圈套寡核苷酸抑制NIH3T3细胞α2Ⅰ型胶原基因表达的研究

目的 研究激活剂蛋白1(activator protein-1,AP—1)圈套寡核苷酸(decoy-oligodeoxynu-cleotides,Decoy-ODNs)对成纤维细胞α2I型胶原表达的影响，探讨病理性腋痕的基因治疗。方法 设计合成针对AP—1的Decoy-ODNs，用阳离子脂质体转染NIH3T3细胞，观察Decoy-ODNs在细胞中的分布；用凝胶迁移变动分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)研究Decoy-ODNs对AP—1的抑制作用，采用RT—PCR观察其对细胞胶原合成的影响。结果 AP—1的Decoy-ODNs可在体外竞争抑制核转录因子AP—1的活性；阳离子脂质体可以将Decoy-ODNs转染进入细胞浆及细胞核从而发挥作用；Decoy-ODNs作用24h后，NIH3T3细胞α2I型胶原mRNA的表达明显降低。结论 De—coy-ODNs可以通过拮抗核转录因子AP—1的活性而抑制α2I型胶的表达。     

真核表达载体pcDNA3.1(-)-转化生长因子β3的构建

目的为研究成纤维细胞基因转染的可行性创造条件，从而为转化生长因子（TGF）83转基因治疗创面与病理性瘢痕的研究奠定基础。方法应用基因重组技术和限制性内切酶酶切构建并鉴定pcDNA3．1（-）-hTGFβ3真核表达载体，经脂质体Lipofectamlne^TM 2000介导质粒转染NIH3T3细胞后应用逆转录．聚合酶链反应（RT—PCR）检测hTGFβ3 mRNA在真核细胞中的表达。结果重组真核表达载体pcDNA3，1（-）-hTGFβ3经限制性内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ酶切，电泳后显示1253hp的hTGFβ3目的片段和5．40kb的pcDNA3．1（-）载体片段，测序证实酶切片段与GenBank中登记的TGFβ3全长序列相同，证实pcDNA3．1（-）-hTGFβ3真核表达载体构建成功，经RT-PCR检测了hTGFβ3在转录水平mRNA的表达情况，表明质粒转染NIH3T3细胞后hTGFβ3 mRNA的表达明显增强。结论重组真核表达载体构建正确，并能在NIH3T3成纤维细胞中表达hTGFβ3 mRNA，为其在创面与病理性瘢痕的转基因治疗奠定了基础。     

TGF-β1对UVA照射皮肤成纤维细胞Ⅰ型，Ⅲ型胶原合成和表达的影响

目的：探讨转化生长因子-β1（tansforming gowth factor—beta 1,TGF—β1）对长波紫外线（ultraviolet A,UVA）照射皮肤成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原合成和表达的影响。方法：通过MTT法检测TGF-β1干预后成纤维细胞增殖活性,选择UVA照射剂量为15J／cm^2,联免疫法（ELISA）测定不同剂量即TGF—β1小剂量组（UVA＋TGF—β1 0．1ng／ml）、中剂量组（UVA＋TGF—β1 1ng／ml）、大剂量组（UVA＋TGF—β1 10ng／ml）处理后成纤维细胞清夜中Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量,半定量RT—PCR检测成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达。结果：UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞,导致成纤维细胞增殖活性下降,给予不同剂量TGF-β1干预后,成纤维细胞增殖活性与UVA照射组比较,明显提高;成纤维细胞上清液中Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量增加,成纤维细胞内Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达增强。结论：TGF-β1可提高UVA照射体外培养成纤维细胞增殖活性;增加UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量,增强成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达,对皮肤成纤维细胞起保护作用。     

饰胶蛋白聚糖基因转染对大鼠肾系膜细胞转化生长因子βⅠ、βⅡ型受体表达的影响

目的探讨饰胶蛋白聚糖(DCN)拮抗肾小球硬化进展的作用是否与其抑制系膜细胞(MsC)转化生长因子βⅠ、βⅡ型受体(TGF-βRⅠ、TGF—βRⅡ)表达有关。方法经外源性TGF-βⅠ刺激培养的大鼠肾MsC，采用RT—PCR、Western印迹法检测其TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ的表达。用脂质体介导法将DCN基因转染MsC，经筛选和鉴定，用RT—PCR、Western印迹法和免疫荧光法分别观察DCN基因转染对TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ表达的影响。结果经外源性TGF-βⅠ刺激的正常MsC，其TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ基因转录及蛋白表达均明显升高，且呈时间依赖性，于作用24h达高峰。与转染空载体的MsC(1P-1)相比，转染。DCN基因的MsC克隆(3D-5，7D-1)的TGF-βRⅠmRNA表达分别为对照组的20％和32％，TGF-βRⅡmRNA表达分别为对照组的64％和59％；TGF-βRⅠ蛋白表达分别为对照组的34％和25％，TGF-βRⅡ蛋白表达分别为对照组的49％和57％。同时转染DCN基因也能阻止MsC对外源性TGF-βⅠ刺激所致的两种受体表达升高作用。结论过表达DCN基因的MsC，其TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ和蛋白表达水平均明显降低，这可能是DCN拮抗由TGF-β介导的肾小球硬化发生的重要机制之一。     

PPARγ特异配体抑制肝星状细胞的活化

目的 研究不同浓度的过氧化物酶体增殖物活化的受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)特异配体罗格列酮对肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)生物学特性的影响,以探究其在肝旱状细胞活化中的作用.方法 设立对照组,3μM罗格列酮组,10μM罗格列酮组,20μM岁格列酮组.用MTT法检测细胞的增殖情况;采用RT-PCR方法检测其中PPARγ、TGF-β1及Ⅰ型前胶原mRNA表达;用Western blot法检测PPARy、Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF-β1蛋白表达;用免疫细胞化学方法测定α-SMA表达的变化;ELISA法检测细胞培养上清中的Ⅰ型胶原表达的变化.结果 (1)RT-PCR:20μM罗格列嗣组或10μM罗格列酮组与3 μM罗格列酮组或对照组相比,PPARY mRNA表达显著增高(P＜0.01),Ⅰ型前胶原mRNA表达显著降低(P＜0.01);20 α-SMA罗格列酮组与10 α-SMA罗格列酮组之间,3 α-SMA罗格列酮组与对照组之间,PPARγ和Ⅰ型前胶原mRNA的表达差异无显著件(P＞0.05).而各组之间的TGF-β1 mRNA的差异无显著性意义(P＞0.05).(2)Western blot:PPARγ及TGF-β1蛋白表达所得结果与RT-PCR结果相一致.Ⅰ型胶原表达与RT-PCR Ⅰ型前胶原mRNA表达结果相一致.各组之间的Ⅲ型胶原表达差异无显著性意义(P＞0.05).(3)免疫细胞化学:20α-SMA罗格列酮组或10 α-SMA罗格列酮组与3 α-SMA罗格列酮组或对照组相比,α-SMA表达明显降低(P＜0.05).20 α-SMA岁格列酮组与10 α-SMA罗格列酮组之问,3 α-SMA罗格列酮组与对照组之间,差异无显著性(P＞0.05).(4)ELISA:20 α-SMA罗格列酮组或10 α-SMA罗格列酮组与3α-SMA罗格列倒组或对照组相比,细胞的培养上清中Ⅰ型胶原表达明显降低(P＜0.01).20 α-SMA罗格列酮组与10 α-SMA罗格列酮组之问,3 α-SMA罗格列酬组与对照组之间,差异无显著性(P＞0.05).结论 PPAR?配体罗格列酬能够在促进PPAR?的合成表达的同时,抑制细胞的增殖及胶原合成,抑制α-SMA的表达,减少细胞分泌Ⅰ型胶原,对肝星状细胞的活化有明显的抑制作用.     

血管紧张素Ⅱ通过JNK-c-Jun/AP-1信号通路调控系膜细胞转化生长因子β1表达

目的 探讨c-Jun氨基末端激酶(JNK)-c—Jun／活化蛋白(AP)-1信号转导通路在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的肾小球系膜(MC)细胞转化生长因子β1(TGF—β1)表达中的调控作用。方法 应用核酸酶保护法检测系膜细胞TGF—β1mRNA表达。应用凝胶电泳迁移率(EMSA)、超迁移实验和非放射性激酶活性检测法检测系膜细胞内AP—1活化、AP-1的组成及JNK活性。应用ELISA法检测培养上清中纤连蛋白(FN)。结果 AngⅡ可诱导MC内JNK活化，刺激30min后，JNK活性达到高峰，1h后几乎恢复至正常水平。AngⅡ刺激后MC内AP-1活性显著增强，活化的AP-1主要含有c-Jun和c—Fos亚基。AngⅡ可促进MC表达TGF—βl及分泌FN，抗TGF—β1抗体显著抑制AngⅡ促进的FN分泌。JNK特异性抑制剂SP600125显著抑制AngⅡ诱导AP-1活化、TGF—β1表达及FN分泌。结论 AngⅡ-JNK—c-Jun／AP-1-TGF—β1-FN信号转导通路在肾小球硬化中发挥一定作用，SP600125能部分抑制AngⅡ诱导的AP-1活化、TGF—β1表达及FN的合成，可能具有一定的治疗作用。     

转化生长因子-β1对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad3、7mRNA表达的影响

研究转化生长因子-β1(TGF-β1)对瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)Smad3、7mRNA表达的影响。方法：用RT-PCR法分别检测TGF-β1不同浓度(0，5，50，500pmol／1：Smad3 mRNA 24h，smad7 mRNA 90min)和TGF-β1(500pmol／1)作用不同时间(Smad3 mRNA：1，2，4，24，48h；Smad7 mRNA：0．5，1，1，5，2，4，24h)对Smad3、7mRNA表达的影响。结果：Smad3 mRNA水平随TGF-β1浓度的增加而呈浓度依赖性下降；5pmol／lTGF-β1就能使Smad7 mRNA水平明显地升高，并随TGF-β1浓度加大而略有改变；随作用时间延长，Smad3mRNA水平逐渐下降，在作用48h后下降到最低，呈时间依赖性。而Smad7 mRNA水平在细胞受到TGF-β1刺激后l20min即达到最高值。结论：TGF-β1能使KFB细胞Smad3 mRNA发生配体依赖性的下调，而使Smad7 mRNA表达迅速增加。     

mTOR通路调控肾间质成纤维细胞活化的机制

目的 探讨mTOR信号通路在肾间质成纤维细胞增生活化过程中的调控作用,并研究其抑制剂在抗肾纤维化治疗中的可行性.方法 用8周龄雌性C57BL/6小鼠构建单侧输尿管结扎(UUO)肾间质纤维化动物模型(n=30),按数字随机法分为雷帕霉素组(n=15)及UUO组(n=15).雷帕霉素组术前1d开始腹腔注射雷帕霉素(2 mg·kg-1·d-1)至实验结束;UUO组注射生理盐水.分别于术后1、3、7、14 d处死小鼠(n=3),留肾组织进行相关检测.同时,体外实验评估雷帕霉素对TGF-β诱导鼠成纤维细胞株(NIH3T3细胞)活化的干预作用.结果 UUO小鼠肾组织中活化的肌成纤维细胞[α肌动蛋白(α-SMA)阳性]高表达mTOR通路下游效应因子pS6K.雷帕霉素显著抑制pS6K表达及肾间质中肌成纤维细胞的活化,改善肾小管间质损伤及纤维化程度.实时荧光定量PCR结果提示雷帕霉素组小鼠肾皮质组织中成纤维细胞特异蛋白1 (FSP1)、转化生长因子β(TGF-β)、结缔组织因子(CTGF)及Ⅳ型胶原蛋白基因α1 (Col 4A1)的mRNA水平显著下降.体外实验结果示TGF-β诱导小鼠成纤维细胞株( NIH3T3)的mTOR通路显著活化,并大量合成α-SMA.雷帕霉素能够明显抑制mTOR通路活性,降低细胞的纤维化活性.结论 肾间质纤维化过程中成纤维细胞内的mTOR信号通路高度活化.抑制mTOR通路能够显著降低成纤维细胞的活性,改善肾间质纤维化程度.     

肾上腺素对增生性瘢痕成纤维细胞TGF-β1、bFGF及Ⅰ型前胶原表达的影响

目的实验研究肾上腺素对体外培养人皮肤成纤维细胞中Ⅰ型前胶原、TGF—β1及bFGF表达的影响。方法实验采用RT-PCR检测。肾上腺素作用24h后bFGF、TGF-β1、人Ⅰ型前胶原的mRNA表达差异，并以ELISA检测bFGF、TGF-β1在肾上腺素作用24h后的蛋白表达差异。结果与对照组比较，肾上腺素上调bFGF mRNA及蛋白的表达和下调TGFβ1 mRNA及蛋白的表达；但在增生性瘢痕成纤维细胞中，0．20μmol／L的。肾卜腺素可显著下调人Ⅰ型前胶原mRNA水平的表达，而在正常皮肤成纤维细胞中，0．05、0．1和0．2μmol／L的。肾上腺索均可下调人Ⅰ型前胶原mRNA水平的表达，且其差异有统计学意义。结论在增生性瘢痕成纤维细胞生长融合后早期（24h），肾上腺素可促进成纤维细胞bFGF的mRNA和蛋白的合成，降低TGF—β1的mRNA和蛋白的生成，降低Ⅰ型前胶原mRNA的表达。     

Par-3蛋白在转化生长因子?茁1介导的大鼠肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的 观察转化生长因子（TGF)β1诱导的正常大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK52E）转分化（EMT）过程中细胞极性蛋白Par-3的表达及上调Par-3蛋白表达对TGF-β1诱导NRK52E细胞转分化进程的影响。 方法 应用TGF-β1 (10 μg/L)刺激NRK52E细胞，采用RT-PCR、Western印迹和免疫荧光方法分别检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Par-3 mRNA和蛋白的表达；应用Lipofectmine 2000将pKH3-HA-Par-3质粒瞬时转染NEK52E细胞，采用Western印迹观察上调表达Par-3对上述指标的影响。 结果 TGF-β1刺激后，NRK52E细胞α-SMA蛋白和mRNA水平上调，E-cadherin蛋白和mRNA的表达下调；Par-3蛋白表达呈时间依赖模式下调，72 h TGF-β1刺激组与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。但Par-3 mRNA水平在各时间点差异均无统计学意义（P > 0.05）。脂质体转染外源性质粒pKH3-HA-Par-3上调表达Par-3可显著抑制TGF-β1诱导NRK52E细胞α-SMA蛋白的上调表达；逆转E-cadherin蛋白的下调表达。 结论 在TGF-β1诱导NRK52E细胞转分化进程中细胞极性Par-3蛋白表达下调，基因转染上调表达Par-3可部分减轻EMT的程度，提示Par-3蛋白在TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化和肾脏纤维化中可发挥保护性作用。     

pcDNA3.1(-)-hTGFβ3成纤维细胞稳定表达系统的构建与生长增殖活性研究

目的构建人转化生长因子β3的真核表达载体pcDNA3.1(-)TGFβ3转染NIH3T3成纤维细胞的稳定表达系统,研究转基因TGFβ3对成纤维细胞生长增殖活性的影响。方法通过脂质体介导的转染技术和G418细胞筛选法,将真核表达载体pcDNA3.1(-)TGFβ3质粒导入NIH3T3成纤维细胞,应用RTPCR与Westernblot检测hTGFβ3在真核细胞中的表达。经相差显微镜形态观察及四唑蓝比色实验法(MTT)检测细胞增殖活性。结果在10株转染和经G418反复筛选的NIH3T3成纤维细胞系中,有7株hTGFβ3mRNA及其蛋白的表达明显增强,其余3株细胞相对较弱或者没有表达。TGFβ3转基因稳定表达的NIH3T3成纤维细胞系的生长增殖明显减缓(P<0.05)。结论pcDNA3.1(-)TGFβ3真核表达载体转染NIH3T3成纤维细胞的稳定表达系统构建成功,转基因hTGFβ3在体外培养条件下可抑制成纤维细胞的增殖。     

转化生长因子-β1对肌腱腱鞘、腱外膜和腱内膜细胞增殖和胶原产生的影响

目的 探讨兔屈趾肌腱腱鞘、腱外膜和腱内膜细胞增殖、胶原产生和转化生长因子（TGF）-β1对细胞的增殖和胶原产生的影响。方法 从兔屈趾肌腱分离腱鞘、腱外膜和腱内膜细胞并培养，在使用TGF-β1培养后，细胞的数量和胶原产生量被测量，并与不使用TGF-β1培养的对照组比较。另外，通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）测定使用TGF-β1前后各种细胞Ⅰ型胶原基因的表达。结果 所有3种细胞均可以产生Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原组织，TGF-β1使培养的细胞数量降低，但能显著性地增加Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原组织产生和Ⅰ型胶原基因的表达（P〈0．05）。结论 调节TGF-β1的水平能调节胶原组织的产生，可能为临床上防止肌腱粘连提供新的途径。     

反义转化生长因子βⅠ型受体表达质粒对大鼠肝星状细胞功能的影响

目的观察反义转化生长因子(TGF)βⅠ型受体(TβRⅠ)表达质粒对大鼠肝星状细胞(HSC)增殖及细胞外基质分泌的影响.方法双酶灌注和梯度离心法分离大鼠HSC,将构建的反义TβRⅠ真核细胞表达质粒与pcDNA3空质粒经脂质体转染培养活化的HSC,通过RT-PCR、Western印迹检测外源导入质粒在HSC中的表达,采用MTT法、3H-TdR掺入法检测细胞增殖情况,ELISA法检测TGF-β1含量变化,并应用Western印迹检测HSC中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达.结果反义TβRⅠ真核细胞表达质粒可抑制活化HSC中TβRⅠ mRNA及蛋白表达.与pcDNA3转染组相比,反义TβRⅠ质粒表达可抑制HSC增殖(P＜0.01),降低TGF-β1含量(P＜0.05),抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌(P＜0.05).结论重组反义TβRⅠ表达质粒可在HSC中获得较好表达,并可显著抑制HSC增殖及细胞外基质分泌.     

基于Smad3的抗瘢痕增生药物高通量筛选体系的构建及效果评价

目的:构建Smad3反应性不稳定增强型绿色荧光蛋白(d2EGFP)报告系统,作为抗瘢痕增生药物高通量筛选体系。方法:分别以EGFP、d2EGFP为报告基因,neor为筛选基因,构建以4×成纤维细胞α2Ⅰ型前胶原(COL1A2)基序为增强子、SV40为启动子的报告基因载体p4COL1A2-EGFP和p4COL1A2-d2EGFP,并分别稳定转染NIH3T3细胞,获得Smad3反应性报告细胞株NIH3T3-d2EGFP和NIH3T3-EGFP。分别向两种细胞株中加入TGF-β1,比较不同时相点d2EGFP和EGFP的表达。应用Smad3“圈套”寡核苷酸(TFD)转染NIH3T3-d2EGFP,加入TGF-β1,观察TFD对TGF-β1诱导d2EGFP表达的拮抗作用。结果:NIH3T3-d2EGFP是较理想的Smad3反应性报告细胞株,Smad3TFD对TGF-β1诱导调控d2EGFP的表达具有明显的拮抗作用。结论:Smad3反应性d2EGFP报告系统可特异、灵敏、动态地反映和监测Smad3的活性变化。     

外源性转化生长因子-β1对骨髓间充质干细胞TβRⅠ、TβRⅡ表达的影响

目的探讨体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中转化生长因子(TGF)β1受体的表达情况和外源性TGFβ1对MSCsTGFβ1受体表达的影响。方法四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法法检测不同浓度TGFβ1对MSCs增殖的影响,对硝基苯磷酸盐(PNP)法检测不同浓度TGFβ1以及同一浓度不同作用时间对MSCs碱性磷酸酶(ALP)活性的影响,免疫细胞化学染色观察MSCs中TGFβ1受体表达情况,Westernblot检测TGFβ1作用早期TβRⅠ、TβRⅡ蛋白表达的变化。结果外源性TGFβ1对MSCs增殖的抑制、ALP活性的促进具有剂量依赖性,在5μg/L时达到平台期;在5μg/LTGFβ1刺激下,随着刺激时间延长,ALP表达量逐渐增加,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);MSCs同时表达TβRⅠ、TβRⅡ,在TGFβ1刺激早期TβRⅡ蛋白表达量无明显变化(P>0.05),TβRⅠ随TGFβ1刺激时间延长,蛋白表达量逐渐增加(P<0.05),TβRⅠ/TβRⅡ比例增加,与ALP的表达变化呈正相关。结论在TGFβ1刺激早期,MSCs通过TβRⅠ、TβRⅡ表达量和TβRⅠ/TβRⅡ相对比例的阶段性、适应性的改变来调节自身对TGFβ1的反应性,启动成骨分化。在此过程中,TβRⅠ作为一限制性因子发挥着重要的作用。     

褪黑素对增生性瘢痕成纤维细胞生物学活性的调控

目的 探讨褪黑素对增生性瘢痕成纤维细胞生物学活性的调控.方法 分离培养增生性瘢痕成纤维细胞,采用四氮唑复合物/硫酸酚嗪甲酯(XTT/PMS)法检测细胞增殖活性,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养上清液中β1转化生长因子(TGF-β1)含量和荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测细胞α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、胶原Ⅰ和胶原ⅢmRNA表达,评价褪黑素和褪黑素受体拮抗剂(luzindole)对增生性瘢痕成纤维细胞生物学活性的影响.结果 褪黑素抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖,抑制效果呈浓度依赖性(P＜0.05);高浓度褪黑素(10-3 mmol/L)可降低增生性瘢痕成纤维细胞产生TGF-β1 (P＜0.05)和α-SMA mRNA、胶原Ⅰ mRNA的表达(P＜0.05);褪黑素受体拮抗剂能阻断褪黑素对细胞产生TGF-β1和α-SMA、胶原Ⅰ mRNA表达的抑制作用(P＜0.05);但褪黑素对该细胞胶原ⅢmRNA表达无影响(P＞0.05).结论 褪黑素可通过与受体结合调控增生性瘢痕成纤维细胞的生物学活性.     

Smad4小分子干扰RNA对转化生长因子-β诱导的纤溶酶原激活物抑制剂-1表达的影响

目的 探讨Smad4小分子干扰RNA(siRNA)对转化生长因子(TGF)-β诱导纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)-1的表达的影响及作用机制.方法 将Smad4 siRNA转染入肝星状细胞24h后行TGF-β(1μg/L)刺激,24、48 h后收集细胞.利用萤光素酶报告基因法测定Smad结合转写因子的活性;Northern印迹分析技术检测PAI-1 mRNA表达的变化;Western印迹分析观察Smad4蛋白、PAI-1蛋白的变化.结果 Smad4 siRNA能抑制Smad4蛋白(3.0±0.1比16.0±0.5)表达;Smad4 siRNA抑制TGF-β1和ALK5激活的4×SBE荧光素酶报告基因活性;TGF-β时间依赖性促进PAI-1 mRNA表达,24 h达高峰;Smad4 siRNA从mRNA(1.3±0.1比6.5±0.2)和蛋白(1.50±0.15比5.52±0.36)水平抑制TGF-β激活的PAL-1的表达.结论 Smad4 siRNA能够有效地阻断TGF-β诱导的PAI-1表达.     

转化生长因子β1对人腹膜间皮细胞结缔组织生长因子的影响

目的 观察转化生长因子(TGF)β1对人腹膜间皮细胞(HPMCs)结缔组织生长因子(CTGF)的mRNA和蛋白表达影响并探讨其可能的机制。方法 原代培养HPMCs，用5ng／ml TGF-β1刺激第3代细胞，采用免疫组织化学染色、Western印迹、ELISA和RT-PCR等方法，观察CTGF的mRNA和蛋白表达、纤连蛋白(FN)和Ⅰ型胶原(ColⅠ)的mRNA和蛋白表达，细胞内磷酸化Smad2／3(p-Smad2／3)的蛋白表达以及在细胞内的迁移。结果 (1)刺激组CTGF的mRNA表达与对照组比均显著增加，其中48h为峰值；对照组细胞内仅有少量CTGF的蛋白表达，在TGF-β1刺激后24h表达明显增加，48h达峰值。(2)刺激组FN和ColⅠ的mRNA表达与对照组比均呈时间依赖性显著增加，上清液FN和细胞内ColⅠ的蛋白表达与对照组比也呈时间依赖性显著增加。(3)对照组细胞内几乎不表达p-Smad2／3(阳性细胞率3％)，在刺激后15min表达增加(29％)，细胞着色主要分散在胞质中；1h增加最明显(84％)，细胞着色加深且集中在胞核及周边；2h明显回落(37％)，细胞着色转淡并又分散至胞质中。结论TGF-β1在致腹膜纤维化过程中诱导了HPMCs内CTGF的转录和蛋白表达，可能与TGF-β1激活了HPMcs内Smad信号通路有关。     

孕激素调节人成骨细胞转化生长因子-β1、β2的表达

目的研究孕激素对正常成人成骨细胞转化生长因子(TGF)-β1、TGF-β2表达的调节作用,探讨孕激素治疗绝经后骨质疏松症(OP)的作用机制.方法鉴定成人成骨细胞(hOB),测定碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素分泌,Van Gieson氏苦味酸酸性复红染色法进行Ⅰ型胶原染色.hOB用孕酮干预.Northern杂交、ELISA分别检测hOB TGF-β1、TGF-β2 mRNA和蛋白质分泌.结果观察到hOB分泌的ALP活性为(74.3±4.7)mU/mg蛋白,培养上清液骨钙素含量为(3.84±0.39)ng/ml蛋白,Ⅰ型胶原染色呈红色.观察到孕酮增强hOB TGF-β1、TGF-β2 mRNA表达呈剂量依赖性(P＜0.001);10-9mol/L孕酮诱导12～24 h促进TGF-β1、TGF-β2 mRNA表达,呈时间依从性.孕酮促进hOB TGF-β1、TGF-β2蛋白质分泌呈剂量依赖性(P＜0.001);10-9mol/L孕酮诱导12～24 h促进TGF-β1、TGF-β2蛋白质分泌,呈时间依从性.结论孕激素可能通过诱导成骨细胞TGF-β1、TGF-β2表达,促进成骨细胞增殖与分化,增强成骨功能及骨基质合成,促进骨形成.     

MC3T3E1细胞分化过程中Cbfα1及相关基因的表达

目的 研究在小鼠前成骨细胞MC3T3E1诱导成骨过程中，总Cbfα1、Cbfα1两种亚型Cbfα1／P56、Cbfα1／P57及碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙素、骨涎蛋白和骨桥素在前成骨细胞成熟过程中的变化。明确Cbfα1、Cbfα1亚型及相关基因表达与成骨细胞分化的关系，探求与成骨细胞成熟更密切相关的Cbfα1亚型，为进一步的Cbfα1亚型研究提供基础。方法 MC3T3E1细胞在含β-甘油磷酸钠，抗坏血酸的培养基中培养22d，在细胞培养的不同时间（0，4，10，14，18，22d），用α-磷酸奈酚法测定碱性磷酸酶（ALP）活性；VanGieSon苦味酸酸性复红染色法染色细胞Ⅰ型胶原；茜素红染色观察矿化结节形成；半定量RT-PCR检测总Cbfα1mRNA及Cbfα1／P56、Cbfα1／P57mRNA和Ⅰ型胶原、骨钙素、骨涎蛋白、骨桥索mRNA的表达；用Western-blot检测Cbfα1蛋白的表达。结果 MC3T3E1细胞在β-甘油磷酸钠存在的情况下，培养第18d开始出现矿化，第22dⅠ型胶原染色及茜素红染色均观察到明显矿化结节形成。随MC3T3E1细胞的分化，Cbfα1mRNA的表达量逐渐增高，Cbfα1／P57mRNA在第18和22d的表达量明显增高，Cbfα1／P56mRNA无变化。Cbfα1蛋白随MC3T3E1细胞的分化，表达量逐渐增高。同样，随MC3T3E1细胞分化，Ⅰ型胶原、骨钙素、骨桥素和骨涎蛋白mRNA的表达量逐渐增高。ALP活性0～10d逐渐增高，10d后逐渐下降。结论 在MC3T3E1细胞的分化过程中Ⅰ型胶原、骨钙素、骨涎蛋白、骨桥素mRNA随MC3T3E1细胞的分化表达逐渐增高。Cbfα1 mRNA及Cbfα1蛋白的表达随细胞的分化逐渐增高，与其他成骨特异性基因的变化趋势一致，并以Cbfα1／P57mRNA亚型为主。Cbfα1／P57亚型的表达与成骨分化的关系更密切，在进一步的与成骨细胞分化有关的Cbfα1亚型研究应以Cbfα1／P57亚型为主。