血管紧张素Ⅱ受体1反义核酸抑制血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞心钠素合成

目的:探讨血管紧张素Ⅱ受体1反义寡核苷酸(AT1-AS-ODNs)对血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞心钠素合成的生物学效应。方法:实验于2004-07/2005-07在武汉大学人民医院心血管国家重点实验室进行。体外培养乳鼠心肌细胞,将其分为4组:①对照组:无血清Opti-MEM培养48h。②血管紧张素Ⅱ组:无血清Opti-MEM培养24h 10-6mol/L血管紧张素Ⅱ刺激24h。③AT1-AS-ODNs组:200nmol/LAT1-AS-ODNs孵育24h 10-6mol/L血管紧张素Ⅱ刺激24h。④顺义序列组:200nmol/LAT1-S-ODNs孵育24h 10-6mol/L血管紧张素Ⅱ刺激24h。显微荧光技术检测脂质体包裹的AT1-AS-ODNs在心肌细胞内分布;免疫沉淀法检测血管紧张素Ⅱ受体1,2蛋白表达水平;放射性免疫法检测心钠素(ANF)表达。结果:①在脂质体的包裹下,AT1-AS-ODNs成功转染心肌细胞,120min转染效率为60%。②血管紧张素Ⅱ组血管紧张素Ⅱ受体1,2蛋白表达水平较对照组低25%,21%(P<0.05),AT1R-AS-ODNs组血管紧张素Ⅱ受体1蛋白表达水平下调60.7%(P<0.01),血管紧张素Ⅱ受体2蛋白表达水平无改变。③血管紧张素Ⅱ组心钠素表达明显高于对照组[(780±38),(430±23)μg/L,P<0.01]。AT1-AS-ODNs组心钠素表达为(589±19)μg/L,明显低于血管紧张素Ⅱ组(P<0.01),顺义序列组与对照组相比差异不显著(P>0.05)。结论:AT1-AS-ODNs可成功转染心肌细胞,通过特异性抑制血管紧张素Ⅱ受体1蛋白表达,拮抗血管紧张素Ⅱ的生物学效应。     

血管紧张素Ⅱ对人脐血内皮祖细胞促血管新生因子HIF1a和VEGF基因表达的影响

目的:研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对内皮祖细胞(EPC)促血管新生主要因子HIFla、VEGF基因表达的影响以及AT1受体阻滞剂的干预效果.方法:分离人脐血单个核细胞,在VEGF和bFGF存在条件下培养7～8 d得到EPC;随机分对照组、AngⅡ组(10-6mol·L-1),AngⅡ 氯沙坦预处理组.半定量RT-PCR检测EPC内血管紧张素原(ATG)mRNA表达情况;血管紧张素受体AT1、AT2以及HIFla、VEGF mRNA表达水平.结果:人脐血EPC表达AT1受体、AT2受体,不表达ATG.外源性AngⅡ作用后,EPC的AT1受体、AT2受体mRNA表达量较对照组显著增加(P<0.05);HIFla、VEGF mRNA表达量较对照组显著降低(P<0.05).用氯沙坦预处理细胞后再用AngⅡ刺激,与单纯AngⅡ刺激组比较,HIFla、VEGF mRNA表达明显增加.结论:RT-PCR结果显示,人脐血来源的EPC不表达血管紧张素原基因,因而不能产生内源性AngⅡ;外源性AngⅡ通过AT1/AT2受体下调EPC的促血管新生主要因子HIFla和VEGF的表达,但详细机制尚需进一步研究.     

血管紧张素Ⅱ2型受体基因可调控表达对体外培养血管平滑肌细胞中P21表达的影响

目的:利用多西环素开放(Dox-on)可调控哺乳动物表达系统将AT2R基因引入体外培养的血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells,VSMC),并经两次抗生素的筛选建立起了受四环素类似物多西环素(Doxycicline,Dox)紧密调控、表达血管紧张素Ⅱ2型受体(angiotensinⅡsubtype2receptors,AT2R)基因的双重稳定VSMC细胞系,在此基础上对细胞周期素激酶抑制蛋白-P21的表达受AngⅡ及其受体拮抗剂的影响进行研究。方法:通过常规分子生物学方法,建立Dox可调控表达AT2R基因的双重稳定大鼠VSMC细胞系。将该VSMC细胞系随机分为8组:①未转染对照组。②未转染+血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)组。③转染组。④转染+AngⅡ组。⑤转染+AngⅡ+Dox组。⑥转染+AngⅡ+Dox+CV-11974组。⑦转染+AngⅡ+Dox+PD123319组。⑧转染+AngⅡ+Dox+CV-11974+PD123319组。应用RT-PCR和免疫细胞化学染色技术,观察该双重稳定表达AT2R的VSMC细胞系中p21的mRNA及蛋白表达情况;采用AngⅡ及其1,2型其受体拮抗剂干预上述细胞,观测上述指标的变化。结果:加入Dox前转染组p21表达处于高水平,其mRNA及蛋白表达强度分别为118.363±19.225,0.196±0.013;AngⅡ1×10-7moL/L干预VSMC后p21mRNA及蛋白表达强度均显著降低,分别为51.761±4.429,0.032±0.014(t=13.10,     

血管紧张素Ⅱ受体1反义核酸抑制血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞心钠素合成

目的：探讨血管紧张素Ⅱ受体1反义寡核苷酸（AT1-AS-ODNs）对血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞心钠素合成的生物学效应。 方法：实验于2004-07／2005-07在武汉大学人民医院心血管国家重点实验室进行。体外培养乳鼠心肌细胞，将其分为4组：①对照组：无血清Opti—MEM培养48h。②血管紧张素Ⅱ组：无血清Opti-MEM培养24h＋10^-6mol／L血管紧张素Ⅱ刺激24h。③AT1-AS-ODNs组：200nmol／LAT1-AS-ODNs孵育24h＋10^-6mol／L血管紧张素Ⅱ刺激24h。④顺义序列组：200nmoL／LAT1-S-ODNs孵育24h＋10^-6mol／L血管紧张素Ⅱ刺激24h。显微荧光技术检测脂质体包裹的AT1-AS-ODNs在心肌细胞内分布；免疫沉淀法检测血管紧张素Ⅱ受体1，2蛋白表达水平；放射性免疫法检测心钠素（ANF）表达。 结果：①在脂质体的包裹下，AT1-AS-ODNs成功转染心肌细胞。120min转染效率为60％。②血管紧张素Ⅱ组血管紧张素Ⅱ受体1，2蛋白表达水平较对照组低25％，21％（P〈0．05），AT1R-AS—ODNs组血管紧张素Ⅱ受体1蛋白表达水平下调60．7％（P〈0．01）。血管紧张素Ⅱ受体2蛋白表达水平无改变。③血管紧张素Ⅱ组心钠素表达明显高于对照组[（780&;#177;38），（430&;#177;23）μg／L,P〈0．01]。AT1-AS-ODNs组心钠素表达为（589&;#177;19）μg/L，明显低于血管紧张素Ⅱ组（P〈0．01），顺义序列组与对照组相比差异不显著（P〉0.05）。 结论：AT．-AS-ODNs可成功转染心肌细胞，通过特异性抑制血管紧张素Ⅱ受体1蛋白表达，拮抗血管紧张素Ⅱ的生物学效应。     

血管平滑肌细胞功能调节中血管紧张素1型受体表达和生物学作用的变化

目的:探讨血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell,VSMC)转染表达血管紧张素II(angiotensinII,AngII)2型受体(angiotensinIItype2receptor,AT2R)后其1型受体(angiotensinIItype1receptor,AT1R)表达所受的影响。方法:用同源重组方法构建带AT2R基因的重组复制缺陷型腺病毒载体(AdCMV-AT2R),体外转染VSMC,分别用流式细胞仪检测AT1R、AT2R细胞转染表达率、用免疫组织化学法和免疫荧光法检测其膜表达、以反转录聚合酶链式反应法(RT-PCR)和蛋白印迹法检测其mRNA和蛋白表达。结果:AdCMV-AT2R转染后,随着转染表达时间延长,AT2R细胞表达率呈显著增加趋势,48h最高表达率达89.51%,AngII作用与否及不同浓度AngII作用对AT2R表达无显著影响。而转染前后AT1R表达相对较稳定,受不同浓度AngII作用,其表达明显呈增加趋势。AT2R峰值表达时,免疫组织化学法和免疫荧光法检测其膜表达结果也提示AT2R表达随转染表达时间延长显著增加,转染前后AT1R表达无明显变化,在一定浓度范围内,AngII刺激对AT2R表达无显著影响,却显著增加AT1R的膜表达。RT-PCR法和蛋白印迹法检测AT1R和AT2R的mRNA和蛋白表达结果与其细胞表达率和膜表达的检测结果相一致。结论:AT2R转染表达并发挥其生物学作用时,对AT1R的表达无明显影响,VSMC转染表达AT2R后,     

血管紧张素Ⅱ及其受体1在断端正常鳞状上皮及食管鳞癌中的表达及其差异

目的:观察食管断端正常鳞状上皮与鳞癌组织中血管紧张素Ⅱ及血管紧张素Ⅱ受体1的表达。方法:实验于2005-07/10在河南省肿瘤重点实验室完成。采用免疫组织化学SP法检测49例食管断端正常鳞状上皮及53例食管鳞癌组织中血管紧张素Ⅱ及血管紧张素Ⅱ受体1的表达。在高倍镜下选取阳性细胞最多的区域,记录5个高倍视野中血管紧张素Ⅱ、血管紧张素Ⅱ受体1阳性细胞的百分比,计算其平均值。阳性细胞<10%为穴-雪;10%～30%为穴 雪;30%～50%为穴誒雪;>50%为穴誔雪。结果:血管紧张素Ⅱ和血管紧张素Ⅱ受体1定位于胞浆和胞膜。血管紧张素Ⅱ主要为弥漫性表达,在正常鳞状上皮和鳞癌组织中的阳性表达率分别是51.02%(25/49)和86.79%(46/53)。血管紧张素Ⅱ受体1在46.94%(23/49)的正常鳞状上皮的扁平细胞层和棘层细胞表达,在77.36%(41/53)的鳞癌组织中主要呈弥漫性表达,部分癌巢可见“阴性外围”表达模式。血管紧张素Ⅱ、血管紧张素Ⅱ受体1在鳞癌组织中的表达均显著高于正常鳞状上皮穴均P<0.01雪。血管紧张素Ⅱ在各级鳞癌组织中的表达差异无显著性穴P>0.05雪;血管紧张素Ⅱ受体1在I级鳞癌组织中的表达显著高于Ⅱ、Ⅲ级鳞癌组织穴分别P<0.05,P<0.01雪,在Ⅱ、Ⅲ级鳞癌组织中的表达差异无显著性穴P>0.05雪。血管紧张素Ⅱ、血管紧张素Ⅱ受体1在鳞癌侵及食管深层和浅层、有淋巴结转移和无淋巴结转移的表达差异均无显著性(P>0.05)。结论:血管紧张素Ⅱ受体1可能与食管鳞癌的分化有关,血管紧张素Ⅱ及其血管紧张素Ⅱ受体1可能参与食管鳞癌的发生发展,但与食管鳞癌的浸润和淋巴结转移无明显关系。     

血管紧张素-(1-7) 对高血压大鼠血管紧张素Ⅱ及其受体的影响

目的观察血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]对二肾一夹(2K1C)高血压大鼠血浆及肾组织血管紧张素Ⅱ及其受体的影响.方法采用微渗泵植入技术,建立Ang-(1-7)对高血压大鼠干预模型,放免法测定血浆及肾组织血管紧张素Ⅱ(AⅡ)浓度,RT-PCR检测肾组织内血管紧张素Ⅱ 1型受体(AT1)和2型受体(AT2)mRNA水平.结果 Ang-(1-7)减轻2K1C高血压大鼠肾脏病理损害,Ang-(1-7)对血浆及肾组织AⅡ浓度无显著影响,对肾组织内AT2受体表达无显著影响,减少肾组织内AT1受体表达.结论 Ang-(1-7) 对2K1C高血压大鼠肾损害具有保护作用,其机制之一是通过减少肾组织内AT1受体而实现.     

血管紧张素Ⅱ2型受体基因可调控表达对体外培养血管平滑肌细胞中P21表达的影响

目的：利用多西环素开放(Dox-on)可调控哺乳动物表达系统将AT2R基因引入体外培养的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)，并经两次抗生素的筛选建立起了受四环素类似物多西环素(Doxycicline，Dox)紧密调控、表达血管紧张素Ⅱ2型受体(angiotensin Ⅱ subtype 2 receptors，AT2R)基因的双重稳定VSMC细胞系，在此基础上对细胞周期素激酶抑制蛋白-P21的表达受AngⅡ及其受体拮抗剂的影响进行研究。方法：通过常规分子生物学方法，建立Dox可调控表达AT2R基因的双重稳定大鼠VSMC细胞系。将该VSMC细胞系随机分为8组：①未转染对照组。②未转染+血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)组。③转染组。④转染+AngⅡ组。⑤转染+AngⅡ+Dox组。⑥转染+AngⅡ+Dox+CV-11974组。⑦转染+AngⅡ+Dox+PD123319组。⑧转染+AngⅡ+Dox+CV-11974+PD123319组。应用RT-PCR和免疫细胞化学染色技术，观察该双重稳定表达AT2R的VSMC细胞系中p21的mRNA及蛋白表达情况；采用AngⅡ及其1，2型其受体拮抗剂干预上述细胞，观测上述指标的变化。结果：加入Dox前转染组p21表达处于高水平，其mRNA及蛋白表达强度分别为118．363&;#177;19．225，0．196&;#177;0．013；AngⅡ1&;#215;10^-7moL／L干预VSMC后p21mRNA及蛋白表达强度均显著降低，分别为51．761&;#177;4．429，0．032&;#177;0．014(t=13．10，10．41，P&;lt;0．01)；在AngⅡ1&;#215;10^-7moL／L干预的同时加入Dox后，p21呈现较强表达，其mRNA及蛋白表达强度明显高于转染+AngⅡ组(t=13．76，13．53，P&;lt;0．01)；CV-11974可进一步增强p21的表达，其中p21mRNA及蛋白表达强度明显高于转染+AngⅡ组(t=9．81，34．90，P&;lt;0．01)；PD123319干预组p21表达则处于低水平，与转染+AngⅡ组比较，差异无显著性意义(P&;gt;0．05)。结论：AngⅡ干预降低VSMC中p21表达水平，这一作用是通过AT1R介导的；经Dox诱导表达AT2R基因可以明显抑制这一生物学作用，说明在这一生物学效应上，AT2R具有与AT1R相拮抗的生物学功能。AT2R基因经诱导后表达可以参与VSMC细胞周期进展的有效调控。     

血管紧张素Ⅱ对人α1(Ⅰ)胶原基因启动子与活性的影响

目的探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对人皮肤成纤维细胞增殖活性及人α1(Ⅰ)原胶原基因启动调控序列的作用。方法用组织块法原代培养人皮肤成纤维细胞并进行传代培养作为本研究的模型细胞。①采用四甲基偶氮唑盐(MTT)掺入法测定经不同浓度血管紧张素Ⅱ处理24 h后成纤维细胞的增殖情况。②构建含长短不一的人α1(Ⅰ)原胶原基因5'侧翼区序列与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的重组体pCOLH11.5、pCOLH12.5,用FUGENE 6将重组体转染至人皮肤成纤维细胞,ELISA法测定不同浓度血管紧张素Ⅱ作用24 h后,转染有重组体的成纤维细胞的CAT表达量。结果①在1×10-9~1×10-5mol/L血管紧张素Ⅱ处理24 h后,各浓度组成纤维细胞增殖值与对照组之间不存在剂量依赖关系(P>0.05)。②2种重组体转染成纤维细胞,并经血管紧张素Ⅱ处理24 h后,转染细胞的CAT相对表达量测定:pCOLH12.5组与对照组之间,较高浓度组(1×10-5mol/L)与较低浓度组(10×10-6mol/L)之间存在显著差异(P<0.05),且存在剂量依赖关系,pCOLH11.5组与对照组之间不存在明显差异(P>0.05)。结论血管紧张素Ⅱ在1×10-9~1×10-5mol/L浓度范围内,对所研究的模型细胞———人皮肤成纤维细胞增殖不存在剂量依赖关系。血管紧张素Ⅱ对胶原基因启动序列pCOLH12.5具有正性调控作用,并存在剂量依赖关系。     

血管紧张素-(1-7)对乳鼠心肌细胞缺血再灌注损伤的影响

目的:探讨血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]对心肌细胞缺血再灌注损伤(I/R)的影响及其可能机制。方法:提取乳鼠原代细胞,按缺氧4 h后再灌注2 h的条件建立I/R模型。提前20 min加入10-8、10-7、10-6、10-5mmol/l的Ang-(1-7)作为预处理,并随机分为对照组、I/R组、Ang-(1-7)组、替米沙坦组、血管紧张素Ⅱ组、Ang-(1-7)+替米沙坦组及Ang-(1-7)+血管紧张素Ⅱ组,使用CCK-8法检测心肌细胞存活率。结果:10-5mmol/L浓度的Ang-(1-7)的预处理能让细胞存活率提高到77.65%。与I/R组相比,Ang-(1-7)组、Ang-(1-7)+替米沙坦组及Ang-(1-7)+血管紧张素Ⅱ组心肌细胞存活率均显著提高,但各组间均无明显差异。结论 :Ang-(1-7)减少心肌细胞在I/R中的损伤,但该保护机制与血管紧张素受体Ⅱ无关。