霍乱弧菌ctxAB融合基因的克隆及原核表达

目的构建霍乱毒素A亚基基因（ctxA）和B亚基基因（ctxB）的融合表达载体，并在原核系统表达，为霍乱毒素（CT）免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法以霍乱弧菌DNA为模板，利用重叠PCR技术，扩增出含有ctxA和ctxB的融合基因片段ctxAB，并与带有硫氧还蛋白（Trx）基因的高效原核表达质粒pET32a（＋）定向重组，构建重组质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3）。经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后，以IPTG诱导表达TrxBB—CTAB融合蛋白，用SDS—PAGE及Western blot进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明，扩增出了霍乱弧菌1158bp的ctxAB融合基因，成功构建了重组质粒pET—ctxAB，SDS—PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET—ctxAB在原核系统中得到了高效融合表达。结论霍乱弧菌ctxA基因和ctxB基因通过重叠PCR成功地融合在一起，融合基因ctxAB在大肠杆菌中得到了高效表达。     

人NPTX2基因原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化

目的 在大肠埃希菌中表达人神经元正五聚蛋白2(NPTX2),并对该重组蛋白进行纯化、鉴定.方法 双酶切 pReceiv-er-M15 NPTX2质粒获得人NPTX2全长cDNA,经Not I 和EcoR I 双酶切后,连接至谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合表达载体pGEX-4T-1中,经限制性酶切、PCR和测序验证正确后,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导重组蛋白表达,采用Western blotting鉴定表达产物,亲和层析法纯化GST-NPTX2蛋白.结果 经酶切与测序鉴定证实原核重组载体pGEX4T-1-NPTX2构建成功,表达产物相对分子量为70kD左右,与预期值相符,Western blotting证实该蛋白具有免疫反应特异性,亲和层析法获得了纯化的GST-NPTX2蛋白.结论 构建了pGEX-4T-NPTX2原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达了GST-NPTX2融合蛋白.亲和纯化获得较高纯度的GST融合蛋白,为下一步继续研究NPTX2的生物学功能奠定了基础.     

人前列腺干细胞抗原的原核表达、纯化及鉴定

目的 构建包含人前列腺干细胞抗原(PSCA)的原核表达质粒,并进行诱导表达、蛋白纯化及鉴定.方法 通过PCR扩增人PSCA基因片段,与过渡载体pGEM-T Easy连接后进行测序鉴定,鉴定正确后,将PSCA基因片段酶切并插入含有谷胱甘肽s-转移本科GST标签的原核表达载体pET42a,得到重组质粒pET42a-PSCA.将pET42a-PSCA转化大肠埃希菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达GST-PSCA融合蛋白,用Glutathione-Sepharose 4B柱对融合蛋白进行纯化,纯化产物进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定.结果 PSCA基因的PCR产物大小与预期相符,测序结果与GenBank 中的PSCA序列一致.pET42a-PSCA原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE及Western blotting检测显示融合蛋白诱导表达成功,分子量大小约为43kD.结论 成功构建了人PSCA的原核表达质粒,能在BL21菌株中表达,且纯化后得到较高纯度的GST-PSCA融合蛋白,为后续抗前列腺癌基因疫苗研究奠定了基础.     

肠毒素大肠杆菌定居因子CS6抗原基因在大肠杆菌中的高效表达

目的：构建表达肠毒素大肠杆菌(ETEC)定居因子CS6的重组质粒，并在大肠杆菌DH5d中高效表达。方法：利用基因工程的方法，将含有cS6基因的质粒pMG233用限制性内切酶Cla Ⅰ酶切，得到长约3．1kb的CS6片段(含有cS6结构基因及调控基因的DNA片段)；并与用限制性内切酶Cla Ⅰ酶切的表达载体质粒pBV321连接．得到含有CS6片段的重组质粒pMG235，转化至大肠杆菌DH5a。结果：SDS-PAGE、Western印迹及免疫荧光观察的结果表明，重组菌DH5a／pMG235可高效表达相对分子质量为14600的CS6抗原蛋白，并在重组菌表面表达，表达产物可被抗CS6多克隆抗体识别。结论：重组菌可稳定表达肠毒素大肠杆菌定居因子抗原CS6。     

抗HBs Fab-IFNα融合蛋白的制备与初步鉴定

目的构建抗HBsAg的pComb Fab-IFNα载体,原核表达具双重生物活性的抗HBs Fab-IFNα融合蛋白。方法以pBAD-Fab和pBADIFNα作为模板,分别扩增Fd、λ和IFNα基因,经相应的限制性内切酶酶切后分3次克隆入pComBHss质粒,转化XL-1 Blue大肠埃希菌。限制性酶切和测序鉴定重组质粒,免疫蛋白印迹(Western blotting)和斑点印迹(Dot blotting)鉴定融合蛋白的表达及抗原结合活性。结果重组载体的酶切、电泳及测序表明抗HBs Fab-IFNα基因克隆正确。表达产物经12%SDS-PAGE电泳、转印,Western blotting显示该融合蛋白分子量约为65kD,Dot blotting显示其与HBsAg具有结合能力。细胞病变抑制法测定IFNα生物学活性为7.8×104~5.1×105U/ml。结论该原核系统成功表达了抗HBs Fab-IFNα融合蛋白,表明其既具有抗HBsAg结合能力,又具备IFNα的生物活性,为进一步的系统表达和应用研究提供了条件。     

HSA—sTRAIL融合蛋白的表达质粒pPICZαA—HSA—sTRAIL的构建

目的:构建pPICZαA-HSA-sTRAIL真核表达质粒。方法:用PCR方法扩增sTRAIL基因,然后克隆入pPICZαA载体,构建pPICZαA-sTRAIL质粒,然后将HSA基因克隆入pPICZαA-sTRAIL质粒,构建pPICZαA-HSA-sTRAIL真核表达质粒。重组子均进行酶切鉴定和PCR鉴定,最后进行DNA测序验证。结果:PCR方法克隆出目的基因,并成功构建了pPICZαA-HSA-sTRAIL质粒。酶切鉴定、PCR鉴定和DNA测序均证明构建的表达质粒完全与预期一致。结论:成功构建了pPICZαA-HSA-sTRAIL真核表达质粒。     

结核分枝杆菌Rv0309抗原的重组表达、纯化和鉴定

目的重组表达结核分枝杆菌Rv0309蛋白,以进一步探讨其免疫效应。方法将结核分枝杆菌抗原Rv0309的全长cDNA插入到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建成Rv0309重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达,进一步经GST亲合层析柱纯化,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组表达蛋白。结果获得了pGEX4T-Rv0309重组子,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达重组Rv0309蛋白,其条带大小约23000,与预期结果相符。结论成功地进行了结核分枝杆菌抗原Rv0309的基因克隆与重组表达,为进一步研制新型结核病疫苗打下了基础。     

MARCH1真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建MARCH1真核表达载体并进行鉴定和纯化,为研究MARCH1在小鼠树突细胞(DCs)中的生物学作用奠定基础.方法 从小鼠尾部提取cDNA作为模板,采用特异的引物,通过聚合酶链反应(PCR)扩增MARCH1cDNA片段,经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,连接于载体pMB-HA质粒上,构建重组载体,经双酶切和DNA测序分析检测重组载体构建结果,转化大肠埃希菌DH5α感受态菌、筛选阳性克隆、抽提质粒并进行纯化.结果 PCR获得与预期大小一致(约3900bp)的cDNA片段,成功构建重组载体pMB-HA-MARCH1,双酶切及测序鉴定证实MARCH1 cDNA片段正确插入该真核表达载体中.结论 成功构建含有MARCH1的真核表达载体,为进一步研究提供了实验基础.     

稳定表达人MAGE-1基因的小鼠细胞系的建立与鉴定

目的：克隆人黑素瘤抗原-1（MAGE-1）基因，构建真核表达载体，建立稳定表达人MAGE-1的小鼠细胞株。方法：提取人肝癌细胞的总RNA，RT-PCR法获得人MAGE-1cDNA，将测序正确的MAGE-1基因克隆至真核表达载体pcDNA3中，进行酶切鉴定和序列测定。将重组质粒pcDNA／MAGE和空载体pcDNA3分别转染入小鼠骨髓瘤细胞SP2／0中，经G418筛选获得稳定表达株，用RT-PCR和Western印迹检测MAGE-1基因的转录及蛋白表达。结果：从肝癌细胞中成功克隆到人MAGE-1基因，经测序证明基因正确，酶切和序列测定表明，人MAGE-1基因的真核表达质粒已成功构建。将此重组质粒转入的SP2／0细胞可稳定表达人MAGE-1基因。结论：成功构建可稳定表达人MAGE-1基因的小鼠转基因细胞，为MAGE-1的免疫治疗研究奠定了基础。     

小鼠固醇载体蛋白2原核表达载体的构建与表达纯化

目的 构建小鼠固醇载体蛋白2(SCP-2)融合蛋白表达载体,并在原核细胞内表达及纯化获得具有活性的融合蛋白,为进一步研究SCP-2的生物学功能提供基础.方法 提取BALB/c小鼠肝脏组织总RNA,通过RT-PCR扩增得到鼠SCP-2编码序列,然后将该编码序列克隆到带有His标记的载体pET14b上,重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确后转化大肠埃希菌BL21(DE3),用异丙基β-D硫代半乳糖(IPTG)诱导融合蛋白表达,用镍离子亲和层析的方法纯化融合蛋白并进行复性,然后切取分子量正确的条带用SDS-PAGE及质谱技术进行鉴定.结果 重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定证明载体构建正确.融合蛋白表达纯化后获得了分子量约59kD的融合蛋白,符合预期大小,并经质谱分析证明该融合蛋白的表达正确.结论 成功构建了带His标签的SCP-2原核表达载体,并成功表达及纯化出该融合蛋白,为深入研究SCP-2的相关生物学功能提供了一个重要的工具.     

幽门螺杆菌HpaA减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗的构建及免疫原性检测

目的 构建含幽门螺杆菌(H．pylori)hpaA基因的重组减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗。方法 应用PCR方法从H．pylori标准菌株基因组DNA中扩增hpaA基因,克隆入pUCmT载体,检测hpaA基因序列,经过酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pIRES,转入大肠杆菌,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应鉴定。重组载体pIRESrhpaA转化入减毒鼠伤寒沙门菌LBS000,抽提质粒,再转化入SL7207,反复传代,鉴定重组核酸疫苗菌的稳定性。重组载体pIRES-hpaA通过脂质体法转染CCXS-7细胞,SDS-PAGE及Western印迹法检测pIRES-hpaA表达HpaA蛋白的免疫原性。结果 成功扩增出长约750bp的hpaA基因,测序结果表明扩增出的hpaA基因与H．pylorihpaA序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实hpaA基因克隆入真核表达载体pIRES,成功构建了含hpaA基因的幽门螺杆菌核酸疫苗pIRES-hpaA,并成功构建了幽门螺杆菌hpaA基因的减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗,重组核酸疫苗稳定,Western印迹法检测到了特异性的蛋白条带。结论 构建了具有免疫反应性的H．pylori hpaA减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗,为进一步探索其免疫作用奠定了基础。     

耐辐射奇球菌pprM基因回补株的构建与鉴定

目的 构建耐辐射奇球菌pprM基因缺失回补菌株, 为进一步研究PprM蛋白的功能奠定实验基础。 方法 设计并合成HA-pprM基因(HA为流感病毒血凝素)全长的引物, 以无突变的pGEX-6p-1-pprM载体为模板, PCR扩增出携带NdeⅠ酶切位点的HA-pprM基因全长, 经NdeⅠ酶切后, 与pRADK载体连接并转化大肠杆菌, 经培养、提取质粒及纯化后, 采用酶切鉴定以及基因测序方法确认插入序列的正确性; 采用CaCl₂法将构建好的重组质粒pRADK-HA-pprM转化到耐辐射奇球菌pprM基因缺失的菌株中, 通过Western blot验证HA-PprM融合蛋白的表达。 结果 构建的重组质粒pRADK-HA-pprM经NdeⅠ酶切鉴定结果符合目的条带大小(438 bp), 测序结果显示插入的寡核苷酸序列及方向与预期的一致, Western blot结果显示HA-PprM融合蛋白的相对分子质量约为13000。 结论 笔者成功构建了重组质粒pRADK-HA-pprM, 为进一步研究与PprM蛋白相互作用的靶DNA的筛选奠定了良好的基础。     

小鼠附睾分泌蛋白Spink12的原核表达与纯化

目的原核表达带有His标签的小鼠附睾蛋白Spink12,对表达产物进行鉴定和纯化,以研究Spink12的免疫避孕效果。方法提取小鼠附睾组织总RNA,RT-PCR扩增不含信号肽的Spink12蛋白编码序列,以NdeⅠ和EcoRⅠ酶切后,将其连入原核表达载体pET28(a);经酶切和测序鉴定正确的重组质粒pET28(a)-Spink12,转化大肠埃希菌BL21感受态细胞。融合蛋白经IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE电泳和Western blotting免疫印迹鉴定。用Ni-NTA在非变性条件下利用不同的咪唑梯度浓度纯化融合蛋白6×His-Spink12。结果酶切和测序结果显示成功构建出原核表达载体pET28(a)-Spink12。重组质粒转化大肠埃希菌BL21并经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳显示表达出约9kD的融合蛋白6×His-Spink12,与理论分子量相符。融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的23.5%。用抗His单克隆抗体进行Western blotting免疫印迹鉴定,检测到同样大小的条带。经纯化获得较高纯度的融合蛋白6×His-Spink12,纯度达91.1%。结论成功表达并纯化了融合蛋白6×...     

肿瘤相关抗原MART-1蛋白原核表达载体的构建、表达纯化和活性鉴定

目的构建编码肿瘤相关抗原MART-1融合基因的原核表达载体,在大肠埃希菌中表达His-MART-1融合蛋白,并对蛋白进行纯化和免疫原性鉴定。方法采用PCR法扩增编码MART-1的基因片段,将该基因片段克隆到含有His标签的pET-28b原核表达载体上,重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定正确后转化大肠埃希菌,IPTG诱导融合蛋白表达,用镍离子亲和层析法纯化融合蛋白并进行脱盐,SDS-PAGE电泳和Western blotting法鉴定。通过ELISA法检测经树突状细胞提呈后的His-MART-1融合蛋白对特异性CD4+T细胞的刺激作用。结果重组质粒经双酶切、PCR和测序鉴定证明载体构建成功。His-MART-1融合蛋白经表达纯化后,分子量约13kD,与预期值相符。Western blotting证实该融合蛋白可与抗His单克隆抗体发生特异性结合。His-MART-1融合蛋白经树突状细胞提呈后能刺激MART-1特异性CD4+T细胞分泌IFN-γ。结论成功构建了编码MART-1基因原核表达载体pET-28b-MART-1,表达及纯化获得该融合蛋白,并证实其具有良好的免疫原性。     

钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32的重组表达及纯化

目的：构建L32-pQE32重组质粒，诱导表达重组钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32，对重组蛋白进行纯化。方法：采用PCR法从钩端螺旋体DNA中获取编码LipL32的基因片段，构建重组克隆载体pGEM-T／L32和表达载体L32-pQE32，转化受体茵E.coli DH5α和E．coli M15，IPTG诱导表达重组LipL32蛋白。Ni-NTA亲和层析纯化重组LipL32蛋白。结果：扩增出约750bp的LipL32成熟蛋白基因，LipL32基因插入pQE32表达载体，表达产物6个组氨酸与LipL32蛋白的融合蛋白相对分子质量约为31000，与预期大小一致。Western印迹显示能与钩体抗血清特异结合。结论：LipL32蛋白能在大肠杆菌中表达，Ni-NTA亲和层析可有效纯化重组LipL32蛋白，重组LipL32蛋白具有结合活性。     

无乳链球菌Sip基因的克隆与原核表达

无乳链球菌表面免疫相关蛋白(Surface immunogenic proteins,Sip)具有高度保守性,是无乳链球菌疫苗研究的重要靶标。通过PCR技术扩增Sip基因,将其插入pET-22b载体构建重组质粒pET-22b-Sip,并对重组质粒进行双酶切、PCR鉴定及测序;转入BL21(DE3)中诱导表达,检测重组蛋白的大小及反应原性。结果表明,所扩增Sip基因大小为1 300bp,与GeneBank参考序列同源性为99.16%;蛋白分析表明,目的蛋白大小为50KDa,具有良好的反应原性,为无乳链球菌的免疫预防提供依据和基础。     

重组人α-半乳糖苷酶A在巴氏毕赤酵母中的表达及鉴定

目的：克隆人α-半乳糖苷酶A（α-GalA）cDNA，并在毕赤酵母中表达重组的人α-GalA。方法：利用RT-PCR方法从人肝癌细胞中克隆人α-半乳糖苷酶AcDNA并构建到可用甲醇诱导的分泌型巴氏毕赤酵母表达载体pPICZαA中。将重组质粒导入毕赤酵母并用Zeion抗生素筛选转化细胞。在甲醇诱导后。利用SDS-PAGE、Western印迹及酶活测定方法在酵母上清中鉴定重组的人α-GalA。结果：获得人α-GalA cDNA，构建酵母表达质粒pHGCZα-A，将重组表达载体导入到酵母细胞，并在上清中检测到人α-GalA蛋白。结论：获得了人α-GalA cDNA及具有生物活性的重组人α-GalA，为临床应用于法布莱氏病的治疗奠定了基础。     

HDAC1对ERα和ERβ蛋白水平的调控

目的：构建带编码HA标签的hdac1基因真核表达载体，研究组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）对雌激素受体α和β（ERα和ERβ）蛋白水平的影响。方法：用提取的RNA产物进行逆转录合成cDNA，利用PCR技术扩增出hdac1基因完整编码区序列，通过DNA重组技术构建含编码hdac1 DNA片段的真核表达载体pcDNA3-HA—hdac1；利用GST沉降（pull-down）实验观察HDAC1是否能特异结合ERα或ERβ；又将pcDNA3—HA—hdac1重组质粒分别和ERα表达载体或ERβ表达载体质粒共转染293T细胞，观察HDAC1对ERα和ERβ蛋白水平的影响。结果：转染pcDNA3—HA—hdac1重组质粒的哺乳动物细胞表达了与预期相对分子质量大小一致的HDAC1蛋白；GST沉降实验表明，HDAC1蛋白与ERα和ERβ均结合；共转染实验观察到HDAC1可使ERα蛋白水平降低，而对ERβ没有影响。结论：HDAC1与ERα和ERβ均结合，但其对ERs的作用具有亚型特异性，ERα和ERβ蛋白水平可能受不同类型的组蛋白去乙酰化酶（HDACs）的调控。     

肠出血性大肠杆菌紧密黏附素保护性多肽的表达与免疫原性分析

目的:在基因工程菌中实现肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶ H7紧密黏附素(intimin)保护性片段(Int281)的高效表达,并进行抗原性的初步分析.方法:应用PCR从EHEC O157∶ H7基因组中钓取int281基因,插入pMD18-T克隆载体.克隆质粒测序鉴定后,采用NdeⅠ、NotⅠ限制性核酸内切酶双酶切pMD18-T-int281质粒获得int281基因,连接同样经过双酶切的pET-22b( ).表达质粒测序鉴定后转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测相对分子质量和Western 印迹验证免疫学活性后,重组Int281蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA检测鼠血清抗体效价.结果:PCR扩增得到843 bp的目的片段.构建的原核表达质粒pET-22b( )-int281经酶切鉴定及测序与预期序列一致.目的蛋白以包涵体形式表达,表达量约25%.变性复性后经镍柱纯化后纯度达95%以上.免疫印迹检测显示,重组Int281片段可以特异性地识别抗O157∶ H7多抗.免疫小鼠抗体效价达1∶ 106.结论:重组Int281具有良好的免疫原性,为制备相应的抗体及研究其对EHEC O157∶ H7黏附定植的被动保护效果奠定了基础.     

HBV全基因核心蛋白变异株稳定表达载体的构建及其抗原表达

通过定点突变技术将HBV质粒p3．8Ⅱ构建成核心蛋白变异株V60和L97。经序列测定和生物学活性检测后，亚克隆入EB病毒稳定表达载体。重组载体分别作内切酶酶切鉴定和序列测定证实，用脂质体介导转染HepG2细胞稳定传代，定量测定各株培养上清HBV抗原表达。结果发现，3株HBsAg含量S／N值接近，变异株HBeAg含量S／CO值低于野生株。上述3种重组载体的构建可为体外研究HBV核心蛋白热点变异与致病的关系提供基础。