牙龈卟啉单胞菌精氨酸特异性牙龈素基因疫苗预防比格犬种植体周围炎的实验研究

目的 构建牙龈卟啉单胞菌精氨酸特异性牙龈素基因疫苗pVAX1-rgpA,并对成年犬进行免疫接种,观察该疫苗在防治种植体周围炎发生发展中的作用。方法 构建真核表达质粒pVAX1-rgpA。拔除15只成年犬下颌双侧第二、三前磨牙,随机即刻植入种植体。3个月后,实验犬随机均分成A、B、C组,分别接种重组质粒pVAX1-rgpA、热失活牙龈卟啉单胞菌、空白质粒pVAX1,连续接种3次。接种开始前、接种结束2周后采用酶联免疫吸附试验检测血清IgG和唾液分泌型IgA（sIgA）含量。随机选取一侧采用丝线结扎法构建种植体周围炎,并检测种植体周探诊深度（PD）和探诊出血指数（BOP）。结扎6周后处死所有动物,制作50 μm厚的硬组织切片,亚甲基蓝染色后观察种植体周骨丧失程度。结果 A、B组动物免疫后,IgG、sIgA抗体较未免疫前明显增高（P<0.05）,同时较C组升高（P<0.05）,但A、B组间差异无统计学意义（P>0.05）。丝线结扎第4和6周时,C组结扎侧的PD明显高于A、B组（P<0.05）,A、B组间差异无明显统计学意义（P>0.05）。A组结扎侧骨丧失量明显小于其他两组（P<0.05）。硬组织切片可见,各组种植体周骨丧失区均有大量的炎症细胞和细菌存在,C组结扎侧最严重。结论 精氨酸特异性牙龈素（rgpA）基因疫苗产生的IgG和sIgA,能有效减弱犬种植体周围炎的骨丧失量。     

正畸患者牙龈卟啉单胞菌基因检测

目的 对正畸患者口腔中牙龈卟啉单胞菌等牙周致病菌进行检测。方法 选择１６例固定正畸患者发生牙周炎症的牙周袋和牙周健康的龄袋为取菌斑样本占。分成牙周炎症组和对照组。根据改良聚合酶链反应检测技术,直接检测临床标本中牙龈卟啉单力的ＦｉｍＡ基因,并做此检测技术的敏感性和特异性实验。结果 牙周炎组牙龈卟啉单胞菌的检测阳性率（５６．３５）显著大于对照组（１８．８％）,Ｐ〈０．０５。检测技术的敏感性和特异性较高     

牙龈卟啉单胞菌基因真核表达载体构建及其在哺乳动物细胞中的表达

目的　构建分泌型牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶K基因的真核表达载体VR1020/KGPcd,并检测其在哺乳动物细胞中的表达及分泌情况。方法　应用基因重组方法,构建真核表达载体VR1020/KGPcd。然后用Lipofectamine 2000介导瞬时转染COS7细胞,以反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和间接免疫荧光检测重组质粒的基因转录和蛋白表达,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测培养上清中蛋白分泌情况。结果　转染的COS7细胞中可检测到目的基因的转录和表达,并且在培养的上清中检测到其表达的蛋白质。结论　成功构建了可分泌表达的真核表达载体 VR1020/KGPcd,并在哺乳动物细胞中能够正确转录和翻译,培养上清中可检测到正确表达的目的蛋白,这为其作为基因疫苗免疫动物奠定了基础。     

牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶的研究进展

牙周炎是一种牙齿支持组织的慢性炎症性疾病,能引起结缔组织和牙槽骨的破坏而导致渐进性附着丧失,最终可能导致牙齿脱落.革兰氏阴性厌氧菌牙龈卟啉单胞菌是慢性牙周炎的重要致病菌,具有包括脂多糖、菌毛、血细胞凝集素和胞外蛋白酶在内的多种毒力因子,其中牙龈蛋白酶提供的蛋白水解活性占该生物体产生的一般蛋白水解活性的大部分(85％),...     

牙龈卟啉单胞菌研究进展

牙周炎是常见的口腔疾病之一,是中国成年人失牙的主要原因.牙龈卟啉单胞菌在引发牙周组织破坏过程中发挥着重要的作用,成为国内外学者研究的热点之一.本文就牙龈卟啉单胞菌与口腔疾病和其他全身性疾病的关系、牙龈卟啉单胞菌全基因组,牙龈卟啉单胞菌与牙龈上皮细胞的相互作用等研究作一综述,以拓宽牙龈卟啉单胞菌的研究思路,进血为牙周炎的...     

牙龈素促进牙龈卟啉单胞菌免疫逃逸的机制

有关牙周炎病因的关键致病菌假说近年来引起学者们的关注,该假说认为牙龈卟啉单胞菌在牙周炎的发病过程中发挥着重要作用,是牙周炎的关键致病菌.牙龈素是牙龈卟啉单胞菌产生的重要致病因子之一,它可以协助牙龈卟啉单胞菌逃逸巨噬细胞、中性粒细胞及补体系统的杀伤作用.本文就牙龈素促进牙龈卟啉单胞菌免疫逃逸的机制相关研究进展作一综述,对这一机制的深入了解有助于进一步理解牙龈素的致病机制,同时也可以为牙周炎的防治探索新的途径.     

牙龈卟啉单胞菌prtH基因克隆及其多态性的研究

目的：建立牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.g)prtH全基因序列的克隆株，分析5株不同P.g菌株中prtH基因多态性。方法：利用PCR技术获得prtH全基因序列，克隆至载体pGEM-T;设计3对引物，用PCR的方法扩增prtH基因的不同区域；以生物素标记prtH基因序列为特异性探针，用斑点杂交和Southern印迹杂交进一步分析prtH基因的多态性。结果：酶切分析和DNA测序证实重组质粒pGEM-T-prtH的插入片段为prtH基因序列；核酸分子杂交显示菌株W 381和ATCC 33277杂交类型一致，菌株ATCC 49417和菌株14－3－2呈现各自不同的杂交条带，而菌株47A－1中未检测到prtH基因。结论：不同P.g菌株中prtH基因序列存在差别，这种基因多态性提示不同P.g菌株毒力大小可能存在差异。所建立的PCR扩增技术可以敏感地检测prtH基因的存在。     

牙龈卟啉单胞菌与动脉粥样硬化

大量流行病学证据已经证实牙周病和动脉粥样硬化存在一定的相关性,目前的研究主要偏向于牙周病在动脉粥样硬化病因中的作用机制,牙周病的病原体如牙龈卟啉单胞菌是否为动脉粥样硬化的病原体尚不清楚.本文对牙龈卟啉单胞菌在动脉粥样硬化发生、发展过程中所起的作用作一综述.     

牙龈卟啉单胞菌与冠心病

牙周病是引起冠心病的危险因素之一,牙龈卟啉单胞菌是引起牙周病的主要致病菌,它可以侵入血管内膜导致血管壁增厚及释放内毒素,释放细胞因子促进血小板的聚集,血栓形成,从而导致心血管疾病的发生。     

牙龈卟啉单胞菌prtH基因水解活性区域的表达

目的 克隆、表达牙龈卟啉单胞菌（P．gingivalis）prtH蛋白水解酶活性结构域（prtHN），制备多克隆抗体，检测其特异性。方法 采用Generunner软件分析prtH蛋白水解酶活性结构域prtHN片断，PCR扩增prtHN片段并进行DNA序列测定；构建原核表达质粒pQE30-prtHN。E．coliJM109表达prtHN重组蛋白．镍亲和柱纯化，SDS—PAGE分析鉴定；以兔抗P．g菌体抗体和抗膜泡抗体进行Western blot分析重组蛋白免疫原性。制备兔抗prtHN多克隆抗体，不同菌种牙周致病菌Western blot检测抗体特异性。结果 克隆重组基因测序结果与GenBank中P．gingivalis RgpA蛋白酶的基因序列U15282一致。SDS—PAGE显示，IPTG诱导的E．eoliJM109（pQF30-prtHN）以包涵体形式表达14KDa的重组蛋白。Western blot检测证实其具有免疫原性。所制备的兔抗prtHN多克隆抗体具有特异性。结论 成功克隆，原核表达的prtHN蛋白具有免疫原性。prtHN蛋白的多克隆抗体具有菌种反应特异性。     

原发性根尖周感染中牙龈卟啉单胞菌kgp基因多态性

目的　通过牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,Pg）kgp基因型在原发性根尖周感染患牙根管中的分布情况,了解kgp基因在原发性根尖周感染中的基因多态性,并分析不同基因型与临床症状的相关性。方法　临床收集190例原发性根尖周感染患者,采集感染根管细菌学样本,抽提DNA,使用Pg的16S rRNA基因的特异引物PCR检测样本中是否有Pg,然后针对Pg检出阳性样本,再使用kgp特异引物PCR获得kgp催化域片段,通过Tru I酶切kgp催化域片段确定kgp的基因型,并使用Pearson χ2方法分析所得到的实验数据。结果　在本研究所采集的190例原发性根尖周感染样本中,共检出Pg55例,其中kgpⅠ型检出率为27.3%, kgp Ⅱ型检出率为38.2%。Pg的检出与临床症状有相关性;kgpⅠ型与疼痛具有相关性。结论　原发性根尖周感染的根管中Pgkgp基因存在基因多态性。因为有些样本中Pg的量较少,本研究中kgp特异引物PCR的方法难以检测到kgp基因,所以今后需发展更灵敏的检测手段以对感染根管中kgp基因做进一步的研究。     

青春期龈炎龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌kgp基因型的研究

目的 研究青春期龈炎龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）的特异kgp基因型，评估其与疾病严重程度之间的关系。方法检查并记录青春期龈炎组与牙龈健康组各36例的牙周临床指数，收集龈下菌斑样本，提取染色体DNA，采用聚合酶链反应（PCR）方法扩增编码牙龈蛋白酶K（KGP）催化域的序列片段。PCR产物用限制性内切酶Mse I消化。结果 P.gingivalis有毒株W83表现为kgp-A型，而无毒株ATCC33277表现为kgp-B型。所有P.gingivalis阳性个体的龈下菌斑中只检测到一种kgp基因型。kgp-A型在青春期龈炎组P．gingivalis阳性个体中的检出率为79．0％，在牙龈健康组为22．2％，两组kgp基因型的检出率差异有统计学意义（P=0．028）；青春期龈炎组有P.gingivalis定植的个体中，牙周临床指数与kgp的基因型无相关关系（P〉0．05）。结论青春期龈炎个体定植的Pgingivalis的kgp基因型多与有毒株P.gingivalis W83的表现相同，有必要监测kgp-A型阳性的个体，因其个体发展为牙周疾病的危险度可能会增高。     

Sequence analysis of kgp in Porphyromonas gingivalis isolates from periodontitis patients

The aim of the present study was to determine sequence variation in the Lys-x-specific protease (Kgp) encoding gene kgp of Porphyromonas gingivalis and to analyze its association with periodontal disease severity. Pooled subgingival plaque samples were obtained from the six most severely affected sites of 102 patients with periodontitis. Sequence analysis of the kgp gene in 23 clinical P. gingivalis isolates resulted in the identification of two distinct kgp types (kgp-I and kgp-II) according to sequence differences in the region encoding the catalytic domain. Restriction analysis revealed that 59 of the 102 patients were colonized by kgp-I and 43 by kgp-II. Patients harboring kgp-I or kgp-II showed no significant difference in the severity of periodontal disease as assessed by pocket probing depth and bleeding on probing following adjustment for smoking habit and age. Moreover, no differences in proteolytic activity of Kgp-I and Kgp-II were detected. The results indicated that two kgp types are maintained in natural populations of P. gingivalis.     

靶向牙周炎DNA疫苗免疫原性及免疫效能的实验研究

目的：检测树突状细胞靶向牙周炎DNA疫苗pCTLA4-FimA的免疫反应性,并评价其免疫保护能力。方法：BALB/c小鼠随机分为3组：pCTLA4-FimA鼻黏膜免疫组,非靶向牙周炎DNA疫苗pFimA鼻黏膜免疫组,pCI载体鼻黏膜免疫组。酶联免疫吸附实验检测血清及唾液中特异性抗FimA抗体水平。小鼠鼻黏膜途径免疫pCTLA4-Fi-mA、pFImA或pCI质粒,口腔接种Porphyromonas gingivalis,建立小鼠牙周炎模型,检测牙槽骨水平吸收程度。结果：与pFimA免疫组相比,pCTLA4-FimA免疫组诱导了显著增强的血清特异性IgG抗体和唾液特异性IgA抗体水平（P〈0.01）。与免疫前相比,三组小鼠牙槽骨均有吸收,其中pCTLA4-FimA免疫组牙槽骨水平吸收程度最低。结论：靶向牙周炎DNA疫苗pCTLA4-FimA能有效诱导机体产生特异性抗体免疫反应,并抑制牙周炎的发展,效果优于非靶向牙周炎DNA疫苗pFimA。     

Monoclonal antibody against Porphyromonas gingivalis hemagglutinin inhibits hemolytic activity

Porphyromonas gingivalis has been implicated as an important pathogen in the development of adult periodontitis. This bacterium possesses hemagglutinating and hemolytic activities to attach and lyse erythrocytes. Hemolysis by this oral pathogen functions to provide heme-containing molecules for growth in the periodontal pocket. We previously constructed a monoclonal antibody using P. gingivalis vesicles as the immunogen, designated as MAb-Pg-vc, which inhibited vesicle-associated hemagglutinating activity. Furthermore, we cloned the gene encoding 130-kDa hemagglutinin (130-kDa HAG) and identified its functional motif for attachment to erythrocytes. Generally, bacterial cell attachment to erythrocytes is an important initial step for expressing hemolysis activity. In the present study, we examined the effect of MAb-Pg-vc on the hemolytic activity of P. gingivalis cells. The MAb-Pg-vc significantly inhibited the hemolytic activity and, further, this inhibitory activity was reduced by the synthetic peptide of the 130-kDa HAG functional motif.     

Transcutaneous immunization with an outer membrane protein of Porphyromonas gingivalis without adjuvant elicits marked antibody responses

BACKGROUND/AIMS: We have previously reported that specific immunoglobulin G (IgG) antibodies induced by transcutaneous immunization (TCI) with a 40-kDa outer membrane protein (40k-OMP) of Porphyromonas gingivalis, with cholera toxin (CT) as adjuvant, inhibited coaggregation by P. gingivalis. In this study, we further pursue the potential of the 40k-OMP as a transcutaneous vaccine. METHODS/RESULTS: TCI of rats administered 40k-OMP elicited significant 40k-OMP-specific serum IgG and IgA, as well as salivary IgG antibody titers. Importantly, these antibody responses were induced without adjuvant. Thus, both serum and saliva antibody titers induced by TCI with the 40k-OMP alone were identical to those of 40k-OMP plus cholera toxin as adjuvant. The serum antibody responses induced by 40k-OMP persisted for more than 140 days. On the other hand, salivary IgG anti-40k-OMP antibodies were gradually decreased. Analysis of antibody-forming cells (AFCs) confirmed the antibody titers by detecting high numbers of 40k-OMP-specific IgG AFCs in spleen and cervical lymph node. CONCLUSION: Since 40k-OMP-specific IgG inhibited the coaggregation of P. gingivalis with Streptococcus gordonii, and the hemagglutinin activity of P. gingivalis, TCI with the 40k-OMP may be important as an adjuvant-free immunogen for the prevention of chronic periodontitis.     

牙龈卟啉单胞菌血凝素2基因缺陷型突变株的构建

目的 构建牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)血凝素2(hemagglutinin-adhesin 2,HA-2)基因缺陷型突变株,为研究HA-2基因功能奠定基础.方法 PCR扩增PgHA-2基因两翼片段HA_u、HA_1,将抗性基因ermF-ermAM连接到两者之间构建打靶载体HA-ermF-ermAM.将HA-ermF-ermAM电转化PgATCC33277,基因同源重组整合进入PgATCC33277染色体,用选择性培养基筛选获得PgATCC33277HA-2基因缺陷型突变株.进行PgATCC33277HA-2基因缺陷型突变株与其野生株凝血功能试验,比较二者的凝血功能差异.结果 PCR、酶切和测序鉴定结果表明,打靶载体HA-ermF-ermAM成功构建.经PCR鉴定,打靶载体HA-ermF-ermAM通过同源重组整合进入PgATCC33277染色体,成功获得PgATCC33277HA-2基因缺陷型突变株.凝血实验结果表明,PsATCC33277HA-2基因缺陷型突变株与野生株相比凝血能力明显减弱.结论 成功获得PgATCC33277HA-2基因缺陷型突变株,为进一步研究HA-2的生物学性质奠定了基础.