知母皂苷元通过上调PI3K/Akt信号通路减轻淀粉样β蛋白诱导的乳大鼠海马神经元突触损伤

目的 探讨知母皂苷元(Sar)减轻淀粉样β蛋白(Aβ)诱导的海马神经元突触损伤的信号转导机制。方法 取出生0~24 h SD乳大鼠海马神经元,体外培养7 d。海马神经元分别加入磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)特异性阻断剂LY294002 30 μmol·L^-1或蛋白激酶B(Akt)特异性阻断剂曲西立滨1 μmol·L^-1 1 h后,加Sar 30和100 μmol·L^-1作用1 h,再加Aβ_1-42 50 nmol·L^-1作用24 h。应用突触囊泡蛋白(SYP)免疫荧光染色观察突触的改变。Western蛋白质印迹法检测海马神经元SYP、磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化糖原合成酶3β(p-GSK3β)表达水平的改变。结果 与正常对照组相比,Aβ_1-42组培养的海马神经元SYP, p-Akt和p-GSK3β表达水平明显减低(P<0.01)。与Aβ_1-42组相比,Aβ_1-42+Sar 30和100 μmol·L^-1组海马神经元SYP, p-Akt和p-GSK3β表达水平明显增加(P<0.01)。给予LY294002作用后,SYP和p-Akt表达水平明显降低(P<0.05)。给予曲西立滨作用后,SYP和p-GSK3β表达水平明显降低(P<0.05)。单独给予LY294002,海马神经元SYP表达无变化,p-Akt表达水平明显降低(P<0.01)。单独给予曲西立滨,海马神经元SYP和p-GSK3β蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论 Sar通过上调PI3K/Akt/GSK3β信号通路对抗Aβ_1-42诱导的海马神经元突触损伤。     

知母皂苷元对高糖引起的体外培养大鼠海马神经元损伤的保护作用

目的探讨知母皂苷元(sarsasapogenin,Sar)对高糖引起的海马神经元损伤是否有保护作用。方法选用出生0～24 h Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠,取海马,进行海马神经元体外培养,培养7 d用于实验。实验分为正常对照组、高糖组、高糖+Sar(10、30、100μmol.L-1)组;对照组:加入等量含0.1%DMSO培养基;高糖处理组:分别加入葡萄糖(30、50、100 mmol.L-1)作用48 h;高糖+Sar(10、30、100μmol.L-1)组:先加入不同浓度Sar(10、30、100μmol.L-1)作用1 h,然后加入葡萄糖(50 mmol.L-1)作用48 h;应用MTT方法观察细胞活力,免疫荧光和Western免疫印迹方法观察神经元突触素表达的改变。应用Hoechst 33258核染色检测神经元凋亡。应用Western免疫印迹方法观察caspase-3和多聚ADP核糖聚合酶(PARP)蛋白表达改变。结果加入葡萄糖(30、50、100 mmol.L-1)作用48 h可使培养神经元细胞活力明显降低,神经元突触素蛋白表达明显降低。另外高糖也可引起神经元凋亡细胞百分比和活性caspase-3、PARP蛋白表达水平也较对照组明显提高。在加入高糖前加入不同浓度Sar(10、30、100μmol.L-1)可明显对抗高糖引起的这些变化。培养海马神经元突触素蛋白表达较高糖组(50 mmol.L-1)明显增加,神经元凋亡细胞百分比和活性caspase-3、PARP蛋白表达水平也较高糖组明显降低。结论 Sar对高糖引起的海马神经元损伤具有明显的保护作用。     

糖皮质激素促进β-淀粉样蛋白对海马神经元损伤的研究

目的在体外实验条件下,观察糖皮质激素是否促进β-淀粉样蛋白的神经元毒性作用。方法通过LDH释放率法检测细胞活力、TUNEL法测细胞凋亡以及LSCM测胞内Ca2 浓度的变化。结果单独的地塞米松(10-8,10-7,10-6mol.L-1)组或Aβ25-35(0.5μmol.L-1)组分别作用海马神经元后,细胞活力变化不明显(P>0.05);但与同剂量的DEX、Aβ25-35组相比,DEX Aβ25-35组的细胞活力明显降低(P<0.05),同时胞内Ca2 显著上升(P<0.05),神经元的凋亡率增加明显,细胞内出现凋亡的典型形态学特征。结论糖皮质激素可能通过促进Aβ引起海马神经元胞内Ca2 升高增加神经元毒性作用。     

知母皂苷对淀粉样β蛋白片段25~35引起的神经细胞凋亡的保护作用(英文)

目的研究知母皂苷(SAaB)对淀粉样β蛋白片段25~35(Aβ25~35)激活巨噬细胞引起神经细胞凋亡的保护作用及有关的机制。方法体外培养小鼠腹腔巨噬细胞24 h,加入Aβ25~35(20μmol.L-1),分别在加入Aβ25~350.5,1,2和6 h取巨噬细胞,应用Western印迹方法检测不同时间点的胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和丝裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)的蛋白表达改变,确定ERK1/2和p38 MAPK蛋白表达达峰时间。然后,在加入Aβ25~35前10 min,加入SAaB(10,30和100μmol.L-1)或在加入Aβ25~35前30 min,分别加入p38MAPK的特异性阻断剂SB203580和ERK上游激酶MEK的特异性阻断剂PD98059,分别在Aβ25~35作用0.5和2 h后,取细胞进行Western印迹实验。Aβ25~35作用48 h后,取培养的巨噬细胞上清液测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及一氧化氮(NO)生成量的改变,应用免疫细胞化学染色观察巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达。为了观察SAaB对Aβ25~35激活巨噬细胞所介导的神经细胞凋亡的保护作用,在巨噬细胞培养液内加入SAaB(10,30和100μmol.L-1)作用10 min,然后加入Aβ25~35(20μmo.lL-1)作用48 h后,将培养的上清液转移到体外培养8 d的小脑颗粒细胞内作用72 h,对照组将未被Aβ25~35刺激的巨噬细胞上清液加入到神经细胞内。应用Hoechst 33258染色观察小脑颗粒细胞凋亡改变。结果Aβ25~35(20μmol.L-1)可使巨噬细胞磷酸化ERK1/2和磷酸化p38 MAPK表达明显增加,分别在加入Aβ25~35后0.5 h和2 h作用达高峰。另外,Aβ25~35也可使巨噬细胞的TNF-α和NO产生增加以及iNOS表达增加,Aβ25~35引起的巨噬细胞TNF-α产生增加是通过ERK1/2信号通路激活介导的,因为MEK的特异性阻断剂PD98059可明显抑制Aβ25~35引起的巨噬细胞TNF-α产生增加。将Aβ25~35刺激48 h的巨噬细胞上清液加入到培养的小脑颗粒细胞内,可使神经细胞凋亡百分比较对照组明显增加。SAaB(30和100μmol.L-1)能明显抑制Aβ25~35引起的巨噬细胞磷酸化ERK1/2、磷酸化p38 MAPK和iNOS表达增加,SAaB(10,30和100μmol.L-1)也能对抗Aβ25~35引起的TNF-α和NO的生成增加及明显降低由Aβ25~35激活巨噬细胞所介导的神经细胞凋亡。结论SAaB对Aβ25~35激活巨噬细胞引起神经细胞凋亡具有对抗作用,该作用与其抑制巨噬细胞的ERK1/2信号转导通路,进而抑制巨噬细胞TNF-α和NO的产生有关。     

糖皮质激素促进β-淀粉样蛋白对海马神经元损伤的研究

目的在体外实验条件下,观察糖皮质激素是否促进β-淀粉样蛋白的神经元毒性作用。方法通过LDH释放率法检测细胞活力、TUNEL法测细胞凋亡以及LSCM测胞内Ca²⁺浓度的变化。结果单独的地塞米松(10^-8,10^-7,10^-6mol·L^-1)组或Aβ25-35(0.5μmol·L^-1)组分别作用海马神经元后,细胞活力变化不明显(P>0.05);但与同剂量的DEX、Aβ_25-35组相比,DEX+Aβ_25-35组的细胞活力明显降低(P<0.05),同时胞内Ca²⁺显著上升(P<0.05),神经元的凋亡率增加明显,细胞内出现凋亡的典型形态学特征。结论糖皮质激素可能通过促进Aβ引起海马神经元胞内Ca²⁺升高增加神经元毒性作用。     

阿魏酸钠对淀粉样β蛋白片段1-42引起的培养海马神经元损伤的保护作用及机制

目的研究阿魏酸钠对β蛋白片段1-42所致培养海马神经元损伤的保护作用及机制。方法原代培养海马神经元,阿魏酸钠(50、100、200μmol·L-1)预处理6 h后,加入50 nmol·L-1的Aβ1-42作用72 h,MTT法测海马神经元细胞存活率,应用倒置相差显微镜和微管相关蛋白-2(MAP-2)免疫荧光染色观察神经元树突的生长,Western蛋白印迹法检测海马神经元磷酸化mTOR和p70s6K蛋白表达。结果与对照组相比,Aβ1-42引起海马神经元细胞的存活率明显降低(P<0.01),可使培养海马神经元出现明显退行性改变,表现为树突串珠样改变和突起回缩,树突总长度和末梢分支数明显减少,磷酸化的mTOR和p70s6K蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。应用阿魏酸钠(50、100、200μmol·L-1)预处理6 h可明显对抗Aβ1-42引起的神经元损伤及蛋白表达的改变(P<0.01)。结论阿魏酸钠通过上调磷酸化的mTOR/p70s6K对抗Aβ1-42引起的海马神经元损伤。     

知母皂苷元对谷氨酸引起的皮层神经元损伤的保护作用研究

目的观察知母皂苷元(Sarsasapogenin,SAR)对谷氨酸引起的皮层神经元损伤的保护作用。方法大鼠乳鼠大脑皮层神经元,培养7 d后用于实验。倒置相差显微镜观察神经元树突生长发育情况;用MTT法测定细胞活力;Ho-echst33258核染色观察细胞凋亡的形态学改变;Western印迹法检测神经元SYP、caspase-3、钙蛋白酶Ⅰ蛋白表达水平。结果形态学观察结果显示谷氨酸可明显抑制神经元树突的生长发育,表现为神经元树突总长度明显降低、一级树突数目明显减少、最大分支级数明显减少及胞体面积缩小。SAR(10、30、100μmol.L-1)可明显抑制谷氨酸对神经元树突生长发育的抑制作用,并呈明显浓度依赖。MTT和Ho-echst33258核染色结果显示谷氨酸可降低神经元细胞活力及增加神经元细胞凋亡百分比。SAR(10、30、100μmol.L-1)能明显对抗谷氨酸引起的神经元细胞活力降低及细胞凋亡百分比增加。Western印迹结果显示谷氨酸可明显降低SYP蛋白表达水平及增加活性caspase-3、钙蛋白酶Ⅰ蛋白表达水平。SAR(10、30、100μmol.L-1)可明显对抗谷氨酸引起SYP蛋白表达降低及活性caspase-3、钙蛋白酶Ⅰ蛋白表达增加。结论知母皂苷元能够明显对抗谷氨酸引起的皮层神经元损伤作用。     

雷洛昔芬可减弱β-淀粉样蛋白对原代海马神经元的毒性作用

目的研究雌激素受体调节剂雷洛昔芬对原代海马神经元的保护作用。方法将原代培养的海马神经元分为五组:对照(A)组;β-淀粉样蛋白(Aβ)(B)组;Aβ+17β雌二醇(C)组;Aβ+苯甲酸雌二醇(D)组;Aβ+雷洛昔芬(E)组。用MTT方法观测各组海马神经元活力;通过AnnexinV-FITC双染流式细胞术检测各组海马神经元的凋亡。结果 B组海马神经元活力(72.5±10.7)%,显著低于A组的100%(P<0.01);B组凋亡率(31.5±1.9)%,明显高于与A组的(9.0±0.6)%(P<0.01)。C、D、E组海马神经元活力均高于与B组(P<0.05或P<0.01),而凋亡率均降低(P<0.05),但C、D、E三组之间差异无统计学意义。结论雷洛昔芬可减弱Aβ对原代海马神经元的毒性作用;雷洛昔芬对原代海马神经元的保护作用与雌激素相似。     

知母皂苷元对拟痴呆大鼠β-淀粉样肽沉积及胆碱能系统功能的影响

目的　观察知母皂苷元 (ZMS)对拟痴呆大鼠模型脑内 β 淀粉样肽沉积及胆碱能系统功能的作用。 方法　单侧基底核内联合注射 β 淀粉样肽2 5-3 5片段 (β AP2 5-3 5)和兴奋性氨基酸建立大鼠拟痴呆模型 ,然后将模型动物分为假手术组 37、模型组和ZMS组 ,采用免疫组织化学方法和图像分析法测定β AP2 5-3 5沉积斑块的面积。用避暗法及跳台法测定动物的学习记忆功能 ,用放射配基结合分析法分别测定脑胆碱乙酰转移酶 (ChAT)活性和M受体密度。结果　一次性脑内联合注射 β AP +IBO后 ,模型大鼠脑内有明显的 β AP斑块沉积 ,而模型大鼠喂服ZMS 6 0d后 ,能有效地减少β AP沉积的面积 ,同时ZMS能明显改善模型动物的学习记忆功能 ,并提高模型动物脑内ChAT活性和M受体密度。结论　ZMS可能对脑内 β AP的沉积有一定的清除作用 ,并对AD低下的胆碱能系统功能有一定的改善和治疗作用     

知母皂苷元对拟痴呆大鼠β-淀粉样肽沉积及胆碱能系统功能的影响

目的　观察知母皂苷元 (ZMS)对拟痴呆大鼠模型脑内 β 淀粉样肽沉积及胆碱能系统功能的作用。 方法　单侧基底核内联合注射 β 淀粉样肽2 5-3 5片段 (β AP2 5-3 5)和兴奋性氨基酸建立大鼠拟痴呆模型 ,然后将模型动物分为假手术组 37、模型组和ZMS组 ,采用免疫组织化学方法和图像分析法测定β AP2 5-3 5沉积斑块的面积。用避暗法及跳台法测定动物的学习记忆功能 ,用放射配基结合分析法分别测定脑胆碱乙酰转移酶 (ChAT)活性和M受体密度。结果　一次性脑内联合注射 β AP +IBO后 ,模型大鼠脑内有明显的 β AP斑块沉积 ,而模型大鼠喂服ZMS 6 0d后 ,能有效地减少β AP沉积的面积 ,同时ZMS能明显改善模型动物的学习记忆功能 ,并提高模型动物脑内ChAT活性和M受体密度。结论　ZMS可能对脑内 β AP的沉积有一定的清除作用 ,并对AD低下的胆碱能系统功能有一定的改善和治疗作用     

吡格列酮对谷氨酸诱导的皮质神经元损伤的保护作用

目的观察吡格列酮对谷氨酸所致培养皮质神经元损伤的保护作用及其机制。方法乳大鼠大脑皮质神经元,培养7d后用于实验。实验分为对照组,加入0.1%二甲亚砜;谷氨酸损伤组,加入谷氨酸100μmol·L-1作用2h或24h;吡格列酮组,先分别加入吡格列酮0.01,0.1和1μmol·L-1作用1h,然后加入谷氨酸;谷氨酸+吡格列酮+GW9662组,先加入GW966210μmol·L-1作用30min,然后加入吡格列酮1μmol·L-1,作用1h后加入谷氨酸。MTT法测定细胞存活率;Hoechst33258核染色观察细胞凋亡的形态学改变;Western印迹法检测Bcl-2蛋白、钙蛋白酶Ⅰ蛋白和磷酸化c-Jun氨基端激酶1(JNK1)表达水平;免疫荧光染色法检测钙蛋白酶Ⅰ及磷酸化活化转录因子2(ATF2)表达。结果谷氨酸作用24h可使体外培养神经元细胞存活率明显下降,从对照组的(100.0±15.4)%降低至(71.5±6.1)%;细胞凋亡百分率明显增加,从对照组的(8.7±1.3)%增加至(35.4±6.9)%;磷酸化JNK1、钙蛋白酶Ⅰ蛋白和磷酸化ATF2表达增加,Bcl-2蛋白表达水平降低。吡格列酮0.1及1μmol·L-1明显对抗谷氨酸引起的神经元损伤,神经元细胞存活率分别为(91.1±4.7)%和(96.6±3.4)%;细胞凋亡百分率分别为(15.5±3.8)%和(9.2±0.9)%。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的特异性阻断剂GW9662不能拮抗吡格列酮对神经元的保护作用,谷氨酸+吡格列酮+GW9662组细胞存活率为(91.3±6.7)%,细胞凋亡百分率为(10.2±1.8)%。单独应用GW966210μmol·L-1对细胞存活率和细胞凋亡百分率没有影响。吡格列酮也可抑制谷氨酸引起的磷酸化JNK1、磷酸化ATF2、钙蛋白酶Ⅰ表达增多及Bcl-2蛋白表达减少。结论吡格列酮对谷氨酸引起的培养皮质神经元损伤具有明显的保护作用,可能与吡格列酮抑制磷酸化JNK1和钙蛋白酶Ⅰ表达,以及增强Bcl-2蛋白表达有关,与PPARγ激活无关。     

Idebenone protects hippocampal neurons against amyloid β-peptide-induced neurotoxicity in rat primary cultures

The application of amyloid β-peptide (Aβ) 1–40 (10 μM) caused neurodegeneration of hippocampal neuronal cells, as indicated by the release of lactate dehydrogenase (LDH) into the culture medium. Treatment with idebenone (10–1000 nM), a potent antioxidant in mitochondria, protected the hippocampal neurons against the Aβ1–40 (10 μM)-induced neurotoxicity. To determine the morphological change in neurons during the Aβ1–40-induced cytotoxicity, the cells were immunostained with anti-MAP2 antibodies. After 4-day exposure to 10 μM Aβ1–40, the number of neurons was reduced, and the surviving neurons had an apparently reduced number of neurites which were shorter than those of control neurons. When idebenone was added to the culture medium with Aβ1–40, the number of surviving neurons was significantly increased, and their neurites were as long as seen in control culture. These results suggest that reactive oxygen species mediate neurotoxicity of Aβ1–40, and idebenone protects neurons against the Aβ1–40-induced neurotoxicity. Received: 5 June 1998 / Accepted: 25 August 1998     

Study of the protective effect of calcium channel blockers against neuronal damage induced by glutamate in cultured hippocampal neurons

BackgroundThe aim of this study was to examine the putative protective effect of calcium channel blockers on hippocampal neurons in the experimental model of excitotoxic damage.MethodsSeven-day old primary dissociated cultures of rat hippocampal neural cells containing one of the following calcium channel blockers: cinnarizine, flunarizine or nimodipine were exposed to glutamate-induced injury. Quantitative assessments of neuronal injury were accomplished by measuring lactate dehydrogenase (LDH) activity in the media 24 h after exposure to glutamate and by counting and establishing the apoptotic and necrotic cells in flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining.ResultsIn our experiment, glutamate induced a 339% elevation of apoptotic cells and a 289% increase of necrotic cells in hippocampal neurons as compared to control cultures without drugs. In cultures containing flunarizine, glutamate-induced cell apoptosis was suppressed by 62% while necrosis showed no significant alternation. Cinnarizine exerted no anti-apoptotic effects on glutamate-injured cultured hippocampal neurons, while nimodipine intensified the apoptotic pathway of cell death and promoted an increase in the number of apoptotic neurons by 26%. When cinnarizine or nimodipine were used, the percentage of necrotic cells was significantly lower when compared with glutamate-injured cultures and it amounted to 44% and 24% for cinnarizine and nimodipine, respectively.ConclusionsThe obtained results suggest the beneficial anti-apoptotic potential of flunarizine and the anti-necrotic potential of cinnarizine against glutamate-induced death of cultured hippocampal neurons. Nimodipine can protect neurons against necrosis, but has an intensified adverse pro-apoptotic effect on cultured neurons in the experimental model of excitotoxic injury.     

阿托伐他汀促进体外培养大鼠乳鼠皮层神经元树突生长及突触相关蛋白表达

目的探讨阿托伐他汀(atorvastatin,Ato)对体外培养大鼠乳鼠大脑皮层神经元树突生长及突触相关蛋白是否有影响。方法选用出生0～24 h Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠,取大脑皮层,进行皮层神经元体外培养,神经元培养4 d后用于实验。实验分为对照组、不同浓度Ato处理组、Ato处理不同时间组;对照组:加入等量含0.1%DMSO培养基;Ato处理组:培养4 d神经元,加入不同浓度Ato(0.1、1、5、10μmol.L-1)作用48 h;Ato处理时间组:将Ato 5μmol.L-1加入培养4 d神经元,分别作用12、24、48 h。应用倒置相差显微镜和微管相关蛋白-2(MAP2)免疫荧光染色观察树突的生长,应用Tsview软件测量神经元树突分支总长度(totaldendritic branch length,TDBL)和一级树突数目(primary-or-der dendrite number,PDN);应用免疫荧光染色法和Westernblot检测皮层神经元突触素(synaptophysin,SYP)、突触后致密蛋白95(postsynaptic density protein-95,PSD-95)蛋白表达的改变。结果给予不同浓度Ato(0.1、1、5、10μmol.L-1)作用48 h后,神经元TDBL较对照组明显增加(P<0.01),神经元PDN较对照组呈浓度依赖性增加,Ato(0.1、1μmol.L-1)时可增加神经元PDN(P<0.05),Ato(5、10μmol.L-1)时明显增加神经元PDN(P<0.01);Ato 5μmol.L-1作用24 h后可增加神经元TDBL、PDN(P<0.05),Ato5μmol.L-1作用48 h后可明显增加神经元TDBL、PDN(P<0.01);应用倒置相差显微镜和微管相关蛋白-2(MAP2)免疫荧光染色观察树突TDBL和PDN明显增加;免疫荧光和Western blot结果显示Ato可增加SYP、PSD-95表达水平。结论 Ato促进体外培养大鼠乳鼠皮层神经元树突生长及突触相关蛋白表达。     

粉防己碱对喹啉酸致海马神经元损伤的保护作用

目的研究粉防己碱(Tet)对喹啉酸(QA)诱导原代培养乳鼠海马神经元兴奋毒损伤的保护作用。方法乳鼠海马神经元原代培养后用QA诱导损伤,MTT法测定细胞活力,同时测定培养上清中LDH活性,神经元病理染色后进行形态学观察。结果Tet(10-6mol·L-1和10-7mol·L-1)能明显提高QA损伤后原代培养乳鼠海马神经元的细胞活力,降低其上清液中LDH活性,与模型组相比,差异均有显著性(P<0.01),并明显改善神经元病理损伤。结论Tet(10-6mol·L-1和10-7mol·L-1)对QA所致的原代培养乳鼠海马神经元损伤有明显保护作用。     

黄芪提取物保护Aβ致海马神经元损伤

目的探讨黄芪提取物在Aβ所致海马神经元损伤中的作用。方法通过对孕18d胎鼠的海马神经细胞培养,观察Aβ对神经细胞的毒性及黄芪提取物的保护作用。采用LDH法和MTT法检测细胞活力,LSCM测胞质钙离子浓度的变化及TUNEL法测细胞凋亡。结果Aβ与细胞孵育后,细胞活力明显下降,并呈时间和剂量依赖性,同时细胞内钙显著上升,细胞出现凋亡的典型的形态学特征。20、40μg·L-1黄芪提取物能明显提高细胞活力、降低胞质钙离子浓度、减少凋亡的细胞数。结论黄芪提取物对Aβ所致海马神经元损伤具有一定的保护作用,可能与其降低海马神经元胞质钙离子有关。     

银杏叶提取物EGb761对NO供体硝普钠诱导的海马神经元凋亡的保护作用

目的　探讨银杏叶提取物 (EGb 761 )对NO供体硝普钠 (SNP)引起的大鼠海马神经元凋亡的影响。方法　采用MTT比色分析测细胞存活率、Hoechst 332 58荧光染色及DNA琼脂糖凝胶电泳分析等方法检测凋亡。结果　不同剂量EGb761预处理海马神经元 6h可剂量依赖地对抗SNP引起的神经元凋亡 ,提高神经元的存活率 ;减少SNP引起的核固缩、凝聚和碎裂现象 ;DNA凝胶电泳图谱未见典型的“梯子状”改变。结论　EGb 761对NO供体SNP诱导的海马神经元凋亡具有明显的保护作用