维A酸促毛囊外毛根鞘无色素黑素细胞分化的实验研究

目的：研究维A酸(all-transretinoic acid，ATA)对毛囊无色素黑素细胞（famelanotic melangeytes，AMMC)的激活作用。方法：以高、中、低3种不同浓度的ATA作用于培养的人毛囊外毛根鞘AMMC，倒置显微镜观察细胞形态的变化，细胞计数法测定ATA对AMMC增殖率的影响，通过间接免疫荧光法结合激光共聚焦显微镜半定量分析药物作用前后AMMC酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)、酪氨酸酶相关蛋白-1(tyrosinase related protein-1，TRP-1)和酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-2)表达的变化。结果：ATA能抑制AMMC的增殖，并能促进AMMC表达TYR和TRP-1，但对TRP-2的表达没有影响。结论：ATA能够促进AMMC的分化，同时抑制增殖，其抑制机制可能与凋亡有关。     

毛囊色素

毛发的颜色主要取决于毛囊色素(优黑素/褐黑素)的合成与表达,黑素颗粒由黑素细胞合成,并向皮质及角质形成细胞转运,最终沉积于毛干内,上述过程主要包括了毛囊黑素细胞的发育,黑素颗粒在毛囊中的合成和转运,黑素细胞的调控,黑素颗粒在毛干上的沉积以及毛囊色素单元的老化。     

人头皮毛囊外根鞘无色素黑素细胞的分离和纯化培养进一步研究

目的：从人头皮毛囊外根鞘分离纯化培养无色素黑素细胞。方法：采用两步酶法(0．50％分离酶和0．50％胶原酶V)获得游离的毛囊，高浓度0．50％，胰酶30min消化游离的毛囊外根鞘细胞，并以优化的培养基进行细胞培养。用HMB-45和NKI／beteb单克隆抗体免疫组化染色、透射电镜对培养物进行鉴定。结果：培养物中初始贴壁细胞大多数为无色素黑素细胞，仅有少量的角质形成细胞，无成纤维细胞污染。经二次传代差别胰酶处理很容易去除角质形成细胞。取培养3周的细胞经免疫组化和透射电镜鉴定证实为无色素黑素细胞。传3代后细胞得到完全纯化。结论：两步酶法结合高浓度的胰蛋白酶处理细胞可彻底清除成纤维细胞，获得无色素黑素细胞的纯培养。     

倍他米松对毛囊外毛根鞘无色素黑素细胞激活的试验研究

目的：研究倍他米松（betamethasone,BT）对毛囊无色素黑素细胞（amelanotic melanocytes,AMMC）的激活作用。方法：以高、中、低3种不同浓度的BT作用于培养的人毛囊外毛根鞘AMMC,测定药物作用前后酪氨酸酶（tyrosinase,TYR）活性和黑素生成的变化。通过间接免疫荧光法结合激光共聚焦显微镜半定量分析药物作用前、后AMMC TYR、酪氨酸酶相关蛋白（tyrosinase related protein,TRP）-1和TRP-2表达的变化,透射电镜分析黑素小体在药物作用前后的变化。结果：BT促进了AMMC表达TYR和TRP-1,并且以剂量依赖方式促进TYR活性,诱导黑素生成。AMMC主要含有Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期黑素小体,但是BT作用后AMMC含有大量Ⅲ或Ⅳ期黑素小体,并且以Ⅳ期黑素小体为主。结论：BT能够激活AMMC,这可能部分解释了糖皮质激素治疗白癜风的机制。     

干细胞因子结合基质蛋白对毛囊无色素黑素细胞黏附与移行的调节作用

目的:研究干细胞因子(stemcellfactor,SCF)结合基质蛋白对毛囊无色素黑素细胞(amelanoticmelanocytes,AMMC)黏附与移行的调节作用。方法:四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞的黏附率。48孔细胞趋化小室测定细胞移行。使用罗丹明标记的鬼笔环肽标记肌动蛋白(F-actin),共聚焦显微镜观察SCF对细胞骨架的调节作用。结果:纤黏连蛋白(FN)、板层素(LN)和Ⅳ型胶原(CⅣ)均以浓度依赖方式促进了AMMC的黏附,其中FN和LN对AMMC促黏附作用相近。SCF减少了AMMC对FN和CⅣ的黏附,对FN的作用更为明显,而对LN起促黏附作用。FN和CⅣ对AMMC有趋化作用,LN无明显作用。SCF作用后可明显使FN对AMMC的趋化作用增强。SCF单独对AMMC有趋化作用,结合FN后,作用明显加强。未黏附在FN上的AMMC胞质内无明显应力纤维;黏附在FN上以后,胞质内可见F-actin排列规则并聚集成束,形成束状应力纤维;SCF作用后,胞体内应力纤维更加致密。结论:SCF调节了AMMC在基质蛋白FN、LN和CⅣ上的黏附与移行,尤其是SCF与FN具有协同促移行作用这可能是白癜风复色过程中AMMC从外毛根鞘向表皮移行机制的一部分。     

人毛囊无色素黑素细胞培养的纯化和培养基成分对细胞影响的实验研究

目的研究geneticin在毛囊黑素细胞培养过程中对成纤维细胞的去除作用,研究12-O-十四烷佛波酯-13-醋酸酯TPA和含牛垂体提取物BPE角质形成细胞无血清培养基K-SFM对毛囊无色素黑素细胞AMMC形态和增殖的影响。方法通过胶原酶法培养毛囊黑素细胞,观察不同浓度geneticin对污染的成纤维细胞的去除。同时观察不同浓度TPA和含BPE的K-SFM对AMMC形态和促增殖的影响。结果采用100μg/mLgeneticin处理2d后,剩余细胞主要是黑素细胞,其中部分成纤维细胞呈死亡状态,继续培养至第7天后,黑素细胞的纯度达到90%以上。50ng/mLTPA可以促进细胞增殖,与100ng/mLTPA比较差异无显著性(P>0.05),但对细胞形态影响不大;100ng/mLTPA明显促进黑素细胞的树突增加。含20%、40%和80%的K-SFM含BPE培养基中,浓度为80%时促增殖作用最明显。结论100μg/mLgeneticin作用2d去除黑素细胞培养中污染的成纤维细胞是一种简单有效的方法,并可重复使用。在毛囊黑素细胞培养中,TPA以50ng/mL的浓度即可明显促进增殖,而不影响细胞的形态。含BPE的K-SFM可以浓度依赖性地促进AMMC增殖。     

甲氧沙林对体外培养的人毛囊外根鞘无色素黑素细胞的激活作用

目的:观察甲氧沙林(8-MOP)对体外培养的人毛囊外根鞘无色素黑素细胞黑素合成相关酶的影响。方法:3种浓度(10、50、100μmol/L)的8-MOP作用于体外培养的人毛囊外根鞘无色素黑素细胞,经免疫荧光染色后,采用激光共聚焦显微镜观察不同浓度、不同作用时间的8-MOP对无色素黑素细胞形态的影响,荧光定量分析酪氨酸酶、酪氨酸相关蛋白(TRP)1、TRP2表达量的变化。结果:50、100μmol/L8-MOP作用于人毛囊外根鞘无色素黑素细胞3d能显著促进酪氨酸酶的表达(P<0.01)熏作用7d后TRP1、TRP2的表达也增加(P<0.05)。结论:8-MOP在体外能直接刺激毛囊外根鞘无色素黑素细胞的活化。     

人毛囊无色素黑素细胞培养方法的改良及色素生成相关酶表达的研究

目的进一步改良人毛囊无色素黑素细胞（amelanotic melanocytes，AMMC）培养的方法，并研究了AMMC内黑素生成相关酶的表达：酪氨酸酶（tyrosinase,TYR）、酪氨酸酶相关蛋白-1（tyrosinase related protein-1，TRP—1）和酪氨酸酶相关蛋白-2（tyrosinase related protein-1，TRP-2）。方法采用1％分离酶（dispase）消化分离毛囊，选用含干细胞因子（stem cell factor，SCF）、内皮素-3（endothelin-3，ET-3）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast grow factor，bFGF）和霍乱毒素（cholera toxin，CT）的成黑素细胞培养基培养AMMC，同时培养表皮黑素细胞（melanocytes，MC）作为对照，采用免疫组化、多巴染色和透射电镜对细胞进行鉴定，蛋白印记法分析TYR、TRP-1和TRP-2的表达。结果1％分离酶消化24h可以容易获得游离的毛囊，结合我们所用的培养基完全排除了成纤维细胞的污染。所用成黑素细胞培养基促AMMC增殖明显，细胞可传5代以上。免疫组化结果显示，AMMC表达gp100、酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）、酪氨酸酶相关蛋白-1（tyrosinase related proteifl-1，TRP-1）和酪氨酸酶相关蛋白-2（tyrosinase related protein-1，TRP-2），证明培养的细胞为黑素细胞。AMMC的多巴染色呈阴性，并且透射电镜发现AMMC胞质中仅含大量的Ⅰ期、Ⅱ期黑素小体，未见Ⅲ、Ⅳ期黑素小体，因此说明AMMC处于未分化状态。TYR和TRP-1在MC中的表达明显强于AMMC。TRP-2的表达在两种细胞间没有明显差别，进一步说明AMMC与MC具有异质性。结论我们成功培养了完全纯化、快速增殖的AMMC，并且培养的细胞不能生成黑素，生物学性状更接近活体中的状态，其与表皮黑素细胞具有异质性。     

人毛囊内无色素黑素细胞的原子力显微镜观察

目的用原子力显微镜观察人头发毛囊内无色素黑素细胞的表面结构。方法分离酶Ⅱ消化带毛囊的头皮，游离单个毛囊，以胰酶／EDTA消化之，获取细胞悬液，以添加黑素细胞生长物质的254培养基重悬细胞，常规培养。传第3代后接种到内置云母片的6孔培养板中，细胞贴附到云母片上后，固定．原子力显微镜常温常压下，触摸式扫描。结果毛囊无色素性黑素细胞多呈梭形，有2个突起，少数有3个树突。每个树突无明显的二级分枝，个别在树突侧缘有隆起。在一级树突的顶端可见丝状伪足。结论毛囊内无色素性黑素细胞形态不成熟，不能转运黑素颗粒到角质形成细胞，但它有黑素小体运动的物质基础——丝状伪足。     

甲氧沙林对人毛囊黑素细胞增殖、活化和黑素合成作用的研究

目的 研究甲氧沙林对人毛囊黑素细胞活化、增殖和黑素合成的影响.方法 体外培养正常人毛囊黑素细胞,观察不同浓度甲氧沙林(10～500μmol/L)对毛囊黑素细胞形态、增殖、酪氨酸酶活性和黑素合成的影响.结果 50μmol/L甲氧沙林处理细胞7d后,毛囊黑素细胞树突明显增多延长,胞浆内出现较多棕褐色颗粒,酪氨酸酶活性和黑素含量增加显着高于对照组(P<0.01).结论 甲氧沙林能诱导毛囊黑素细胞树突增多延长,酪氨酸酶活性和黑素含量增加.     

毛囊内无色素黑素细胞的超微结构特点

目的 探讨来自人毛发的毛囊内无色素黑素细胞的超微结构特点.方法 胶原酶V消化正常人头皮,获取毛囊.游离毛囊用0.1mol/LPBS冲洗,胰酶消化,得细胞悬液.将细胞悬液接种到适合黑素细胞生长的培养基.细胞传第3代后,收集细胞,电镜观察摄片.结果 透射电镜下可见此细胞为单核圆形或椭圆形细胞,核大,核膜双层,核内常染色体丰富,而异染色质很少.胞质中充满黑素体,多为Ⅱ和Ⅲ期,极少为Ⅰ、Ⅳ期.黑素体内的电子密度颗粒多排列成同心圆形,少数排列呈线状.胞质内高尔基复合体不明显.结论 毛囊内无色素黑素细胞超微结构不同于表皮黑素细胞,这种结构变化导致功能上的不成熟,无色素黑素细胞是成熟黑素细胞的贮库.     

1,25二羟基维生素D3对毛囊外毛根鞘无色素黑素细胞激活的实验研究

目的研究1,25二羟基维生素D3(1,25-Dihydroxyvitamin D3,VID)对毛囊外毛根鞘无色素黑素细胞(amelanotic melanocytes,AMMC)的激活作用。方法以高、中、低3种不同浓度的1,25(OH)2D3作用于培养的人毛囊外毛根鞘AMMC,倒置显微镜观察细胞形态的变化,然后收集细胞,测定细胞酪氨酸酶活性和黑素含量,透射电镜观察药物作用前后AMMC内黑素小体的变化,最后通过Western blot方法半定量分析药物作用前后AMMC内酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosinase related protein-1,TRP-1)和酪氨酸酶相关蛋白2(tyrosinase relatedprotein-2,TRP-2)表达的变化。结果 VID能增加AMMC内酪氨酸酶活性,促进AMMC生成黑素,电镜结果显示药物作用后的AMMC内出现大量Ⅲ、Ⅳ期黑素小体。Western blot结果显示VID可以促进AMMC中TYR和TRP-1的表达,但对TRP-2的表达无明显影响。结论 VID通过促进黑素生成相关酶TYR和TRP-1的表达激活了AMMC。     

5-羟色胺/褪黑素能系统对MC和AMMC的作用机制

白癜风患者皮损在色素恢复过程中,白斑边缘正常表皮基底层黑素细胞和毛囊外毛根鞘无活性黑素细胞(AMMC)是白癜风患者皮损色素恢复的两个途径.AMMC可被某些特定因子激活、增殖和游走,并产生黑素,可能是黑素千细胞.5-羟色胺/褪黑素能系统(5-HTs/MTs)对黑素细胞(MC)和AMMC的增殖和凋亡产生作用;5-羟色胺(5-HT)抑制黑素生成,黑素细胞内生成褪黑(激)素(MT)可能是黑素的内在调节剂,因而探讨5-HTs/MTs信号转导途径对AMMC的作用机制,可进一步揭示白癜风的发病机理,对开发新的5-HT类药物及临床治疗提供科学依据,具有重要的理论和应用价值.     

NB-UVB Induces Melanocytic Differentiation of Human Hair Follicle Neural Crest Stem Cells

BackgroundPhototherapy is an important method to treat vitiligo. However, it is unclear how phototherapy affects melanocyte precursors and skin neural crest stem cells.ObjectiveTo investigate the underlying mechanisms of narrow-band ultraviolet B (NB-UVB) induced melanocyte lineage differentiated from human scalp-derived neural crest stem cells (HS-NCSCs).MethodsHS-NCSCs were expanded from scalp hair follicles. The c-Kit⁻/CD57⁻ HS-NCSCs were isolated by cell sorting. Different doses of NB-UVB were used to irradiate these HS-NCSCs. Cell ultrastructure was examined by transmission electron microscope. Melanocyte marker expression was analyzed by Quantitative RT-PCR and Western blot. Cell proliferation and migration were also evaluated.ResultsThe c-Kit⁻/CD57⁻ HS-NCSCs expressed embryonic NCSC biomarkers. NB-UVB at a dose of 100 mJ of NB-UVB had little effect on the cell proliferation of differentiated melanocytes from c-Kit⁻/CD57⁻ HS-NCSCs, while 700 mJ inhibited cell proliferation significantly. The dendritic processes of differentiated melanocytes increased after radiation. The tyrosinase and Melanocortin 1 receptor (Mc1R) expression of differentiated melanocytes increased after NB-UVB exposure. The effect of NB-UVB on tyrosinase expression was modulated by signaling inhibitors H89 and PD98059 as well as Mc1R level in the cells. The migration ability of differentiated melanocytes was enhanced under 100 mJ exposure.ConclusionThese data demonstrate that NB-UVB facilitates melanocytic differentiation of the HS-NCSCs and enhances migration of these cells. Mc1R and cAMP pathway play a critical role in NB-UVB induced melanocytic differentiation.     

中药滋补肝肾方对人黑素细胞株黑素合成的影响

目的通过中药滋补肝肾方对人黑素细胞株细胞增殖、酪氨酸酶活性和黑素含量影响的研究,探讨本方治疗白癜风的作用机制.方法采用4-甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)测定本方对细胞增殖的影响,用酶学方法测定对酪氨酸酶活性的影响,比色法测定中药对黑素含量的影响.结果滋补肝肾方对体外培养的人黑素细胞具有促进细胞增殖、提高黑素含量和酪氨酸酶活性作用.结论本方能促进黑素细胞黑素合成,这可能是其治疗白癜风的作用机理之一.     

Expression Pattern and Role of Klotho in Human Hair Follicles

BackgroundKlotho protein plays a pivotal role in aging regulation. However, it is unclear whether klotho is expressed in human hair follicles and is correlated with hair growth.ObjectiveThe purpose of this study was to determine the expression pattern and role of klotho in human hair follicles.MethodsWe examined the klotho expression patterns in human hair follicles from young and aged donors. Furthermore, we examined the functional roles of klotho on human hair growth using klotho siRNA and klotho recombinant protein.ResultsInterestingly, klotho was expressed in human hair follicles at both gene and protein levels. In hair follicles, prominent klotho expression was mainly observed in the outermost regions of the outer root sheath and hair bulb matrix cells. Quantification of klotho protein expression in young and aged donors showed that klotho expression decreased with aging. In human hair follicle organ culture, klotho silencing promoted premature catagen induction and inhibited human hair growth. Otherwise, klotho protein prolonged human hair growth.ConclusionThese results indicate that klotho might be an important regulatory factor for human hair growth and hair cycle change.     

HSPC016基因在凝集性生长人毛乳头细胞的表达

目的 确定造血干细胞相关基因HSPC016的表达与毛乳头细胞凝集性生长的关系。方法 对凝集性生长的人毛乳头细胞、非凝集性生长的人毛乳头细胞和人真皮成纤维细胞分别进行细胞内mRNA原位杂交;用RT-PCR从以上3组细胞总RNA扩增HSPC016基因。结果 原位杂交发现HSPC016基因在凝集性生长的人毛乳头细胞表达,而在非凝集性生长的人毛乳头细胞和人真皮成纤维细胞均不表达;RT-PCR可以从凝集性生长的人毛乳头细胞RNA中扩增到约200bp目的片段,而不能从非凝集性生长人毛乳头细胞和人真皮成纤维细胞中扩增到相应目的片段。结论 HSPC016基因在凝集性生长的人毛乳头细胞特异性表达,可能与毛乳头细胞的分化和功能状态有关。