siRNA沉默 TLR4 表达对人肺腺癌A549细胞增殖和侵袭的影响

【摘要】目的:探讨靶向TLR4基因的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)对人肺腺癌细胞A549增殖和侵袭的影响。方法：设计并合成针对TLR4基因的3条siRNA(siRNA₇₂₂、siRNA₁₆₇₃和siRNA₂₅₆₀)及1条与TLR4基因无同源性的阴性对照siRNA,用Real-time PCR方法测定干扰后A549细胞上TLR4 mRNA的表达水平,筛选出有效抑制靶基因表达的siRNA并确定最佳转染时间;采用TLR4特异性siRNA(TLR4-siRNA)转染A549细胞,CCK-8法和Transwell小室法分别检测A549细胞的增殖和侵袭能力。结果：与阴性对照相比siRNA₁₆₇₃在转染48h后对TLR4基因的抑制最为明显,TLR4-siRNA转染后A549细胞增殖活性明显下降,TLR4-siRNA组A549细胞的侵袭细胞数明显少于阴性对照组【(23.60 ± 2.88)个vs(59.80 ± 5.54)个(P<0.01)】。结论：TLR4-siRNA能沉默A549细胞中TLR4基因的表达,抑制A549细胞的增殖和侵袭,TLR4可能成为肺癌基因治疗的候选靶点。     

钠氢交换蛋白1基因在体外对食管癌KYSE-70细胞增殖和侵袭作用的影响

目的:观察钠氢交换蛋白1(Na+/H-exchanger 1,NHE-1)基因对食管癌KYSE-70细胞增殖和侵袭能力的影响.方法:采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测NHE-1 mRNA及其蛋白在人食管癌EC-9706、KYSE-450、EC-1和KYSE-70细胞中的表达情况.将化学合成的靶向NHE-1的小干扰RNA (small interference RNA,si RNA)体外转染入KYSE-70细胞,实时荧光定量-PCR和蛋白质印迹法检测转染24、48和72 h后KYSE-70细胞中NHE-1 mRNA及其蛋白的表达,MTT和Boyden小室法检测KYSE-70细胞的增殖及侵袭能力.结果:NHE-1 mRNA及其蛋白在KYSE-70细胞中高表达.与阴性对照(转染阴性对照siRNA)及空白对照(未转染的KYSE-70细胞)组相比,靶向NHE-1的siRNA可抑制KYSE-70细胞中NHE-1 mRNA及其蛋白的表达,差异具有统计学意义(P＜0.05);与阴性对照组、空白对照组及NHE-1 siRNA转染24 h组比较,NHE-1 siRNA转染48和72 h后的KYSE-70细胞体外增殖能力和侵袭能力明显受到抑制,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:干扰NHE-1基因的表达可以抑制食管癌KYSE-70细胞的体外增殖和侵袭能力,NHE-1基因有望成为食管癌基因治疗的重要靶点.     

非小细胞肺癌患者血清MMP-9表达及siRNA靶向抑制A549细胞侵袭与转移的研究

目的:探讨非小细胞肺癌患者血清中MMP-9表达与肿瘤转移的关系;MMP-9siRNA对肺腺癌细胞系A549中MMP-9表达及细胞侵袭与转移抑制作用的影响。方法:ELISA法检测32例非小细胞肺癌(NSCLC)患者及20名健康者空腹血清MMP-9浓度,同时设计合成针对MMP-9的特异性siRNA,采用oligofectamine转染A549细胞,RT-PCR法检测转染细胞后MMP-9mRNA的表达,Transwell实验检测细胞侵袭情况。结果:NSCLC患者血清中MMP-9浓度〔(63.44±7.84)ng/mL〕比正常对照组〔(21.57±3.29)ng/mL〕明显升高(P<0.01),且浓度随病理分期增加而增强〔Ⅰ/Ⅱ:(45.40±5.30)ng/mL,Ⅲ/Ⅳ:(89.80±5.02)ng/mL,P<0.01〕,发生淋巴结转移的患者血清MMP-9浓度〔(82.26±5.09)ng/mL〕明显高于未发生淋巴结转移〔(35.92±4.68)ng/mL〕的患者P<0.01;RT-PCR法显示,转染MMP-9siRNA后,细胞中MMP-9mRNA表达较阴性对照组和空白组明显降低,P<0.05。RNA干扰MMP-9基因后A549细胞的侵袭能力也有明显下降,P<0.01。结论:MMP-9可作为NSCLC患者有无发生浸润转移的良好预测指标,靶向MMP-9的siRNA不仅能特异性的降低MMP-9mRNA及蛋白的表达,且能抑制人A549细胞的侵袭和迁移。     

靶向沉默人类真核翻译延长因子1A2可抑制胰腺癌细胞BxPC-3体外迁移和侵袭

目的:探讨靶向沉默人类真核翻译延长因子1A2 (homo sapiens eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2,EEF1A2)对胰腺癌BxPC-3细胞体外迁移和侵袭的影响及其可能的分子机制.方法:应用RT-PCR和蛋白质印迹法检测4种胰腺癌细胞株中EEF1A2的mRNA和蛋白表达水平.将EEF1A2-小干扰RNA (smallinterference RNA,siRNA)和阴性对照siRNA转染到BxPC-3细胞中,随后采用RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测EEF1A2的mRNA及蛋白表达,应用体外划痕和Transwell侵袭实验分别检测BxPC-3细胞的体外迁移和侵袭能力,蛋白质印迹法检测转染前后细胞中p -Akt和总Akt蛋白的表达变化.结果:4种胰腺癌细胞株中除SW1990细胞呈EEF1A2低表达外,BxPC-3、Patu8988和Panc-1细胞均呈EEF1A2高表达.EEF1A2-siRNA转染BxPC-3细胞48 h后,EEF1A2 mRNA及蛋白表达水平较阴性对照siRNA转染的细胞和空白对照细胞明显降低(P＜0.01).EEF1A2-siRNA转染组BxPC-3细胞的体外迁移和侵袭能力明显低于阴性转染对照组和空白对照组(P＜0.05).EEF1A2-siRNA转染组细胞中Akt的磷酸化水平明显低于对照组细胞(P＜0.05),而总Akt蛋白表达水平未显著改变(P＞0.05).结论:siRNA干扰下调EEF1A2基因表达可明显抑制胰腺癌BxPC-3细胞的体外迁移和侵袭,其机制可能与EEF1A2调控Akt信号通路有关.     

靶向LASS2基因的小干扰RNA对人肝癌细胞侵袭能力的影响

目的:研究靶向人源性长寿保障基因2(homosapiens longevity assurance homologue 2,LASS 2)的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对人肝癌细胞MHCC97-L体外侵袭能力的影响.方法:通过脂质体转染将靶向LASS2的siRNA转染MHCC97-L细胞,运用实时荧光定量PCR(real-time fluorogentic quantitative PCR,RFQ-PCR)检测转染后LASS2 mRNA的表达,筛选有效的siRNA片段;运用 BCECF氢离子敏感荧光探针检测MHCC97-L细胞跨膜运输氢离子的功能;采用Western印迹法分析MHCC97-L细胞及上清液中基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)的表达情况;应用明胶酶谱法检测MHCC97-L细胞上清液中MMP-2的活性; Transwell法检测细胞体外侵袭能力.结果:筛选得到靶向LASS2的有效siRNA-1片段.MHCC97-L细胞转染LASS2 siRNA-1后,其跨膜运输氢离子的能力增强,与空白对照组比差异有统计学意义(P<0.05);MMP-2蛋白的表达及分泌无明显变化,但分泌的MMP-2活性形式增加,与空白对照组和无关序列组比明显提高,差异有统计学意义(P<0.05);且细胞的体外侵袭能力明显高于无关序列组和空白对照组(P<0.05).结论:靶向LASS2的siRNA能有效下调其表达,并能提高MHCC97-L细胞在转染LASS2 siRNA后的体外侵袭能力.     

凋亡抑制因子（ARC）对肺癌细胞侵袭能力及对Akt蛋白磷酸化的影响

目的:探讨含有Caspase富集功能域的凋亡抑制因子（ARC）对肺癌细胞侵袭能力及对细胞中蛋白激酶B（Akt）蛋白磷酸化的影响。方法:人正常肺细胞MRC-5和肺癌细胞A549、SPC-A1、H322经细胞蛋白提取后,Western blot检测细胞中ARC表达水平。把ARC小干扰RNA组（ARC siRNA组）、siRNA对照组（siRNA-NC组）转染至人肺癌细胞中,同时设置未转染组（只加入转染试剂）,培养48 h后,Western blot检测细胞中ARC、Akt、磷酸化的蛋白激酶B（p-Akt）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）表达水平,Transwell小室检测细胞侵袭能力。结果:人肺癌细胞A549、SPC-A1、H322中ARC表达水平明显高于正常人肺细胞MRC-5（P＜0.01）。肺癌细胞A549中ARC表达水平最高,后续选用A549细胞继续研究。ARC siRNA组细胞侵袭能力及细胞中ARC、p-Akt、MMP-2表达水平均明显低于未转染组（P＜0.01）。siRNA-NC组细胞侵袭能力及细胞中ARC、p-Akt、MMP-2表达水平与未转染组相比差异没有统计学意义（P＞0.05）。结论: ARC在肺癌细胞中表达上调,干扰ARC后肺癌细胞的侵袭受到抑制,细胞中Akt磷酸化水平降低。     

小干扰RNA沉默基质金属蛋白酶-2基因对卵巢癌细胞恶性行为的影响

 目的　探讨靶向基质全属蛋白酶-2（MMP-2）基因的RNA干扰（RNAi）技术对卵巢癌OVCAR-3细胞MMP-2的沉默作用,以及沉默MMP-2基因对OVCAR-3细胞生长、黏附、侵袭和迁移能力的影响。方法　合成特异性靶向MMP-2基因的小干扰RNA（siRNA）并转染卵巢癌OVCAR-3细胞,以非特异性序列转染细胞作为阴性对照组,以培养液代替siRNA转染细胞作为空白对照组,采用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测转染后24 、48 和72 h MMP-2 mRNA和蛋白的表达水平,通过四甲基偶氮唑蓝（MTT）法绘制细胞生长曲线,利用Transwell、划痕实验检测细胞侵袭和迁移能力。结果　与阴性对照组相比,OVCAR-3细胞在转染siRNA-MMP-2后24 、48 和72 h MMP-2 mRNA表达量分别下降了73.8 %、78.8 %和78.4 %（均P＜0.05）,蛋白表达量分别下降了72.6 %、81.2 %和76.4 %（均P＜0.05）,以48 h作用最强;细胞生长曲线显示细胞生长无明显变化（P＞0.05）;60 min和90 min时的黏附抑制率分别为55.0 %和44.8 %（均P＜0.05）;细胞的侵袭和迁移能力分别下降29.7 %和35.8 %（均P＜0.05）。结论　siRNA介导的MMP-2基因沉默能明显抑制OVCAR-3细胞的黏附、侵袭和迁移能力,而对其生长无明显影响,MMP-2基因有可能成为卵巢癌基因治疗的重要靶点。     

HLA-E基因表达沉默对人乳腺癌细胞生物学行为的影响

目的：探讨HLA-E基因表达对人乳腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移等生物学行为的影响,分析靶向HLA-E基因的小分子RNA干扰(siRNA)技术应用于乳腺癌治疗的可行性。方法：设计并合成靶向HLA-E基因的特异性siRNA序列,转染至人乳腺癌细胞MDA-MB-231,同时设立空白对照组、阴性对照组及脂质体组。实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blot法分别检测各组乳腺癌细胞HLA-E mRNA及蛋白的表达;CCK-8法和流式细胞术检测各组乳腺癌细胞增殖率和凋亡率;Transwell实验检测各组乳腺癌细胞侵袭和迁移能力。结果：乳腺癌细胞转染HLA-E siRNA后,HLA-E mRNA及蛋白表达水平明显降低。与阴性对照组相比,HLA-E siRNA转染组乳腺癌细胞增殖率降低(P<0.01);凋亡率增加(P<0.01);侵袭迁移能力降低(P<0.01)。结论：靶向人乳腺癌细胞HLA-E基因的siRNA能有效抑制其基因表达,进而抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,降低乳腺癌细胞侵袭和迁移能力。     

敲低膜联蛋白A5对人胃癌细胞系MKN-45增殖的作用

目的 探讨膜联蛋白A5低表达对人胃癌MKN-45细胞增殖和凋亡的影响。方法 将胃癌MKN-45细胞分为siRNA干扰组、阴性对照组和空白对照组。采用RNA干扰技术将靶向膜联蛋白A5的siRNA和阴性对照siRNA脂质体转染法转染细胞,转染48 h后采用qRT-PCR和Western blot法分别在mRNA水平和蛋白水平进行抑制效率的鉴定,空白对照组不予任何处理。应用MTT、平板克隆形成法检测膜联蛋白A5低表达对胃癌MKN-45细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡情况。Western blot法检测增殖核抗原PCNA和周期相关蛋白Cyclin D1的表达。结果 靶向膜联蛋白A5的siRNA转染后,胃癌MKN-45细胞中膜联蛋白A5的表达较阴性对照和空白对照组明显降低（P<0.05）。MTT和克隆形成实验可见siRNA干扰组细胞增殖活力和集落形成能力较阴性对照和空白对照组显著增高（P<0.05）;流式细胞术显示细胞凋亡率无明显改变;PCNA和Cyclin D1的表达显著上调。结论 膜联蛋白A5低表达能促进胃癌细胞的增殖。     

沉默锌指蛋白217基因对食管鳞癌EC9706细胞增殖和侵袭能力的影响

目的 探讨锌指蛋白217基因(ZNF217)在食管鳞癌侵袭转移中的作用.方法 合成ZENF217基因的siRNA序列并转染对数生长期食管鳞癌EC9706细胞.设置转染无义序列siRNA和未转染EC9706细胞为阴性对照和空白对照.半定量RT-PCR和Western blot方法分别检测转染48 h后3组细胞ZNF217 mRNA和蛋白的表达变化;侵袭小室检测3组细胞穿膜细胞数变化;MTT法分析3组细胞增殖能力的变化.结果 与空白对照组和阴性对照组比较,转染ZNF217 siRNA组EC9706细胞ZNF217 mRNA和蛋白表达均显著下降,差异有统计学意义(P＜0.05);转染ZNF217 siRNA组EC9706细胞穿膜细胞数显著下降,差异有统计学意义(P ＜0.05);ZNF217 siRNA能明显抑制EC9706细胞体外增殖能力(P＜0.05).结论 ZNF217基因表达下降能显著抑制EC9706细胞体外侵袭力和增殖能力,ZNF217基因有望成为食管癌基因治疗的有效靶点.     

仙人掌原液毒性的初步研究

背景与目的： 研究仙人掌原液的毒性。 材料与方法： 小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。 结果： 仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g/kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论： 在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

食管平滑肌瘤10例临床治疗体会

我院１９７５年６月～１９９０年７月共收治食管平滑肌瘤１０例，占同期食管肿瘤总数的０．１９２％（１０／１０９２）。位于食管上段２例，中段５例，下段３例。Ｘ线食管钡餐造影是诊断本病的主要方法。行食管粘膜外肿瘤摘除９例，食管部分切除１例，效果良好。本文就其诊断与手术治疗进行了讨论。     

Assessment of the degree of carcinogenicity of small doses of nitrites

Chronic experiments on CBA and C57B1 mice and acute experiments on CBA mice established: (a) carcinogenic effect of sodium nitrite given continuously with drinking water (0.1; 1.0 and 10.0 maximum allowable concentration) in combination with morpholine fed with bread, and (b) endogenous synthesis of nitrosomorpholine as a result of simultaneous intragastric administration of same doses of sodium nitrite and morpholine. Also, nitrosomorpholine and N-nitrosodimethylamine synthesis was observed in vitro following addition of low-dose sodium nitrite, morpholine and amidopyrine to human gastric juice. Carcinogenic hazard associated with low-dose nitrite consumption in humans is discussed.     

仙人掌原毒性的初步研究

背景与目的:研究仙人掌原液的毒性。材料与方法:小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。结果:仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g／kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论:在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

中晚期贲门癌148例的外科治疗

目的　总结贲门癌手术治疗影响生存率的因素 ,提供今后工作参考。方法　对 14 8例经手术治疗的贲门癌患者进行术后并发症、绝对生存率的X2 检验。结果　本组切除率为 94.5 9% ,近半胃切除占 72 .14 % ,1、3、5年生存率分别为 67.9%、45 %和 2 4.3 %。病期、外侵程度和淋巴结转移等因素对 5年生存率有显著影响 (P <0 .0 1)。术后并发症以吻合口瘘及肺癌并发症为多见 ,其发生率为 3 .6% ,手术死亡率 1.4%。结论　提高生存率的关键在于早期诊断 ,根治手术和术后积极综合治疗。     

胆囊癌29例分析

目的探索胆囊癌的防治方法。方法分析29例胆囊癌病人临床资料、治疗方法及结果。结果术前诊断明确者21例，剖腹探查发现已属晚期，9例为Ⅳ期行根治术，12例为Ⅴ期未行根治术，均于术后1年内死亡。术前怀疑胆囊癌者5例，剖腹探查冰冻切片证实为Ⅴ期及Ⅳ期者各1例，Ⅴ期未行根治术，Ⅳ期行根治术，均于术后1年内死亡；Ⅲ期者3例，行胆囊癌根治术分别于术后10月、13月、17月死亡。2例术中冰冻切片发现的Ⅱ期胆囊癌，行胆囊癌根治术，分别于术后23月、26月死亡。1例意外胆囊癌属Ⅰ期胆囊癌，术后5年半死亡。结论要减少胆囊癌危害，重在及时治疗胆囊结石。