miRNA-125a Taqman实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的 建立一种用于肝癌早期诊断和监测的血清miRNA-125a Taqman实时荧光定量PCR检测方法。方法 采用Trizol法提取肝癌患者血清中总RNA,以肝癌发生具有代表性的miRNA-125a基因为检测序列,分别设计逆转录引物、扩增引物和Taqman探针; 构建和制备miRNA-125a重组质粒标准品,建立血清miRNA-125a Taqman 实时荧光定量PCR检测方法。结果 成功构建了miRNA-125a重组质粒载体,制备了miRNA-125a重组质粒标准品,建立了血清miRNA-125a Taqman实时荧光定量PCR扩增体系。经实验验证,所设计引物具有较好的特异性,引物的最低检测限为78.125 copies/μl; 对17例肝癌患者血清miRNA-125a的检测结果在(1.45×10²～3.52×10⁵)copies/μl之间。结论 血清miRNA-125a Taqman实时荧光定量PCR检测方法的建立,为原发性肝癌早期诊断和监测提供一种新的分子诊断定量方法。     

肺炎衣原体Taqman探针实时荧光定量PCR检测法

目的针对Cpn0308基因建立检测肺炎衣原体的Taqman探针实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法。方法根据肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308基因序列设计引物和Taqman探针,建立Taqman FQ-PCR检测体系,对反应体系进行优化,进行灵敏度、特异性、重复性评价;并与商品化肺炎衣原体核酸检测试剂盒检测临床标本进行对比分析。结果肺炎衣原体Taqman FQ-PCR方法的引物浓度300 nmol/L,探针浓度200 nmol/L,Mg~(2+)4.0 mmol/L为最优反应条件;灵敏度为8.36×102copies/μL;该法对常见几种呼吸道病原菌及沙眼衣原体无交叉反应;重复性试验中4个浓度变异系数均小于3%。自建方法与商品化试剂盒对呼吸道感染组、心血管疾病组及正常对照组标本检出率分别为10%vs 10%(χ~2=0.167,P0.05),44.44%vs 40.74%(χ~2=0,P0.05),6.67%vs 3.33%(χ~2=0,P0.05),各组阳性率间差异无统计学意义;2种方法的总阳性率(16.54%vs 14.96%)比较差异无统计学意义(χ~2=0.071,P0.05)。结论本研究建立的Taqman探针实时荧光定量PCR检测肺炎衣原体的方法灵敏度好,特异性高,重复性好,可应用于临床肺炎衣原体核酸检测。     

登革病毒TaqManMGB实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立登革病毒TaqMan实时荧光定量PCR快速检测方法及应用于临床。方法根据1～4型登革病毒3’端非编码区的一段高度保守序列,设计一套型通用的引物和TaqManMGB探针,以4个血清型登革病毒标准株为标准,以日本乙脑病毒和丙肝病毒作阴性对照,以包含登革病毒2型标准株（DENV-2NGC株）3’非编码区349bD片段的质粒DNA作标准品,对引物和TaqManMGB探针的特异性、灵敏度进行分析,从而建立登革病毒实时荧光定量PCR检测方法。用该法对登革病毒野毒株和10份登革病毒患者血清进行检测。结果TaqMan实时荧光定量PCR检测的1～4型登革病毒标准株及野毒株均为阳性,日本乙脑病毒和丙肝病毒均为阴性;检测灵敏度可达到每反应2个基因拷贝;检测的10份登革患者血清样本中,8份检测结果为阳性。结论TaqManMGB实时荧光定量PCR方法是一个快速、特异性强、敏感性高的检测登革病毒的方法,适用于登革病毒的临床早期诊断。     

TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR法检测幽门螺杆菌

目的建立TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测幽门螺杆菌(HP)的方法。方法针对HP cagA基因设计特异性引物和探针,建立TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的特异性、灵敏度和重复性。用该法对肝癌、肝硬化患者腹水及全血,猪、金黄地鼠、猴、犬、兔、豚鼠、大鼠、小鼠的全血、粪便、肠共1 201份标本进行检测,同时作常规细菌分离和测序分析。结果本方法特异性为100%,最低可检测2.2×101copies/μL的质粒DNA。标准曲线表明其具有良好线性关系,回归方程为:Y=-3.306X+38.633,相关系数(r)为0.999,扩增效率为100.648%。批内相对标准偏差(RSD)为0.19%～1.2%,批间RSD为0.14%～3.4%,RSD均<5%。上述1 201份标本用本法检出HP阳性130份,常规细菌分离法仅检出2份HP阳性。测序结果表明,与GenBank中收录的HP序列同源性为99%～100%。结论建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR法特异性和灵敏度高,重复性良好,适用于HP感染的检测。     

TaqMan实时定量RT—PCR与常规RT—PCR检测登革病毒的比较

目的:比较TaqMan实时定量逆转录-聚合酶链反应(real-timeRT-PCR)法与常规逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测登革病毒的敏感性、特异性和时效性。方法:建立TaqMan实时定量RT-PCR方法和常规RT-PCR方法,分别对登革病毒、乙型脑炎病毒及西尼罗病毒进行检测,并比较两法的特异性、敏感性和时效性。结果:两种方法都能检测出登革病毒,而对乙型脑炎病毒和西尼罗病毒的检测呈阴性;常规RT-PCR的敏感性为0.1TCID50/mL,TaqMan实时定量RT-PCR的敏感性提高了100倍,达到了0.001TCID50/mL,且至少节约了2h。结论:与常规RT-PCR比较,TaqMan实时定量RT-PCR更适用于登革病毒的实验室快速诊断。     

荧光实时定量PCR检测端粒长度

目的 应用定量聚合酶链反应(PCR)方法测量端粒长度.方法 随机选取63例健康人外周血样本,采用定量PCR方法测量端粒长度相对T/S比率、DNA印迹法测定端粒限制性片段(TRF)长度并进行相关性分析.结果 定量PCR测量端粒长度相对T/S比率为0.76±0.27,DNA印迹法测量平均TRF值为9.20±1.12,两种方法测量的结果 相关性分析R2=0.575,P＜0.01.结果 采用定量PCR方法测量端粒长度具有重复性好、省时、简便、可靠,可高通量的处理大量样品的特点,端粒的长短同癌症的发生有密切联系.本方法值得推广应用于癌症的遗传学和分子流行病学研究.     

实时荧光PCR技术在手足口病检测中应用

目的:探讨实时荧光PCR技术检测手足口病肠道病毒的价值.方法:建立手足口病的实时荧光PCR检测技术平台,检测茂名地区手足口病患者243份标本中人肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型特异性核酸,再将标本送广东省疾病预防控制中心进行复检.结果:243份标本中肠道病毒通用型核酸阳性27份,柯萨奇A16核酸阳性16份,肠遘71型病毒核酸阳性17份,与广东省疾病预防控制中心复检结果一致,符合率100%.结论:实时荧光PCR检测技术平台具有特异性强、灵敏度高等优点,是一种手足口病肠道病毒的快速检测方法.     

用多重PCR快速检测登革病毒并分型

目的 建立一种多重聚合酶链反应(PCR)方法，对不同型别登革病毒进行快速检测及分型。方法 采用4种型别登革病毒通用的外侧引物进行逆转录PCR(RT—PCR)反应，继用4对(5种)型特异引物在单管内进行巢式PCR，依据扩增产物的片段大小进行分型。结果 采用多重PCR，扩增出482、119、290及392bp的特异片段，分别代表登革病毒1～4型。结论 该方法快速、敏感、特异，有一定的推广应用价值。     

实时荧光定量PCR技术运用于肝癌患者基因检测

目的探讨实时荧光定量PCR SYBR Green I探针技术在研究肝癌患者中基因表达情况的可行性。方法运用实时荧光定量PCR SYBR Green I技术,检测肝癌患者癌组织及癌旁组织RAP1GAP基因表达情况。结果实验组和对照组有明显的统计学差异。结论Real-time PCR技术检测目的基因的表达是非常方便快捷准确的方法。     

实时荧光PCR检测乙型肝炎患者HBV-DNA的临床意义

目的对应用实时荧光聚合酶链反应(PCR)检测的乙型肝炎(乙肝)病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)结果进行分析,探讨该检测方法的临床意义。方法选择2009年6月至2011年5月门诊及住院的乙肝患者430例,抽取430份血清标本,应用酶联免疫吸附测定(ELISA)法进行血清学标志物检测(HBV-M),并按照乙肝两对半定性结果分为6组,用实时荧光PCR进行HBV-DNA检测。结果绝大部分乙肝患者实时荧光PCR检测HBV-DNA的结果与HBV-M检测的结果一致。其中大三阳组和小三阳组PCR检测HBV-DNA阳性结果多,拷贝数较高,HBsAb(乙肝表面抗体)(+)或HBsAg(乙肝表面抗原)(-)的血清标本PCR检测HBV-DNA阳性结果很少,拷贝数也较低。结论实时荧光PCR检测HBV-DNA,能够正确反映乙肝患者体内乙肝病毒感染和复制情况,有利于指导临床治疗和进行疗效判断。     

一步法实时荧光RT-PCR在快速检测甲型流感病毒中的应用

目的建立一种能快速检测甲型流感病毒的一步法实时荧光PCR方法,对样本进行准确检测。方法以甲型流感病毒特异M基因的保守区为靶区域设计特异引物和TaqMan荧光探针,建立一步法实时荧光RT-PCR方法,并对乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒Long株、冠状病毒OC43及229E、副流感病毒1、2、3型以及季节性流感病毒H1、H3进行检测,验证该方法的特异性和灵敏度,并对临床样本进行检测应用。结果所建立的一步法实时荧光RT-PCR可对甲型流感病毒进行特异扩增,操作方便快速,对H1和H3亚型的最低检出限可达0.01TCID50/ml;对384例临床咽拭子样本的检测准确度达99.5%。结论本研究建立的一步法实时荧光RT-PCR方法可实现对甲型流感病毒快速准确的检测,有助于对临床流感病例的快速诊断。     

乙型肝炎病毒核酸的实时荧光定量PCR检测及其临床意义

目的建立实时荧光定量PCR(rea l-tim e fluorescence quan titative PCR,RFQ-PCR)检测HBV-DNA含量的方法,探讨其在乙型肝炎预防、诊断、治疗及判断病情等方面的临床应用价值。方法在HBV S基因高保守区设计了特异性的引物和探针,利用T aqM an探针的基本原理,PCR扩增目的片段并实时检测产物的荧光强度,根据标准品建立的标准曲线,由软件自动计算出待测样本中HBV-DNA的准确含量。结果220例临床样本的检测结果显示,乙肝大三阳患者HBV-DNA阳性率(98.8%)显著高于其它各组(P<0.01),病毒平均含量为7.52±0.43 cop ies/m l;小三阳患者HBV-DNA阳性率低于大三阳组(P<0.01),但平均病毒含量与大三阳组无差异(P>0.05),高达7.41±0.26 cop ies/m l;单独HB sA g阳性和单独HB sA b阳性组HBV-DNA阳性率分别为56.4%,19.2%,平均病毒含量分别为5.35±0.32 cop ies/m l,4.02±0.31 cop ies/m l;80例献血员血清仍有3例HBV-DNA阳性,其病毒含量低于其它各组。结论RFQ-PCR检测HBV-DNA含量比EL ISA法具有更好的灵敏度和特异性,能准确反映HBV在体内的复制情况,对临床上抗病毒药物的选择和判断疾病的预后意义重大。     

荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒的临床研究

目的 :建立荧光定量PCR检测HBV DNA的方法 ,探讨荧光定量PCR在乙型肝炎病毒检测方面的临床价值。方法 :采用荧光定量PCR技术 ,对不同类型乙型肝炎患者及无症状健康者血清HBV DNA进行定量检测。对30例慢性乙型肝炎拉米夫啶治疗前后血清HBV DNA含量进行定量监测。结果 :(1)血清HBV DNA的检出率与HBeAg阳性率呈正相关 ,无症状健康者仍有 3%的检出率。 (2 )慢性乙型肝炎和乙肝后肝硬化的血清HBV DNA含量明显高于无症状HBV感染者和急性乙型肝炎 (P <0 .0 1)。 (3) 30例慢性乙型肝炎 ,经拉米夫啶治疗 12个月 ,HBV DNA阴转率为 73.3% (2 2 / 30 ) ,明显高于HBeAg阴转率 (46 .2 % ) (P <0 .0 5 )。结论 :荧光定量PCR检测HBV DNA ,能直接反映血清HBV DNA含量 ,在判断体内HBV是否复制、复制的程度 ,HBV是否被清除以及HBV血清标志阴性肝炎的诊断等方面明显优于HBV血清标志物检测。荧光定量PCR检测HBV DNA是抗病毒治疗选择和考核抗病毒疗效的最直接最可靠的指标 ,具有重要的临床价值 ,值得推广应用     

实时定量PCR检测血液恶性肿瘤的微小残留病

实时定量PCR(RQ-PCR)是近年出现的一种新的核酸定量技术,将常规PCR与探针杂交技术融为一体.在PCR反应体系中加入荧光探针,该探针与靶DNA/cDNA特异性结合.PCR反应延伸阶段,Taq酶发挥其5'→3'外切酶活性将荧光探针切断,荧光信号得以释放,荧光信号强度与PCR产物成正比.因此,通过实时监测PCR过程中荧光信号的变化,可以在一个密闭体系中对待测标本进行精确定量分析.RQ-PCR成功地解决了常规PCR不能定量、扩增产物污染而导致假阳性、需进行PCR后处理等问题,为检测血液系肿瘤微小残留病提供了快速、简便、精确、敏感、可靠的工具.本文阐述了RQ-PCR的基本原理以及在血液系统恶性肿瘤,如急性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病和恶性淋巴瘤微小残留病检测中的应用.     

实时荧光定量PCR检测人粪便中空肠弯曲杆菌方法的建立与评价

目的：建立一种快速检测人粪便样本中空肠弯曲杆菌的实时荧光定量 PCR方法。方法根据空肠弯曲杆菌保守序列设计特异引物,建立空肠弯曲杆菌的实时荧光定量 PCR检测法。对该方法的线性范围、抗干扰能力进行考察。同时采用培养法和实时荧光定量 PCR法对150例粪便样本进行检测,以培养法检测结果作为参照标准,对实时荧光定量 PCR方法的灵敏度、特异度、准确度和重复性进行考察。采用 Kappa检验对两种检测方法的结果进行统计学分析。结果建立的实时荧光定量PCR方法标准曲线线性关系良好Y＝-3.51 Log（X）＋37.09,相关系数为0.996,理论检测下限为102 CFU/ml。抗干扰能力强,仅空肠弯曲杆菌出现特异性扩增曲线。与培养法相比,其灵敏度、特异度、准确度分别为92.4％,95.8％和94％;检测结果重复性良好（CV％＜5％）。统计学分析显示两种方法检测结果具有一致性,且一致性强度为极强（Kappa＝0.88,P＜0.05）。结论实时荧光定量PCR法能准确快速检测粪便样品中的空肠弯曲杆菌。     

乙型肝炎病毒 DNA定值冻干血清用于荧光定量聚合酶链反应测定的研究

目的 研究冻干的定值系列血清及其在乙型肝炎病毒脱氧核糖核苷酸(HBV DNA)荧光定量聚合酶链反应测定中的应用价值。方法 制备系列冻干血清,用罗氏的内标定量方法进行定量。将定量系列血清和106拷贝/ml的样本寄发给不同试剂厂家,令其按要求稀释并检测。将定值系列血清的罗氏定量结果与各试剂检测的CT值做标准曲线,比较其定值结果与试剂盒中工作标准曲线的定值结果。结果 采用冻干定值系列血清作为荧光定量试剂盒定量测定的标准,标准曲线的线性回归系数均小于-0.99,斜率和截距与原试剂标准相近,使用该标准系列各试剂的检测结果间的变异(CV)大大降低。结论 该冻干定值系列血清可有效地用于临床HBV DNA的定量测定。     

COBAS Taqman HBV DNA的方法学验证

目的 评估COBAS Taqman HBV DNA分析系统的性能及临床应用.方法 依据美国国家临床实验室标准化委更会(NCCLS)制订的临床化学方法评价方案(evaluation protocols),通过精密度、携带率、线性评价、仪器同比对、参考范围确认等试验,对COBAS Taqman HBVDNA分析系统的性能参数进行了评估.结果 COBAS Taqman分析系统批内变异6.9%～8.6%,批间变异10.5%～18.7%,总变异10.8%～20.2%,线性范围6.0～101 IU/ml,回收率98.7%～104.5%.仪器间比对相关性较好(r2=0.998).结论 COBAS Taqman HBV DNA分析系统性能指标符合要求,操作简便、快捷,动力学范围广,是目前理想的HBV DNA检测方法.通过此次验证,建立了一套简便的核酸检测方法学评价方案,有利于临床实验室标准化操作的实施.     

COBAS Taqman HBVDNA的方法学验证

目的 评估COBAS Taqman HBV DNA分析系统的性能及临床应用。方法依据美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）制订的临床化学方法评价方案（evaluation protocols），通过精密度、携带率、线性评价、仪器间比对、参考范围确认等试验，对COBAS Taqman HBV DNA分析系统的性能参数进行了评估。结果COBAS Taqman分析系统批内变异6．9％～8．6％，批间变异10．5％～18．7％，总变异10．8％～20．2％，线性范围6．0～10^7IU／ml，回收率98．7％～104．5％。仪器间比对相关性较好（r^2=0．998）。结论COBAS Taqman HBV DNA分析系统性能指标符合要求，操作简便、快捷，动力学范围广，是目前理想的HBV DNA检测方法。通过此次验证，建立了一套简便的核酸检测方法学评价方案，有利于临床实验室标准化操作的实施。     

Clinical applicability of single-tube multiplex reverse-transcriptase PCR in dengue virus diagnosis and serotyping

This study has evaluated the clinical applicability of a single-tube multiplex RT-PCR as compared with a two-step nested RT-PCR for the diagnosis as well as serotyping of dengue virus in patient's samples. Seventy-six acute phase blood samples collected from clinically suspected dengue patients during the 2008 outbreak were subjected to two-step nested RT-PCR and single-tube multiplex RT-PCR for dengue diagnosis and serotyping. Of the 76 samples, 17 (22.4%) were positive for dengue viral RNA. Single dengue virus infection was found in 16 cases and 1 had concurrent infection with two serotypes (3&1). Dengue serotype 3 was the predominant serotype (70.5%), followed by serotype 1 (23.5%). Single-tube multiplex PCR had concordant result with that of two-step nested RT-PCR including the one with concomitant infection. This study reveals the predominance of dengue serotype 3 in North India in addition to the co-circulation of multiple serotypes and concomitant infection. The rapid and accurate diagnostic capability of single-tube multiplex RT-PCR used in the study appears to be promising enough to be commonly used for dengue viral detection as well as serotyping.