的.通过对MSCs调节DCs功能调节的深入研究有望取得疾病治疗的新进展.     

放射状胶质细胞的研究进展

脊椎动物中枢神经系统(central neural system,CNS)发育过程中,有一类细胞与CNS的发育密切相关一神经干细胞(neural stem cells,NSCs),目前已知的NSCs主要有3种:神经上皮细胞、放射状胶质细胞(radial glial cells,RGCs)、基祖细胞.     

干细胞基础研究的新进展

近5年来,在世界范围出现干细胞的研究热潮,有关干细胞的论文大量发表,风起云涌。然而,有部分的实验结论缺乏充足的证据,而引起质疑。例如干细胞“横向分化”的假设错误地认为干细胞可以跨胚层、跨系别地任意地变身,脂肪变肝脏,肌肉变神经等等。成体干细胞的存在是21世纪一个伟大的科学发现。越来越多的实验证明成体组织中还存在胚胎发育过程遗留下的各个胚层的干细胞和各类组织干细胞。全身各类组织中的成体干细胞含有除了生殖干细胞外的各种干细胞。至今,只有在生殖组织中才能发现生殖干细胞,因而生殖组织以外的成体干细胞又称为亚全能干细胞。成体干细胞包括造血和非造血的干细胞,非造血的干细胞又包括了各种非造血组织的干细胞,例如神经干细胞和间充质干细胞等。间充质干细胞是全身结缔组织(骨、软骨、肌肉、脂肪、纤维、血管等)的干细胞,它是创伤、烧伤、缺血坏死、骨髓损伤等修复过程中所必不可少的,有巨大的临床应用前景。随着生命科学的全面发展,干细胞领域中的认识误区将逐步得到澄清,干细胞科学也必将健康地发展起来。     

人胚胎干细胞向间充质干细胞分化的低血清诱导法的建立

目的建立人胚胎干细胞向间充质干细胞分化的低血清诱导方法。方法用低血清培养体系培养人胚胎干细胞,每3 d半量换液,7~10 d后消化成单细胞用扩增培养基培养,每3 d传代1次。结果人胚胎干细胞呈克隆样增殖,边缘呈锯齿状,表达多能干细胞标志OCT4、SOX2和NANOG。诱导3 d后,克隆间隙出现体积较小的成纤维样细胞,增殖能力强,经两次传代后可获得形态一致的长梭形细胞。这些细胞表达间质细胞标志VIMENTIN,细胞均表达CD105、CD90、CD73、CD44和HLA-ABC,不表达CD34、CD45和HLA-DR,且具有成脂和成骨分化能力。结论用低血清诱导法能快速获得较高纯度的人胚胎干细胞源性间充质干细胞。     

人骨髓间质干细胞向造血细胞分化潜能的实验研究

目的:在体研究人骨髓间质干细胞(hBMMSCs)向造血细胞分化的潜能。方法:将hBMMSCs经尾静脉注射给环磷酰胺处理的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠,利用流式激活细胞分析系统(FACS)检测hBMMSCs输注后存活35d的SCID小鼠外周血、骨髓和脾脏中人源性造血细胞的表型和水平。结果:hBMMSCs输注组外周血(PB)、骨髓(BM)和脾脏(spleen)中可检测到人CD45⁺/H-2D^d-、CD34⁺/H-2D^d-细胞,而对照组PB、BM和脾脏均未检测到上述表型的人造血细胞。结论:hBMMSCs具有向造血细胞分化的潜能。     

人诱导性多能干细胞向神经干细胞分化的方法探讨

目的:探讨人诱导性多能干细胞(iPS细胞)体外定向分化为神经干细胞(NSCs)的方法。方法:人iPS细胞悬浮培养4 d形成的拟胚体(EB)经维甲酸(RA)诱导4 d,诱导后的EB在无血清培养基中筛选并扩增培养。倒置显微镜下观察诱导后细胞的形态变化,RT-PCR检测iPS细胞多能性基因Nanog、Oct4和Sox2的表达,免疫荧光法检测NSCs特异性标志物Nestin、神经元标志物β-tubulinⅢ和神经胶质细胞标志物GFAP的表达。结果:(1)人iPS细胞在饲养层细胞上稳定传代,表达多能性基因Nanog、Oct4和Sox2,去除饲养层后悬浮培养能形成球形EB;(2)经RA诱导后的EB在无血清培养基中筛选培养第1 d贴壁生长,周围爬出细胞;第3 d,在高倍镜下可见中央聚集的细胞呈环形的rosette结构,rosette结构增多到第7 d达高峰。对照组未观察到rosette结构。随后大部分rosette细胞脱离瓶壁悬浮生长,形成神经球样克隆。免疫荧光显示神经球呈nestin阳性表达。贴壁培养的神经球能分化成β-tubulinШ和GFAP阳性细胞。结论:RA诱导结合无血清培养基筛选法能诱导iPS细胞高效分化为NSCs。     

后肾细胞微环境诱导胚胎干细胞向肾系细胞分化的实验研究

目的: 探讨胚胎后肾细胞微环境诱导胚胎干细胞(ESCs)分化为肾系细胞的作用。方法: 小鼠D3系胚胎干细胞通过悬滴法制备拟胚体(EBs),将EBs细胞与取自孕12.5 d小鼠胚胎的后肾细胞通过间接共培养以诱导其分化,即为共培养诱导组,设EBs细胞自然分化为对照组;采用免疫荧光染色法检测共培养第3、5、7 d后的EBs细胞Pax2、WT-1蛋白表达情况,通过逆转录PCR法检测诱导3 d后的EBs细胞Pax2、WT-1、Lim1、Sall1、Emx2、GDNF、Wnt4、BMP7、Nephl、Nephrin、KSP和CD24 mRNA的表达情况。结果: EBs细胞在诱导的第3 d即出现了全部肾发育相关基因的表达,其中共培养组Pax2、WT-1、Emx2、GDNF、Nephl、Nephrin、KSP和CD24的表达强于对照组;免疫荧光结果显示在诱导3 d后的EBs细胞中可观察到Pax2阳性细胞,阳性细胞数在共培养第5、7 d增多;诱导5 d后可观察到WT-1阳性细胞,对照组未见Pax2或WT-1蛋白阳性细胞出现。结论: 后肾细胞微环境可促进ESCs分化为肾系细胞。     

牙周膜干细胞诱导骨髓间充质干细胞的牙向分化

目的 探讨牙周膜干细胞(PDLSC)诱导骨髓间充质干细胞(BMMSC)牙向分化的机制,为联合应用PDLSC和BMMSC再生牙周复合体提供实验依据.方法应用Transwell(R)小室法间接联合培养小型猪PDLSC和BMMSC,根据二者混合比例随机分为3组.A组:P∶M=10∶1共培养组;B组:P∶M=1∶1共培养;C组:P:M=1:10共培养,单独PDLSC和BMMSC培养组分别为阳性和阴性对照组.培养14 d,应用免疫荧光染色和实时定量PCR(qRT-PCR)分别检测scleraxis、osteocalcin(OCN)、osterix(OSX)、细胞外基质磷酸糖蛋白(MEPE)蛋白和mRNA表达情况,以判定PDLSC诱导BMMSC成牙的最佳配比比例.结果 免疫荧光染色和qRT-PCR结果均显示scleraxis、OCN和OSX相对mRNA表达水平在A、B、C组间没有统计学差异(P>0.05),但相对MEPE mRNA表达水平在A组却明显高于B组和C组(P＜0.01).结论 联合培养可促进BMMSC获得不同程度的PDLSC特性,且少量的PDLSC同样可以促进BMMSC获得牙源性干细胞特性.     

Engraftable neural crest stem cells derived from cynomolgus monkey embryonic stem cells

Neural crest stem cells (NCSCs), a population of multipotent cells that migrate extensively and give rise to diverse derivatives, including peripheral and enteric neurons and glia, craniofacial cartilage and bone, melanocytes and smooth muscle, have great potential for regenerative medicine. Non-human primates provide optimal models for the development of stem cell therapies. Here, we describe the first derivation of NCSCs from cynomolgus monkey embryonic stem cells (CmESCs) at the neural rosette stage. CmESC-derived neurospheres replated on polyornithine/laminin-coated dishes migrated onto the substrate and showed characteristic expression of NCSC markers, including Sox10, AP2α, Slug, Nestin, p75, and HNK1. CmNCSCs were capable of propagating in an undifferentiated state in vitro as adherent or suspension cultures, and could be subsequently induced to differentiate towards peripheral nervous system lineages (peripheral sympathetic neurons, sensory neurons, and Schwann cells) and mesenchymal lineages (osteoblasts, adipocytes, chondrocytes, and smooth muscle cells). CmNCSCs transplanted into developing chick embryos or fetal brains of cynomolgus macaques survived, migrated, and differentiated into progeny consistent with a neural crest identity. Our studies demonstrate that CmNCSCs offer a new tool for investigating neural crest development and neural crest-associated human disease and suggest that this non-human primate model may facilitate tissue engineering and regenerative medicine efforts.     

人诱导性多能干细胞定向分化为神经干细胞的实验研究

目的 观察人诱导性多能干细胞（iPS细胞）定向分化为神经干细胞（NSCs）的潜能。方法 用维甲酸（RA）诱导人iPS细胞向NSCs分化。倒置显微镜下观察iPS细胞的形态变化,RT-PCR检测NANOG, OCT4, SOX2的表达;免疫组织化学方法检测NESTIN、SOX2、β-TUBULIN Ш和GFAP的表达。结果RA诱导后第4天,贴壁的拟胚体出现了早期神经祖细胞特有的神经管样结构并不断增多,细胞表达神经巢蛋白NESTIN,而对照组未观察到神经管样结构。神经管样结构内的细胞能分化为β-TUBULIN Ш阳性的神经元,但GFAP阳性的星形胶质细胞少见。结论 人iPS细胞具有定向分化为NSCs的潜能,并能模拟神经发育过程。     

不同代次大鼠脂肪间充质干细胞增殖及成神经球的能力比较

背景：脂肪间充质干细胞是一组具有多向分化潜能的干细胞,体外在一定条件下可分化为神经干细胞。 目的：观察不同代次大鼠脂肪间充质干细胞体外培养增殖能力及诱导成神经球的潜力。 方法：取SD大鼠脂肪体外分离培养出脂肪间充质干细胞并传代扩增,分别在P3、P6、P10、P20时观察其形态学变化、测定增殖速度。流式细胞仪检测定不同代次细胞表型及细胞周期。将脂肪间充质干细胞诱导为神经球,计数成神经球率。 结果与结论：脂肪间充质干细胞主要呈长梭形,不同代次的脂肪间充质干细胞均具有很强的体外增殖能力;除P3细胞其他代次细胞均高表达CD29、CD44、CD73,低表达CD45、CD34。细胞周期中G0/G1期细胞所占比例P3为93.4%、P6为92.7%、P10为92.4%、P20为86.0%。P6、P10诱导成神经球率均显著高于P20(P < 0.05),P3细胞较难诱导成神经球。提示以脂肪间充质干细胞作为种子细胞时,应注意选择适宜的扩增代数,以便在获得足够纯度细胞的同时保留细胞最佳的分化潜力。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

间充质干细胞的生物学特性及临床应用

背景：间充质干细胞的临床应用是干细胞移植研究的热点,但其安全性和有效性仍存在争议。 目的：回顾总结近年来对于间充质干细胞的生物学特性及临床应用前景的研究。 方法：计算机检索Pubmed(1990年1月至2013年11月)和中国知网数据库（2011年至2013年）,检索关键词为“间充质干细胞;分离培养;表面抗体;诱导分化;临床应用”。 结果与结论：间充质干细胞可表达多种表面抗原,但没有特异性,同时其具有自我更新和向骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞和神经细胞等的多向分化能力。由于其多向分化潜力,且能分泌多种细胞因子,还具有免疫调节能力,已成为再生医学、血液学和免疫学方面细胞疗法的候选细胞。间充质干细胞临床试验已处于第三期,尽管数据还不多,已发现存在利于肿瘤生长和转移、增加侵袭性真菌感染等方面问题。即使如此,其在血液系统恶性肿瘤等疾病面方面仍存在良好的应用前景。所以,找出间充质干细胞在体内的作用原理及修复其产生的不良影响是目前干细胞移植研究的重点。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：