葡萄糖神经酰胺合成酶基因在人胰腺癌细胞SW1990及其耐药亚株中的表达和意义

目的探讨葡萄糖神经酰胺合成酶（glucosylceramide synthase,GCS）基因在人胰腺癌细胞SW1990及其耐药亚株中的表达和意义。方法体外培养人胰腺癌细胞SW1990和其耐药亚株SW1990／FU、SW1990／ADM、SW1990／GEM,以细胞活性测定（CCK-8法）检测耐药亚株的耐药指数,相对定量荧光实时PCR（RT—PCR）法检测GCS mRNA的表达,免疫印迹法检测GCS蛋白表达水平。结果与亲本株相比,SW1990／FU、SW1990／ADM、SW1990／GEM的耐药指数分别为339．7、11．9、56．6。RT—PCR和免疫印迹检测结果显示亲本株和耐药亚株均有GCS mRNA和蛋白的表达,GCS mRNA在3株耐药亚株中的表达均比亲本株有增高趋势,且SW1990／ADM、SW1990／GEM的GCS蛋白表达水平较亲本株升高,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论GCS基因在人胰腺癌细胞株SW1990和其3株耐药亚株中表达阳性,GCS蛋白在SW1990／ADM、SW1990／GEM中呈高表达,表明GCS可能参与胰腺癌耐药株细胞对ADM、GEM的耐药。     

胰腺癌阿霉素耐药细胞株SW1990/ADM的建立及其耐药机理研究

目的　建立人胰腺癌阿霉素 (ADM )耐药细胞株SW 1990 /ADM ,探讨其耐药机理。方法　采用ADM体外浓度梯度倍增法诱导培养人胰腺癌细胞株SW 1990 10个月 ,获得耐药细胞株SW 1990 /ADM ,脱药培养 2个月后检测其生物学性状、药物敏感性及多药耐药基因mdr1的功能及表达情况。结果　与亲本细胞株SW 1990相比 ,SW1990 /ADM在形态学上发生了一系列变化 ;对包括ADM在内的多种化疗药物均表现出一定的耐药性 ,其对ADM、丝裂霉素、氟尿嘧啶和健择的耐药指数分别达到 4 9.6 0、7.2 5、3.80和 1.2 5 ;其mdr1mRNA的表达亦明显高于亲本细胞株SW 1990 (P<0 .0 1)。结论　体外浓度梯度倍增法可建立稳定传代的人胰腺癌耐药细胞株SW1990 /ADM。其耐药性与mdr1的表达呈正相关。     

胰腺癌细胞株耐药与凋亡相关基因的改变

目的探讨凋亡相关基因的改变与胰腺癌细胞耐药的关系。方法利用含有18000条人类基因的cDNA基因芯片对人胰腺癌细胞株SW1990及其耐药细胞亚株SW1990/FU和SW1990/ADM间的差异表达基因进行筛选。结果人胰腺癌细胞株SW1990与耐药细胞亚株SW1990/FU和SW1990/ADM间的共同差异表达基因有170条,其中6条与细胞凋亡相关。结论凋亡相关基因hSiah2、TIA1、CDC2、PDCD2、MAPK6及MAP4K3可能参与了胰腺癌耐药过程的发生,可能成为新的胰腺癌耐药相关基因。     

诱导建立人胰腺癌耐放射细胞亚株的体外实验研究

目的 探索诱导并建立人胰腺癌耐放射细胞亚株的体外实验方法。方法 应用X射线对人胰腺癌细胞株SW1990、Capan-1、AsPC-1、MIAPaCa-2、PANC-1及P3进行梯度递增的诱导照射,随后观察其细胞形态学、细胞周期及放射敏感性的变化。结果 与亲本株相比,各株细胞受照射后形态均出现明显改变;耐放射株SW1990-R、ASPC—R、MIA-R、PAN—R及P3-R的G2／M均明显降低,而放射敏感性指标SF2升高9％～45％。结论 梯度增加照射剂量是可行的体外诱导建立人胰腺癌耐放射细胞亚株的方法。     

应用基因芯片技术筛选胰腺癌多药耐药相关基因

目的应用基因芯片技术筛选胰腺导管腺癌（PDAC）获得性多药耐药（MDR）相关基因。方法通过含人类全基因组的寡聚核苷酸基因芯片（Affymetrix HG U133 2．0plus）筛查人胰腺癌细胞株SW1990与多药耐药细胞亚株SW1990／5-FU,SW1990／ADM和SW1990／GEM之间的表达基因差异,并进行生物信息学分析。结果与亲本株SW1990相比,3株耐药细胞亚株中表达均有差异的基因共有165条;其中上调表达基因43个,下调表达基因122个。差异表达基因的功能分类包括：抗氧化还原、细胞凋亡、细胞周期、信号转导、细胞黏附相关的基因等。聚类分析发现差异基因中的PRDX4簇、TNKS2簇及CCDC5簇可能与耐药发生密切相关。结论胰腺癌对化疗的多药耐药是复杂的多基因作用的结果。本试验初步建立了胰腺癌多药耐药发生相关的总体基因表达改变图谱,为胰腺癌多药耐药发生机制的研究提供了新的靶点。     

吉西他滨耐药人胰腺癌细胞株的建立及其与肿瘤干细胞的相关性研究

目的 建立吉西他滨耐药人胰腺癌细胞株SW1990/GZ,并探讨SW1990/GZ和胰腺癌肿瘤干细胞的相关性.方法 应用间歇浓度梯度倍增法建立吉西他滨耐药人胰腺癌细胞株SW1990/GZ;倒置显微镜下观察细胞形态;MTT法计算耐药指数(RI);荧光定量PCR检测ABCB1、ABCC1及ABCG2基因的表达水平;裸鼠皮下种植瘤试验观察SW1990和SW1990/GZ的成瘤能力;流式细胞仪通过侧群细胞(SP)法和表面特异抗原标记法(CIM4+CD24+)检测肿瘤干细胞含量.结果 在形态学上,SW1990/GZ较SW1990发生明显改变;SW1990/GZ的耐药指数是亲代SW1990的77.2倍;与亲代SW1990相比,耐药株SW1990/GZ中ABCB1、ABCC1及ABCG2的表达水平明显增高(P<0.01),裸鼠皮下成瘤能力增强(P<0.01);耐药株SW1990/GZ中SP细胞比例为(11.0±1.0)%,亲代SW1990中SP细胞比例为(4.6±0.9)%,CD44+CD24+细胞在两者中的比例分别为(8.7±0.8)%和(1.1±0.4)%(P<0.01).结论 吉西他滨耐药胰腺癌细胞株SW1990/GZ能高效富集胰腺癌肿瘤干细胞,CD44与胰腺癌获得性耐药关系密切,可能为克服胰腺癌获得性耐药提供新的治疗靶点.     

维拉帕米逆转胰腺癌化疗耐药的研究

目的　探讨多药耐药蛋白P 170拮抗剂维拉帕米对胰腺癌细胞株化疗耐药的逆转作用。方法　采用RT PCR法对胰腺癌细胞株SW 1990和CAPAN 1中多药耐药基因MDR1mRNA的表达进行半定量分析 ;罗丹明外排试验检测胰腺癌细胞株中P 170的功能 ;MTT比色法评估胰腺癌细胞株对化疗药物的敏感性 ,并比较单纯化疗与化疗联合维拉帕米对其的疗效差异。结果　RT PCR检测结果显示MDR1mRNA在SW 1990中的表达丰度为 0 5 75 0± 0 0 76 4 ,在CAPAN 1中的表达丰度为 0 186 4± 0 0 5 36 ,两者具有显著差异 (P <0 0 1)。罗丹明外排试验表明 :SW1990阳性细胞百分数明显低于CAPAN 1(P <0 0 1) ;维拉帕米可使SW 1990阳性细胞百分数明显增加 (P <0 0 1)。MTT结果表明 :SW1990较CAPAN 1对ADM、MMC耐药 ;维拉帕米可部分逆转其对ADM和MMC的耐药性。结论　MDR1可能参与胰腺癌细胞株化疗耐药 ;中等剂量的维拉帕米联合化疗可逆转具有MDR1表型的人胰腺癌细胞株对ADM和MMC的耐药现象。     

人结直肠癌耐药细胞株体外药物敏感性实验

目的 观察人结直肠癌细胞被抗肿瘤药物作用后对不同药物的耐受情况。方法 人结直肠癌LOVO细胞系分别在体外与氟尿嘧啶（5－FU）和阿霉素（ADM）作用,成功诱导LOVO／5－FU和LOVO／ADM两个耐药细胞株,体外细胞毒性实验观察它们对5－FU、丝裂霉素（MMC）、ADM、顺铂（DDP）、氨甲喋呤（MTX）、阿糖胞苷（Arac)等6种药物敏感性。结果 两株细胞对5－FU和ADM均有耐药,耐药指数分别为16．48、23．17,LOVO／5－FU对MMC、ADM及DDP为3．37、2．22、2．70倍耐药,LOVO／ADM对MMC、5－FU及DDP为4．96、11．66、3．70倍的耐药。结论 两株耐药细胞均产生了多药耐药（multidrug resistance,MDR),药物引起的耐药一般是交叉耐药。     

人胰腺癌细胞株放射敏感性的体外研究

目的通过体外实验探讨人胰腺癌细胞株的放射敏感性。方法培养人胰腺癌细胞株SW1990、Capan-1、AsPC-1、MIAPaCa-2、PANC-1、P3，应用集落形成实验测定胰腺癌细胞在6MVX线不同剂量照射后的存活分数，计算各株细胞的放射生物学参数。结果胰腺癌细胞株MIAPaCa-2对放射治疗最敏感，SF2为0．388，而Capan-1对放射治疗最不敏感，SF2为0．758，MIAPaCa-2与As-PC-1、AsPC-1与SW1990之间的放射敏感性无显著差异，其余各株胰腺癌细胞之间存在显著差异。结论不同胰腺癌细胞株的放射敏感性存在差异。     

多药耐药相关基因及其蛋白在介导胰腺癌细胞原发性耐药中的作用及调控

目的 检测多药耐药相关基因（MDR1）及其蛋白（P-gP）在胰腺癌细胞株的表达,初步探讨胰腺癌发生先天性耐药的机理。方法 选择8株人胰腺癌细胞株,采用RT-PCR方法检测MDR1mRNA在胰腺癌细胞中的表达;通过免疫细胞化学方法检测P-gP的表达;以流式细胞仪检测胰腺癌细胞对罗丹明的外排情况,评价P-gP泵功能;最后通过P-gP抑制物维拉帕米与化疗药物联合应用,检测其对胰腺癌细胞的杀伤作用。结果 MDR1mRNA在胰腺癌细胞株SW1990中的表达最高,除PCT-2未检测到MDR1的表达外,其余6株细胞均有MDR1的微弱表达;免疫细胞化学染色结果证实P-gP在SW1990中的表达明显高于其他细胞株。57．9％±5．4％的SW1990细胞内有罗丹明蓄积,而在P-gP阴性对照细胞中,99．5％±3．3％的细胞内存在罗丹明的积聚,两者差异有统计学意义（P〈0．05）。P-gP抑制物维拉帕米与阿霉素或表阿霉素联合应用时可以部分逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。结论 MDR1及P-gP在人胰腺癌细胞中存在一定量的表达;维拉帕米联合阿霉素可以明显抑制P-gP阳性细胞的生长。     

人结肠癌耐药细胞系SW480/ADM的建立及其生物学特性

目的　建立人结肠癌SW4 8 0耐阿霉素细胞系 (SW4 8 0 /ADM) ,研究其耐药机制及逆转。方法　应用人结肠癌细胞系SW4 8 0,以递增阿霉素 (ADM)浓度的方法,体外连续培养建成一株SW4 8 0 /ADM。观察该细胞生长规律。用MTT比色法检测该耐药细胞系的多药耐药性;以流式细胞术检测该耐药细胞的细胞周期分布、细胞表面多药耐药基因 (MDR)的表达产物P-糖蛋白 (P gp) 、多药耐药相关蛋白 (MRP)及谷胱甘肽硫转移系统 (GSH/GST)的表达;用高效液相色谱仪检测耐药细胞内阿霉素含量。结果　SW4 8 0 /ADM细胞与SW4 8 0细胞相比,生长缓慢,倍增时间延长,细胞周期分布发生改变;SW4 8 0 /ADM细胞较SW4 8 0的阿霉素半数抑制浓度 (IC50 )增大 1 3. 2 2倍,并对多种抗癌药物产生耐药性。SW4 8 0 /ADM细胞表面MDR的表达产物P gp,MRP和GSH/GST的表达均较SW4 8 0细胞显著升高 (P< 0. 0 1 )。SW4 8 0 /ADM细胞内阿霉素含量明显低于SW4 8 0细胞。结论　SW4 8 0 /ADM细胞对阿霉素的耐药是获得性的,并呈多药耐药性特征,可用于对人结肠癌耐药、逆转和MDR机制等方面的研究。     

丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1与胰腺癌细胞获得性耐药的关系

目的 探讨丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸酶1（MKP-1）在介导胰腺癌耐药细胞株SWl990／Fu产生获得性耐药过程中的可能机制。方法 采用Northern印迹杂交和Western蛋白免疫印迹杂交方法,检测MKP-1在体外诱导建立的人胰腺癌耐药细胞株SWl990／Fu、亲本细胞株SWl990和胰腺癌细胞株MiaPaCa-2中的表达,分析MKP-1在SW1990／Fu产生获得性耐药前后的变化。结果 Northern印迹杂交结果显示,在SWl990／Fu、SWl990和MiaPaCa~细胞株中均检测到2400bp的MKP-1mRNA,MKP-1在SWl990／Fu的表达水平明显低于SWl990和MiaPaCa-2。在蛋白水平上,Western蛋白免疫印迹杂交结果也表明,与SWl990和MiaPaCa4相比,MKP-1蛋白在SWl990／Fu细胞中的表达水平明显降低。结论 MAPK家族的关键调节酶MKP-1可能参与SWl990／Fu获得性耐药的产生,推测细胞信号转导系统的改变可能是导致胰腺癌细胞产生获得性耐药的机制之一。     

金属硫蛋白与人胰腺癌细胞耐放射性的关系初步探讨

目的探索金属硫蛋白（MT）表达水平与胰腺癌细胞放射敏感性的关系。方法分别采用外源性锌离子及反义寡聚核酸（AS）转染P3、Pan-1、MIA、SW1990、Cap、ASPC等6株胰腺癌细胞，调节MT表达，随后应用ELISA及集落实验检测MT表达水平及放射敏感性指标存活分数（SF2）的变化。结果与亲本株相比，经锌离子刺激后，P3、Pan-1、MIA、SW1990及Cap等5株胰腺癌细胞MT表达增高1．98-31．17倍（P〈0．05），SF2增高5．1％-26．5％（P〈0．05）；ASPC经锌离子诱导后MT表达及耐放射性增高均不明显（P〉0．1）。应用AS转染后，P3、Pan-1、MIA、SW1990、Cap、ASP（；等6株胰腺癌细胞MT表达降低1．05～26．6倍（P％0．05），SF2降低3．6％～16．7％（P〈0．05）。结论MT表达水平与胰腺癌细胞耐放射性有明显相关性。