新生大鼠海马区及室管膜下区神经干细胞分离、培养和分化特性

目的建立大鼠神经干细胞（NSCs）分离、培养方法，观察其生长、增殖和分化特点。方法利用无血清培养技术，从新生大鼠海马、室管膜下区分离NSCs，进行体外扩增培养、传代观察。采用荧光免疫细胞化学检测技术，观察鉴定NSCs及其分化结果。结果分离获取的细胞具有自我更新和增殖能力，原代及传代培养均可形成细胞克隆，克隆中的细胞巢蛋白（nestin）表达阳性，显微镜下观察见典型的干细胞特征，诱导后可分化神经元和星形胶质细胞。结论上法分离培养的细胞为具有自我更新和增殖能力的NSCs，可诱导分化为终末神经细胞。     

大鼠胚胎神经干细胞两种不同分离、传代方法的比较

目的体外培养大鼠胚胎神经干细胞(NSCs),比较不同分离、传代方法对其生长的影响。方法取怀孕15d的大鼠,分别用机械分离法和含0.01%EDTA的胰蛋白酶消化法分离海马区细胞,均以1×106/mL的活细胞密度接种到无血清的NSCs培养基中培养,分离纯化至P5代。以含10%胎牛血清(FBS)和2%多聚赖氨酸的DMEM/F12诱导分化,免疫细胞化学鉴定。结果机械分离组获得的活细胞及培养后的神经干细胞球数目明显多于胰蛋白酶消化组,其细胞贴壁率却高于胰蛋白酶消化组。取神经干细胞球及诱导分化后的细胞作免疫细胞化学染色鉴定,细胞分别呈Nestin、β-tubulin-Ⅲ、GFAP和O4阳性反应。结论大鼠胚胎海马区有NSCs存在,离体培养时能分裂增殖,并能被诱导分化。机械分离法和胰蛋白酶消化法各有利弊,可以根据实验情况交叉采用两种不同的分离方法,以稳定高效地培养出NSCs。     

丝裂原在海马神经干细胞培养中的作用

目的 研究表皮生长因子(epidemal growth factor，EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)在海马神经干细胞培养中的作用，确定适合海马神经干细胞体外培养的丝裂原。方法 应用EGF和bFGF刺激海马神经干细胞增殖，观察神经干细胞生长、增殖和分化等特性。结果 EGF和bFGF都能刺激神经干细胞扩增，bFGF反应性神经干细胞团增殖缓慢，细胞团中部分细胞迁出，迁出的细胞形成新的细胞团或分化成神经细胞或神经胶质细胞，而且bFGF反应性神经干细胞贴壁很紧，不易传代；相反，EGF反应性神经干细胞快速增殖，易于传代，较少迁移和分化。结论 EGF可促使海马神经干细胞快速增殖，是体外培养海马神经干细胞比较合适的丝裂原。     

大鼠神经干细胞体外培养

目的:介绍一种较成熟的大鼠神经干细胞体外培养方法。方法:取新生大鼠(1d之内)侧脑室前角周围的脑组织,用EDTA:胰蛋白酶(1:1)消化,制成单细胞悬液,以2-5×105个细胞/ml接种于无血清培养基中。观察其增殖、分化情况,并用nestin、GFAP、NSE免疫细胞化学对细胞进行定性。结果:培养细胞呈悬浮生长,具有增殖能力,倍增时间为2d,nestin阳性。诱导分化后细胞贴壁生长,体积增大,并发出形态各异的突起。可见GFAP和NSE阳性细胞。结论:培养细胞经鉴定为神经干细胞。本方法简单、易操作,可行性强。     

大鼠胎脑皮质神经干细胞体外培养及诱导分化的实验研究

目的 从孕龄15d SD胚胎鼠脑皮质中分离并培养神经干细胞（neural stem cells。NSCs），观察其生长、增殖及分化。方法 采用包含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮细胞生长因子（EGF）的无血清培养及单细胞克隆技术，对胚胎鼠脑皮质神经干细胞进行原代、传代培养及诱导其分化。用Nestin染色鉴定神经干细胞特性，用免疫组化方法（β-Ⅲ-tubulin、GFAP染色）检测神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞状况。结果 从孕龄15dSD胚胎鼠脑皮质中分离的组织，经原代及传代培养均可形成细胞克隆．切具有增殖能力。原代及传代培养细胞呈Nestin（神经上皮干细胞蛋白）表达阳性．诱导分化后的细胞表达神经元细胞、星形胶质细胞的特异性抗原。结论 本实验分离、培养的孕龄15dSD胚胎鼠脑皮质细胞Nestin表达阳性．分化后表达神经元和星形胶质细胞的标记物，是大鼠的神经干细胞，并具有多向分化潜能。     

大鼠胚胎神经干细胞的培养与鉴定

目的体外培养大鼠胚胎神经干细胞(NSCs),观察其生长、增殖特点。方法取孕15d的大鼠,采用机械分离法获取海马区细胞,以106个细胞/m l的密度接种到无血清NSCs培养基中培养,分离纯化至第5代。以10%胎牛血清(FBS)和2%多聚赖氨酸诱导分化,免疫细胞化学鉴定。结果取NSCs的细胞球及诱导分化后的细胞作免疫细胞化学染色鉴定,细胞分别呈小鼠抗巢蛋白(nestin)、小鼠抗微管蛋白(-βtubu lin)、豚鼠抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及小鼠抗O4免疫化学反应阳性。结论大鼠胚胎脑海马区有NSCs存在,离体培养时能分裂增殖,并能被诱导分化。     

体外神经干细胞培养特性观察

目的 探讨神经干细胞(NSCs)体外分离培养和增殖的特性.方法 从新生24h内的SD大鼠脑组织分离NSCs,采用无血清悬浮培养法进行NSCs体外扩增培养.倒置相差显微镜观察细胞形态,通过绘制细胞生长曲线观察NSCs的自我更新和增殖能力,采用免疫细胞化学法检测NSCs标志物神经上皮干细胞蛋白(Nestin)的表达及分化后细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和2,3-环核甘酸磷酸二脂酶(CNP)的表达.结果 从新生SD大鼠脑组织分离的细胞在无血清的培养基中形成悬浮的神经球.神经球具有自我更新和表达Nestin的能力,分化后的细胞能表达神经元、星型胶质细胞及少突胶质细胞的特异性抗原.结论 从新生大鼠的脑组织中成功分离出NSCs,其具有在体外自我更新和增殖、多向分化潜能及表达Nestin的能力.     

成年 SD 大鼠海马齿状回神经干细胞分离培养和鉴定的改良

目的：改良成年SD大鼠神经干细胞分离、培养及鉴定方法,观察神经干细胞的生长、增殖及分化特点,为后续实验提供细胞。方法从成年SD大鼠分离出完整海马齿状回,采用机械吹打法获得原代细胞,用accutase消化传代,利用cck-8法检测神经干细胞的增殖情况,利用多重免疫荧光细胞化学方法鉴定神经干细胞及其分化细胞。结果机械吹打法可高效获得原代神经干细胞,accutase消化传代更有利于神经干细胞的传代培养,cck-8法简单高效的测定了神经干细胞的增殖,多重免疫荧光创新性的动态展示了神经干细胞经诱导分化后的分化过程。结论改良后的方法可更简单高效的获得和培养出大量细胞,经多重免疫荧光鉴定所分离和培养的细胞是神经干细胞。     

新生大鼠全大脑组织分离诱导分化神经干细胞的体外实验

背景：神经干细胞的供体一般以胎鼠和成年鼠为主，利用细胞培养技术分离步骤较繁琐。 目的：以新生大鼠为神经干细胞供体，拟建立一种较为简便、细胞获得率较高的分离培养方法。 设计、时间及地点：以细胞为对象观察性实验，于2006-10/2007-03在重庆医科大学完成。 材料：新生1~3 d 的Wistar大鼠全大脑。 方法：以胰蛋白酶消化、无血清、悬浮培养原代细胞，并加含体积分数为0.10胎牛血清的DMEM/F12培养液诱导其分化。 主要观察指标：应用相差显微镜观察神经干细胞的生长特点及分化后的细胞形态学变化。应用间接免疫细胞化学染色法鉴定神经干细胞及其分化后神经元和胶质细胞标志蛋白的表达。以BrdU标记神经干细胞，观察其增殖情况。 结果：新生大鼠脑组织分离的细胞具有连续传代和增殖的能力，能稳定表达神经干细胞特异性巢蛋白。诱导分化后的细胞能表达神经元细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞的特异性蛋白。 结论：从新生大鼠脑组织分离培养出的神经干细胞获得率高，保持了干细胞的未分化属性，具有自我更新和多项分化潜能。     

不同浓度胰岛素对小鼠神经干细胞分化的影响

目的 体外培养获得神经干细胞并初步探讨不同浓度胰岛素对神经干细胞分化能力的影响。方法 小鼠胎脑细胞体外培养获得神经干细胞,并行免疫荧光检测鉴定。25ng／ml、50ng／ml、100ng／ml、125ng／ml、150ng／ml胰岛素诱导分化后,免疫荧光染色观察不同浓度胰岛素对神经干细胞分化的影响。结果 体外培养的神经球表达巢蛋白（nestin）,神经球分化的细胞表达神经丝和胶质纤维酸性蛋白。不同浓度胰岛素作用下的神经元分化率有差别。其中100ng／ml组的分化率最高。结论 体外培养的细胞为神经干细胞,100ng／ml浓度的胰岛素可以起到较好的促进神经元分化的效果。     

胚鼠室管膜神经干细胞体外诱导分化实验研究

目的探寻胚鼠室管膜分离培养及诱导分化为神经干细胞(NSCs)的可行性及规律性,为进一步寻找非神经组织性NSCs种子源提供阳性参照。方法将分离的胚脑室管膜组织以神经干细胞培养液孵育,确定神经干细胞的最佳体外生存环境,细胞培养所涉及的细胞因子主要有:EGF、bFGF和LIF(分别为20 ng/ml)。以细胞克隆方法判断神经干细胞增殖;以镜下细胞形态初步判断神经干细胞分化。结果胚鼠室管膜源性神经干细胞在相应培养条件下呈现出神经干细胞快速增殖,形成由多细胞组成的细胞球(神经球);进一步将这些细胞球分离成单细胞并重新以克隆密度培养,单个的细胞又很快变成岛屿状神经球。神经干细胞连续培养可进一步有小芽形成并发育成突起状结构、建立神经纤维联系,其中有的胞体增大,逐渐发育为较成熟的长突起细胞,长突起相互连接、交织成网。结论由胚鼠室管膜分离培养神经干细胞是可行的;神经干细胞在发育分化过程,基本上遵循着游离神经干细胞、神经细胞球、分化神经元/胶质细胞的生长规律,显现出神经干细胞有别于一般神经细胞的增殖及多分化特性。     

Activity-dependent signaling mechanisms regulating adult hippocampal neural stem cells and their progeny

Adult neural stem cells （NSCs） reside in a restricted microenvironment, where their development is controlled by subtle and presently underexplored cues. This raises a significant question： what instructions must be provided by this supporting niche to regulate NSC development and functions？ Signaling from the niche is proposed to control many aspects of NSC behavior, including balancing the quiescence and proliferation of NSCs, determining the cell division mode （symmetric versus asymmetric）, and preventing premature depletion of stem cells to maintain neurogenesis throughout life. Interactions between neurogenic niches and NSCs also govern the homeostatic regulation of adult neurogenesis under diverse physiological, environmental, and pathological conditions. An important implication from revisiting many previously-identified regulatory factors is that most of them （e.g., the antidepressant fluoxetine and exercise） affect gross neurogenesis by acting downstream of NSCs at the level of intermediate progenitors and neuroblasts, while leaving the NSC pool unaffected. Therefore, it is critically important to address how various niche components, signaling pathways, and environmental stimuli differentially regulate distinct stages of adult neurogenesis.     

不同无血清培养方式提取SHG44人脑胶质瘤干细胞的比较研究

目的筛选较理想的SHG44人脑胶质瘤干细胞的培养方法。方法采用无血清培养基(含EGF、FGF、B27)以培养皿、培养瓶及悬浮细胞培养板为载体培养SHG44人脑胶质瘤干细胞,通过CD133、Nestin联合Bcl-2标记进行免疫荧光鉴定,并对比其倒置显微镜下细胞形态及干细胞球的形态、大小及数目。结果培养皿和培养瓶初次富集的SHG44胶质瘤干细胞球呈较大不规则形,经二、三次纯化后发现第二与三次纯化后的大部分胶质瘤干细胞呈不规则分化状,大部分胶质瘤干细胞球呈分散、较小、不规则形生长,但第三次比第一、二次有更少的胶质瘤干细胞球却呈更规则球形生长;悬浮细胞培养板提取、纯化的干细胞呈类圆形,基本全部形成胶质瘤干细胞球,且第三次比第一、二次纯化的干细胞球呈更大更规则球形生长;经统计分析悬浮培养板培养纯化的胶质瘤干细胞球较培养皿和培养瓶纯化的胶质瘤干细胞球大且数目多(P0.05);对于悬浮培养板,随着纯化次数增加,胶质瘤干细胞球更大、数目更多(P0.05),且呈更规则球形。结论无血清培养基以悬浮细胞培养板为载体纯化胶质瘤干细胞是较理想的方法。     

SD大鼠胚胎神经干细胞分离、培养及鉴定

目的 体外培养并鉴定神经干细胞，为相关实验研究奠定基础。方法 分离SD大鼠胎鼠的间脑，加入神经生长因子EGF和bFGF在神经干细胞条件培养基中克隆培养。用免疫细胞化学方法鉴定分离的神经干细胞。结果 分离培养的细胞具有不断增殖的能力，表达神经巢蛋白（nestin），并能经过诱导分化为神经元和神经胶质细胞。结论 成功建立了神经干细胞的分离培养方法，可用于进一步的实验研究。     

雌性和雄性大鼠脑缺血再灌注神经干细胞增殖的比较研究

目的探讨雌性和雄性成年大鼠脑缺血再灌注海马齿状回颗粒下层(subgranular zone,SGZ)、侧脑室室下层(subventricular zone,SVZ)和梗死皮质周边神经干细胞(neural stem cell,NSC)增殖的差异性.方法雌性和雄性成年大鼠各16只,制作线栓法大脑中动脉闭塞2 h后再灌注模型,用免疫组织化学方法动态检测海马齿状回SGZ、SVZ和梗死皮质周边5-溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)标记的阳性细胞数的变化,并采用HPIAS图像分析系统进行对比分析.结果雄性大鼠SGZ、SVZ及梗死周边区域BrdU阳性细胞在缺血再灌注3 d开始增加,7 d达到高峰,11d后开始下降,18 d进一步减少.而雌性大鼠则是3 d开始增加,7 d明显增加,11d达到高峰,18 d才开始减少,且各时间点雌性大鼠的BrdU阳性细胞数均明显高于雄性大鼠.结论脑缺血再灌注雌雄成年大鼠均有NSC增殖,雌性大鼠NSC增殖较雄性大鼠更为明显.     

神经干细胞分化研究进展

神经干细胞具有比预期广的分化能力。要充分发挥神经干细胞的潜能,必须揭示其向特异性细胞系分化的机制。近来研究证实,细胞因子及内环境信号均影响神经干细胞的分化方向。对神经干细胞分化机制认识的加深,将大大加速神经干细胞的临床应用。     

神经干细胞的来源

神经干细胞是近年来神经科学领域研究的一个热点。神经干细胞可来源于胚胎干细胞和成年干细胞，前者包括早期胚胎细胞和胎儿神经组织细胞，由于从胚胎获取干细胞面l临伦理学的束缚，从成年来源的神经干细胞将是未来临床应用更具可行性的途径。成年来源的神经干细胞包括存在于成年神经组织中的干细胞和从其他组织中分化得到的干细胞，其中骨髓基质细胞具有多分化潜能，在适当的条件下可以诱导分化出神经干细胞，目前备受关注。     

星形胶质细胞源性因子对神经干细胞分化的实验研究

目的探讨星形胶质细胞源性因子对神经干细胞分化的影响。方法分离和培养新生大鼠脑组织的神经干细胞;采用差速贴壁法和振荡法分离纯化星形胶质细胞,用免疫细胞化学染色法,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)标记星形胶质细胞,进行细胞的纯度鉴定;将星形胶质细胞和神经干细胞在互不接触的情况下进行共培养,免疫荧光法观察神经干细胞分化后神经元特异性烯醇化酶(NSE)、GFAP和酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果纯化的星形胶质细胞GFAP抗体标记阳性,细胞纯度达98%;星形胶质细胞与神经干细胞共培养时,神经干细胞贴壁分化加快,NSE阳性细胞及TH阳性细胞明显多于对照组(P<0·05)。结论星形胶质细胞源性因子可快速诱导神经干细胞向神经元细胞、包括多巴胺神经元细胞分化,提示星形胶质细胞支持神经元发生。     

In vitro culture and differentiation of rat embryonic midbrain-derived neural stem cells

BACKGROUND: Midbrain-derived neural stem cells (mNSCs) can differentiate into functional mature dopamincrgic neurons. The mNSCs are considered the ideal choice for cell therapy of Parkinson's disease. OBJECTIVE: To isolate rat embryonic mNSCs and to observe the differentiation characteristics of mNSCs induced by cell growth-promoting factors. DESIGN, TIME AND SETTING: An in vitro cell culture study based on the molecular biology of nerve cells was carried out at the Institute of Clinical Medicine, China-Japan Friendship Hospital (China) from March to November 2007. MATERIALS: Sprague Dawley rats at embryonic day 14 were used in this study. Nestin antibody, β-Ⅲ tubulin antibody, glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody and cyclic nucleotide 3'-phosphohydrolase (CNPase) antibody were provided by Abeam; DMEM/F12 medium and N2 supplement were provided by Invitrogen; epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor-2 (FGF2) were provided by R＆D Systems. METHODS: The ventral mesencephalon was dissected from embryonic day 14 rat embryos. By trypsin digestion and mechanical separation, the brain tissue was triturated into a fine single-cell suspension. The cells were cultured in 5 mL serum-free medium containing DMEM/Fl2, 1% N2 supplement, 20 ng/mL EGF and FGF2. The mNSCs at the third generation were coated with 10 μg/mL polylysine and induced to differentiate in the DMEM/Fl2 supplemented with 1% fetal bovine serum and 1% N2. MAIN OUTCOME MEASURES: The neural spheres of the third passage were identified by nestin immunofluorescence; at the same time, the cells were induced to differentiate, and the types of differentiated cell were identified by immunofluorescence for βⅢ tubulin, GFAP and CNPase. RESULTS: Seven days after primary culture, a great many neurospheres could be obtained by successive pasage. Immunofluorescence assays showed that the neurospheres were nestin positive, and after differentiation, the cells expressed GFAP, CNPase and β -Ⅲ-tubulin. CONCLUSION: Embryonic day 14 rat mNSCs can differentiate into neuron-like cells and glial cells following induction by EGF, FGF2 and N2 additive.