Hsp701A的RNA干涉诱导K562细胞凋亡

目的：研究RNA干涉（RNAi）Hsp701A基因的表达及其诱导慢性粒细胞白血病（慢粒）细胞株K562的凋亡。方法：构建Hsp701A基因小干涉RNA（siRNA）的真核表达载体，转染K562细胞并证实RNAi的有效性。用MTF比色法、AnnexinV-FITC／PI染色和流式细胞术，分别检测K562细胞的增殖、凋亡和细胞周期。结果：构建了Hsp701A siRNA的真核表达载体。将其稳定转染K562细胞后，RNAi组细胞中Hsp701 ARNA和蛋白的表达水平明显下降。Hsp701A siRNA能抑制K562细胞增殖并诱导其细胞凋亡，将其阻滞于G1期。结论：RNAi Hsp701A基因诱导的表达有望成为一种新的慢粒的治疗策略。     

RNAi沉默WT1基因对人肝癌细胞HepG2的影响

目的:探讨利用RNA干扰沉默WT1基因对人肝癌细胞HepG2细胞生长,凋亡的影响,为肝癌的基因治疗提供理论依据。方法:利用脂质体将siRNA真核表达载体转入HepG2细胞中,并检测转染效率;利用免疫细胞化学染色方法检测HepG2细胞中WT1蛋白水平的表达,测定基因沉默效果;用MTT法测定HepG2细胞生长曲线;电镜下观察细胞凋亡形态,流式细胞仪检测凋亡率。结果:利用脂质体为载体将siRNA真核表达载体转染HepG2细胞,转染率达70%以上,转染后细胞中WT1蛋白表达水平下降;RNA干扰沉默WT1基因可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。结论:靶向WT1的序列特异性siRNA可显著抑制WT1基因的表达;下调HepG2细胞WT1基因表达可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。     

靶向XBP1S的RNA干扰质粒对细胞增殖的影响

目的 构建靶向人XBP1S的siRNA真核表达载体(pSUPER-XBP1S)并观察其对人HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.方法 设计并合成针对XBP1S基因的siRNA,退火成互补双链后克隆至真核表达载体pSUPER构建重组质粒,并将其转染入HeLa细胞和HepG2细胞中.采用RT-PCR检测转染前后XBP1S在HeLa细胞和HepG2细胞中的转录,Western印迹检测转染前后XBP1S蛋白的表达;MTT法、细胞计数检测重组质粒对HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.结果 重组质粒能有效地抑制HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S基因的转录和表达;转染HeLa细胞和HepG2细胞后,细胞增殖抑制率及细胞增殖数与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建了靶向人XBP1S的siRNA表达载体pSUPER-XBP1S,并且有效的抑制了HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S的转录和表达,有效抑制了细胞的增殖能力.     

hTERT干扰对HepG2肝癌细胞Smac表达的影响

目的检测RNAi靶向抑制hTERT基因表达促HepG2肝癌细胞凋亡与Smac的关系,探讨hTERT干扰促进细胞凋亡的可能机制。方法收集hTERT基因RNAi真核表达载体稳定转染第20代的HepG2肝癌转染细胞、对照细胞（转染空载体质粒）及未转染细胞,通过Westernblot检测胞内XIAP和caspase-3,以及线粒体和胞浆Smac的表达;采用共聚焦显微镜观察线粒体膜电位变化。结果与未转染细胞和对照细胞相比,转染细胞内XIAP表达明显减少（P〈0．05）,caspase-3表达明显增加（P〈0．05）,线粒体Smac表达明显减少（P〈0．05）,而胞浆Smac表达明显增加（P〈0．05）;转染细胞线粒体膜电位明显降低。结论RNAi靶向抑制hTERT基因表达可能通过降低HepG2肝癌细胞线粒体膜电位,引起Smac从线粒体释放入胞浆,进而抑制XIAP表达,促进caspase-3表达增加诱导细胞凋亡。     

针对人caspase-8基因的siRNA的载体的构建及其沉寂效应检测

目的：设计并构建针对人caspase-8基因mRNA的siRNA表达载体，观察其对转染细胞中的caspase-8的抑制作用。方法：化学合成用于产生针对caspase-8的发夹状的RNA的寡核苷酸，将合成的寡核苷酸链退火形成双链，连接入经Hind Ⅲ和Bgl II双酶切后的pSUPER真核表达载体。对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体介导，把重组质粒瞬时转染入HeLa细胞，RT—PCR、间接免疫荧光检测其对mRNA和蛋白表达的干涉效果。结果：构建了针对人caspase-8基因的RNA干涉真核表达载体pSUPER—C1和pSU—PER—C2，并在人HeLa细胞中有效发挥了对caspase-8基因的干涉作用，而且pSUPER—C1对于caspase-8基因的抑制作用要优于pSUPER—C2。结论：成功地构建了针对人caspase-8基因的siRNA载体，转染HeLa细胞后可抑制caspase-8基因的表达。     

siRNA特异性抑制卵巢癌细胞葡萄糖调节蛋白78表达及其意义的研究

目的研究利用小分子干扰技术（RNAi）,构建Grp78靶向RNA干扰质粒载体,观察其对人类卵巢癌细胞SKOV3Grp78基因表达的抑制作用。初步探讨RNA干扰技术抑制Grp78的表达作为卵巢癌基因治疗的可行性。方法从GeneBank中选取人类卵巢癌细胞Grp78基因序列,采用siRNA Target Designer-Version 1.51设计软件设计Grp78基因发卡寡核苷酸,序列符合siRNA表达载体psiSTRIKETMU6的要求并与psiSTRIKETM质粒载体连接,采用脂质体转染法将含有特异性小分子干扰Grp78 mRNA的重组载体psiSTRIKETM/Grp78导入卵巢癌细胞系SKOV3中,分别在转染前、转染后24h、48h和72h通过RT-PCR和Western blot检测Grp78 mRNA及蛋白水平的表达情况,用流式细胞仪检测细胞凋亡。四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定细胞经梯度浓度紫杉醇处理后的细胞存活率。结果成功构建RNA干扰质粒载体,靶向Grp78 RNA干扰质粒载体命名为psiSTRIKETM/Grp78。将上述质粒转染到卵巢癌细胞后,观察到psiSTRIKETM/Grp78能够有效的抑制Grp78 mRNA及蛋白表达。转染psiSTRIKETM/Grp78基因后的卵巢癌细胞增殖受到抑制,出现凋亡征象,且对化疗药物的敏感性增加。结论构建的RNA干扰真核表达载体psiSTRIKETM/Grp78能明显抑制Grp78 mRNA及蛋白的表达,增加卵巢癌细胞的化疗敏感性。RNAi技术抑制Grp78表达为卵巢癌的基因治疗开辟了新的思路。     

DARPP-32基因对SH-SY5Y细胞药物敏感性的调节作用

目的：探讨DARPP-32基因对人神经母细胞瘤细胞药物敏感性的调节作用。方法：构建DARPP-32基因的真核表达载体和小干扰RNA载体，并将它们转导入人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，G418筛选后获得稳定转染的阳性克隆后，应用RT-PCR和Western blotting进行鉴定；MTT法检测细胞转染前后药物敏感性的变化；流式细胞仪检测细胞转染前后对阿霉素的蓄积浓度的变化；RT-PCR和Western blotting检测细胞转染前后耐药相关蛋白P-gp、MRP和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达变化。结果：成功构建了DARPP-32基因的真核表达载体和小干扰RNA载体；筛选到稳定的DARPP-32高/低表达的神经母细胞瘤细胞模型；MTT试验和流式细胞仪检测结果显示，上调DARPP-32的表达能够显著增强神经母细胞瘤细胞对长春新碱、阿霉素、5-氟尿嘧啶和顺铂的敏感性，提高细胞内阿霉素的蓄积（P<0.05），转染DARPP-32小干扰RNA后的细胞对化疗药物的敏感性降低，细胞内的阿霉素蓄积量显著减少（P<0.05）；RT-PCR和Western blotting结果显示，DARPP-32能够下调 P-gp 和Bcl-2的表达。结论：DARPP-32基因能够调节神经母细胞瘤细胞对化疗药物的敏感性，具有较好的临床应用前景。     

载体介导的RNA干扰技术抑制肝癌细胞中糖原合成酶激酶3β表达的研究

目的构建和筛选能高效、特异性抑制人GSK-3β基因表达的siRNA表达载体,探讨其对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法提取人L02细胞总RNA,RT-PCR扩增GSK-3β基因序列,克隆至pSEB-HUS真核表达载体,构建pSEB-G重组质粒。将设计、合成的3条靶向GSK-3β基因编码区的siRNA及阴性对照分别克隆至pSEB-G,构建siRNA表达载体pSEB-si1-G、pSEB-si2-G、pSEB-si3-G及pSEB-siN-G。将siRNA表达载体瞬时转染HepG2细胞,通过绿色荧光信号、RT-PCR和Western blot观察和检测其对GSK-3β基因的抑制效果,MTT实验和caspase-3活性分析检测其对HepG2细胞增殖和凋亡的影响。结果经双酶切及测序证实,所构建si RNA表达载体目的基因大小、序列与预期相符。瞬时转染HepG2细胞后,其中的pSEB-si1-G能使细胞中绿色荧光信号明显减少,可显著抑制GSK-3βmRNA的表达及蛋白的合成,并使HepG2细胞增殖明显降低,caspase-3活性显著升高。结论成功构建了靶向GSK-3β基因的siRNA表达载体,沉默GSK-3β能显著抑制HepG2细胞的生长并诱导其发生凋亡。     

利用不同方法检测RNAi抑制人pescadillo基因的表达

目的:构建人pescadillo(PES1)基因siRNA的真核表达载体,观察其对PES1表达的影响。方法:利用RNA干扰(RNAi)技术,设计并合成了2条针对PES1基因的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上。分别用以下3种方法检测RNAi的抑制效果:(1)将RNAi重组质粒和带FLAG标签的PES1共转染293T人胚肾细胞,用FLAG抗体进行Western blot;(2)将RNAi重组质粒和带GFP标签的PES1共转染293T细胞,用荧光显微镜观察GFP的亮度;(3)在293T细胞中仅转染小干扰RNA(siRNA)重组质粒,用PES1抗体进行Western blot分析。结果:测序证明,成功构建了PES1siRNA真核表达载体。通过Western blot实验证明,构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性PES1基因表达;荧光显微镜检查发现siRNA能明显减弱细胞中荧光强度,抑制PES1的表达。结论:成功地构建了PES1siRNA的真核表达载体,利用3种不同方法均证明该siRNA能有效地抑制PES1基因的表达。     

ATF-2基因RNA干扰表达载体的构建及鉴定

目的:构建活化转录因子2(ATF-2)基因RNA干扰的真核表达载体,观察其对HepG2肝癌细胞株增殖及凋亡的影响。方法:根据ATF-2 mRNA序列,合成两条寡聚DNA片段,退火后克隆入质粒载体PBA-siU6,DNA测序鉴定重组质粒PBA-siATF-2。脂质体介导质粒转染HepG2细胞。Westernblot法检测ATF-2蛋白表达;MTT方法检测细胞增殖率,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率。结果:ATF-2基因RNA干扰载体经测序分析证实插入64 bp序列正确无误;Westernblot法显示干扰组细胞内ATF-2蛋白表达量明显降低;ATF-2基因的下调导致HepG2细胞增殖阻滞和凋亡发生。结论:成功构建了ATF-2基因RNAi真核表达载体,下调HepG2细胞ATF-2基因表达,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

PTEN基因的克隆及其在HepG2细胞中的表达

目的克隆人抑癌基因PTEN全长cDNA,构建其真核表达载体并检测其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法采用RT-PCR法从人正常肝组织中扩增PTEN全长cDNA,将之与pMD18-T Simple Vector连接、测序,获得PTEN基因。将该基因与pcDNA3·1( )载体连接,构建pcDNA3.1-PTEN真核表达载体。用该载体转染HepG2细胞,RT-PCR检测PTEN的表达。结果酶切和测序证实PTEN基因克隆和真核表达载体构建成功。HepG2-PTEN细胞中PTEN mRNA的表达显著高于未转染的HepG2细胞。结论人抑癌基因PTEN在人肝癌细胞系HepG2细胞中能够高效、稳定地表达,为其在肝癌基因治疗研究中的应用奠定了基础。     

TSG101小干扰RNA对SH-SY5Y细胞生长和药物敏感性的作用

目的：探讨TSG101基因对人神经母细胞瘤细胞生长和药物敏感性的调节作用。方法:构建TSG101基因的小干扰RNA载体并将其转导入SH-SY5Y细胞，G418筛选后获得稳定转染的阳性克隆后，应用RT-PCR和Western blotting进行鉴定；MTT法和流式细胞仪检测细胞转染前后生长速度和细胞周期的变化；DNA ladder法和流式细胞仪检测细胞转染前后对顺铂诱导的凋亡的变化；Western blotting检测细胞转染前后凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax，耐药相关蛋白P-gp、MRP的表达变化。结果:成功构建了TSG101的小干扰RNA载体并将其转染SH-SY5Y细胞；筛选到稳定的TSG101低表达的神经母细胞瘤细胞模型；MTT和流式细胞仪检测结果显示，转染TSG101小干扰RNA后的细胞的生长速度显著减慢于对照组（P<0.05），且G1期的细胞比率显著高于对照组（P<0.05）；DNA ladder法和流式细胞仪检测结果显示，用10 mg/L CDDP处理36 h后，转染TSG101小干扰RNA后的细胞的凋亡数显著多于对照组（P<0.05），形成DNA条带；Western blotting显示，转染TSG101小干扰RNA后的细胞中Bcl-2和P-gp的表达明显低于对照组。结论：下调TSG101基因能抑制神经母细胞瘤细胞生长，增加细胞对化疗药物的敏感性，提示TSG101在基因治疗中具有较好的临床应用前景。     

人源性抗HBc单链抗体真核表达载体的构建及其细胞内表达

目的：构建人源性抗HBc单链抗体的真核表达载体并在细胞内表达。方法： 采用DNA重组技术将特异性人源性抗HBc单链抗体基因插入真核表达载体pEGFP-c1；转染HepG2细胞，经G418筛选细胞，荧光倒置显微镜观察细胞内抗HBc单链抗体与绿色荧光蛋白融合表达情况，并用ELISA法检测HBc单链抗体基因的细胞内表达。结果： 成功地构建了人源性抗HBc单链抗体的真核表达载体。转染HepG2细胞并筛选后，经荧光倒置显微镜观察，细胞内有绿色荧光蛋白表达；ELISA检测细胞内表达的单链抗体片段具有HBcAg结合活性。结论： 人源性抗HBc单链抗体的真核表达载体的构建并在细胞内成功表达，为胞内抗HBc单链抗体的进一步研究奠定了基础。     

乙型肝炎病毒核心蛋白小干扰RNA载体的构建与验证

目的 构建针对乙型肝炎病毒核心蛋白的小干扰RNA真核表达载体,并验证其干扰效果.方法 设计针对HBV基因组（ayw亚型）HBc基因的小干扰RNA序列（位于2147 bp ～2165 bp序列）,目的片段与载体成功连接后转入大肠埃希菌DH5α,酶切及测序验证其正确性.最后以脂质体转入HepG2.2.15细胞中,检测其干扰效果.结果 成功构建针对乙型肝炎病毒核心蛋白的小干扰RNA真核表达载体,并命名为pshRNA-HBc..酶切及测序验证正确,pshRNA-HBc对HepG2.2.15细胞中HBc表达具有特异性干扰效果.结论 构建针对乙型肝炎病毒核心蛋白的小干扰RNA真核表达载体,为后续研究HBc的生物学功能奠定良好基础.     

Construction and identification of a human liver specific microRNA eukaryotic expression vector

MiR-122 is one of the non-coding RNAs which showed its effects on the lipo-metablism, virus infection and HCC forming through regulation of liver gene expression. Its eukaryotic expression vector was constructed by using pSuper which was widely applied in the siRNA expression. The precursor of human miR-122 gene was amplified by polymerase chain reaction （PCR） from the human genomic DNA. The positive clones were screened by PCR and restriction enzyme digestion. The new expression vector of miR-122 was named pHsa-m122. PHsa-m122 and its controls were transfected to HepG2 cells. The miR-122 expression activity was evaluated by GFP122i sensor reporter plasmid through fluorescence detection and Western blot. It was shown that the fluorescence intensity of GFP122si and pHsa-m122 co-transfection group was weaker than that of the controls, so the functional activity of expressed miR-122 was detected. When HepG2 cells were co-transfected with HBV1.3 and pHsa-m122 plasmids, the results showed miR-122 may down-regulate the gene expression of HBV. The human liver specific microRNA eukaryotic expression vector of miR-122 was constructed successfully, which may facilitate further study of its function in the development of liver virus infection diseases and HCC. Cellular ＆ Molecular Immunology.     

EBF3与EGFP融合蛋白表达载体的构建及其在HepG2中的表达

目的:构建早期B细胞因子3(EBF3)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合基因真核表达载体pEGFP/EBF3, 使EBF3-EGFP融合蛋白在人肝癌细胞株HepG2中得到表达.方法:采用RT-PCR技术, 从人胎盘组织总RNA中逆转录并扩增出EBF3全长编码基因, 构建EBF3与EGFP的融合基因真核表达载体pEGFP/EBF3, 用脂质体转染技术将pEGFP/EBF3导入HepG2, 使EBF3-EGFP融合蛋白得到表达.结果:经转化细菌、抽提质粒、酶切鉴定和DNA序列分析证实, EBF3基因已正确插入pEGFP-N1中EGFP基因的上游, 获得融合基因表达载体pEGFP/EBF3.将pEGFP/EBF3导入HepG2细胞24 h后, 在倒置荧光显微镜下可观察到EBF3-EGFP融合蛋白主要表达于核内, 转染pEGFP/EBF3和pEGFP-N1后48 h的转染效率分别为52%和59%.Western blot证实转染pEGFP/EBF3后24 h和48 h细胞质和细胞核中均检出相对分子质量(Mr)为87 000的EBF3-EGFP融合蛋白, 转染pEGFP/EBF3后48 h和72 h, S期细胞比例均明显高于pEGFP-N1转染细胞组和未转染细胞组, 表明EBF3基因的导入可诱导细胞从G1期向G2期发展, 从而促进细胞增殖.结论:成功构建了真核表达载体pEGFP/EBF3, 并在HepG2细胞中进行了表达, 为进一步研究EBF3的功能提供实验基础.     

hAFP及hTERT双启动子调控的针对人IGF-II基因的siRNA特异性抑制人肝癌细胞生长

 目的：设计并筛选高效沉默胰岛素样生长因子II（IGF-II）基因的小干扰RNA（siRNA）序列,构建由重组人甲胎蛋白（hAFP）和人端粒酶逆转录酶（hTERT）双启动子调控的该siRNA表达载体,观察其对肝癌细胞生长的影响。方法：根据siRNA设计原则,参照IGF-II mRNA序列设计3对siRNA序列及1对阴性对照序列,转染人肝癌Huh7细胞,转染24 h后采用实时荧光定量PCR检测IGF-II mRNA表达量变化,筛选干扰效率最高的siRNA序列。采用PCR扩增出hAFP及hTERT启动子的核心序列,应用基因重组技术构建重组hAFP和hTERT双启动子调控的该siRNA表达载体。将上述siRNA表达载体转染Huh7细胞及L-02人正常肝细胞,观察IGF-II mRNA表达及细胞生长情况变化。结果：实时荧光定量PCR显示,siRNA3在25 nmol/L浓度时抑制效率最高,约90%。成功扩增hAFP及hTERT启动子核心序列,将其分别克隆入pGL3-Basic载体,构建成重组pGL3-hAFP-hTERT载体;将siRNA3克隆至pGL3-hAFP-hTERT载体,构建成重组pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3表达载体。Huh7细胞IGF-II mRNA表达量显著降低,抑制效率达86%,细胞增殖受到明显抑制,G1期细胞比例显著增加;L-02细胞上述指标无明显改变。结论: 成功构建双重RNA聚合酶II启动子（hAFP及hTERT双启动子）调控的针对IGF-II基因的siRNA表达载体,即pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3;该siRNA表达载体可特异性抑制IGF-II mRNA表达及肝癌细胞生长。