人SUMO1蛋白表达纯化及单克隆抗体的制备、鉴定

目的 表达重组人SUMO1(small ubiquitin-related modifier 1)蛋白并制备单克隆抗体.方法 构建含人SUMO1基因的重组表达质粒pET32a-HIS-SUMO1,在大肠杆菌中表达重组蛋白HIS-SUMO1;以纯化后的HIS-SUMO1蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术,通过ELISA和Western blot方法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,用免疫双向扩散法鉴定抗体Ig的类型及亚类;取一株筛选细胞按照常规方法制备腹水,利用Millipore抗体纯化试剂盒进行抗体纯化,Western blot方法检测抗体效价.结果 表达纯化了重组人HIS-SUMO1蛋白;3株稳定分泌特异性抗人SUMO1的单克隆抗体杂交瘤细胞株被筛选出,其免疫球蛋白类型均为IgG1类;通过腹水制备和纯化获得效价较高的鼠抗人SUMO1单克隆抗体.结论 通过表达纯化人SUMO1重组蛋白,制备出高效价鼠抗人SUMO1的单克隆抗体,该抗体可用于蛋白质SUMO化的研究.     

鼠抗人PD-L1单克隆抗体的研制和生物学活性鉴定

目的 研制鼠抗人PD-L1功能性单克隆抗体,并对其生物学活性进行鉴定.方法 以前期原核表达的人硫氧还原蛋白-（PD-L1）融合蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术进行细胞融合,Western-Blot和酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选阳性杂交瘤细胞,竞争抑制法ELISA实验鉴定抗体的特异性亲和力,小鼠腹水法作大量抗体制备.结果 获得4株能够稳定分泌特异性抗PD-L1抗体的杂交瘤细胞,经验证所分泌的抗体具有较强的特异性亲和力,经过大量抗体制备和纯化获得效价大于1∶32000的纯化抗体;同时获得1株能稳定分泌抗硫氧还原蛋白抗体的杂交瘤.结论 成功制备了鼠抗人PD-L1单克隆抗体,为下一步应用研究奠定了基础.     

HCA518的蛋白表达、纯化和单克隆抗体的制备

目的:对HCA518蛋白进行表达和纯化,并制备HCA518蛋白的单克隆抗体。方法:采用基因重组技术在原核系统表达HCA518蛋白,金属镍螯合的Ni-NAT亲和层析柱进行蛋白纯化;杂交瘤技术建立分泌HCA518单克隆抗体的杂交瘤细胞株;ELISA方法进行单克隆抗体细胞株的筛选;Westem blot方法鉴定单克隆抗体的特异性;免疫荧光法对HCA518蛋白进行定位。结果:成功表达和纯化了HCA518重组蛋白,其纯度达98％。共筛选出2株分泌HCA518单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备腹水并纯化了HCA518的单克隆抗体,腹水中单克隆抗体的效价分别为1×10-4、5×10-4,属于IgG2b亚型和IgM,该抗体能与重组蛋白和肿瘤细胞核蛋白(P100)发生特异性反应,免疫荧光显示HCA518蛋白主要定位于细胞核中。结论:建立了稳定分泌HCA518单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备的单克隆抗体特异性好,对进一步应用于检测肿瘤组织中HCA518蛋白和判断肿瘤细胞的恶性增生程度预测肿瘤预后具有重要的实用价值。     

抗人生长转化因子15单克隆抗体制备及鉴定

目的:制备抗人生长转化因子15(GDF15)单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:构建GDF15原核表达载体pGEX-4T-2-gdf15,诱导表达并纯化GST-GDF15融合蛋白。以该融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取小鼠的脾细胞与同系小鼠Sp2/0骨髓瘤细胞常规融合,依次进行阳性杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆,最终获得稳定分泌抗GDF15 mAb杂交瘤细胞株。以间接ELISA法检测抗体效价;Western blot鉴定抗体特异性;免疫共沉淀法初步检测在肝癌患者血清中GDF15表达水平。结果:获得1株稳定分泌抗人GDF15 mAb杂交瘤细胞株,命名为9G3;抗体免疫球蛋白亚类为IgG1,轻链为κ型;免疫共沉淀及质谱分析证实抗GDF15 mAb9G3能与肝癌患者血清中GDF15蛋白特异性结合并且GDF15水平在肝癌患者血清中较正常人显著升高。结论:成功制备了抗人GDF15mAb,为后期肝癌早期诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础。     

C-myc单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备与鉴定鼠抗C-myc蛋白单克隆抗体。方法利用C-myc蛋白做免疫原免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,经间接ELISA法筛选、有限稀释法克隆、单克隆抗体Ig亚型鉴定,获得2株能够稳定分泌抗C-myc特异性抗体的杂交瘤细胞株,再将杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔诱使小鼠产生腹水。结果获得2株可稳定分泌抗C-myc抗体的杂交瘤细胞株,命名为SHH-1H11,SHH-2A9,Ig亚型分别为IgG1亚类和IgM。细胞培养上清效价分别为1:10240、1:5 120;小鼠腹水效价分别为1:64 000、1:32 000。结论制备的C-myc单克隆抗体仅与C-myc蛋白反应,与其他蛋白没有交叉反应,表明获得的单克隆抗体的特异性很高。     

抗CMG2单克隆抗体的制备及其初步应用

目的制备鼠抗人毛细血管形态发生基因2(CMG2)单克隆抗体,并将其初步应用于胃癌组织和细胞系中CMG2表达的检测。方法重组表达CMG2胞外区肽段,免疫Balb/c小鼠,常规制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA方法筛选目标克隆,制备小鼠腹水并经蛋白A亲和纯化获得相应抗体。间接ELISA法鉴定抗体的亚类类型及亲和力;抗原竞争性抑制实验鉴定抗体的特异性。用候选抗体建立流式细胞术、免疫荧光、免疫印迹及免疫组织化学方法,初步应用于胃癌组织和细胞系中CMG2表达的检测。结果共获得3株针对CMG2胞外区的杂交瘤细胞株,其中以8F3单克隆抗体的亲和力和特异性最好,亚型为Ig G1。8F3单抗能用于胃癌细胞株CMG2表达的流式细胞术和免疫荧光检测以及胃癌组织的免疫组织化学检测。结论成功制备出高效价高特异性的鼠抗人CMG2单克隆抗体,为CMG2的基础和临床应用研究提供了有用工具。     

抗人双特异性蛋白磷酸化酶Dusp23单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备高亲和力、高特异性的抗人双特异性磷酸化酶23（Dusp23）单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定,为Dusp23功能的研究奠定基础。方法以纯化的原核表达Dusp23为免疫原,免疫BALB／c小鼠。待免疫小鼠血清效价满足融合需要,取其脾细胞与Sp2／0细胞融合,经多次筛选及克隆化建立可稳定分泌抗Dusp23单克隆抗体的杂交瘤细胞株,将细胞株打入BALB／c小鼠腹腔制备腹水,用ProteinG亲合层析柱纯化所得腹水获得纯化抗体,ELISA及Western—blot检测抗体的效价和亲和力,并用亚型鉴定试纸条鉴定单克隆抗体的亚型。利用纯化后的两株单克隆抗体对临床收集的肝癌组织标本进行免疫组化分析。结果筛选到2株（N012和N013）可以稳定分泌人双特异性磷酸化酶23（Dusp23）单克隆抗体的细胞株,并对其进行纯化和鉴定,两株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1：5120和1：2560,腹水效价分别为1：25600和1：12800,以肝癌细胞HepG2和重组Dusp23蛋白为抗原,利用纯化后的两株抗体Western-blot鉴定结果均在预期位置出现阳性条带。两株杂交瘤细胞分泌抗体的亚型鉴定N012和N013均为IgG1型,轻链均为K型。两株抗体分别与临床肝癌组织标本免疫组化结果均为阳性。结论成功制备两株能特异性识别Dusp23的单克隆抗体,为进一步研究Dusp23的生物学功能,揭示其与肿瘤发生发展之间的关系奠定了基础。     

PCGF1蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备与鉴定

目的:原核表达人表观抑制因子Polycomb家族成员PCGF1蛋白片段,并制备其鼠源单克隆抗体(mAb)。方法:应用PCR技术扩增人PCGF1基因编码区部分序列(CDS区第382～567bp的DNA片段)并插入到pET-32a(+)质粒中,在大肠杆菌BL21中进行His-PCGF1-128/189融合蛋白(简写为His-N128/189)的原核表达。利用所表达的融合蛋白中含有的6×His标签进行亲和层析纯化。用所获得的纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术,分别通过ELISA和Western blot法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,用免疫双向扩散法鉴定mAb的Ig亚类。取1株杂交瘤细胞按照常规方法制备腹水,利用Millipore公司的mAb纯化试剂盒纯化mAb,用Western blot法检测mAb的效价。结果:表达纯化了重组人His-N128/189蛋白;筛选出2株可稳定分泌特异性抗人PCGF1 mAb的杂交瘤细胞株,其免疫球蛋白类型均为IgG1类;通过腹水制备和纯化获得高效价(1∶6000)、高特异性的鼠抗人PCGF1 mAb。结论:原核表达的PCGF1片段融合蛋白可以被纯化,并具有足够的蛋白免疫原性,所制备的相应mAb可特异识别内源性和外源性PCGF1蛋白,可以运用于PCGF1基因功能的研究。     

Pfs25蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA的建立

目的:制备恶性疟原虫子孢子囊表面膜蛋白Pfs25的单克隆抗体( mAb),建立检测Pfs25蛋白的双抗体夹心ELISA方法.方法:纯化毕赤酵母表达的重组Pfs25蛋白,并免疫BALB/c小鼠,采用骨髓瘤细胞Sp2/0与免疫BALB/c鼠脾细胞杂交的细胞融合技术,通过间接ELISA检测获得分泌抗Pfs25抗体的阳性杂交瘤细胞株,通过免疫F1鼠诱生腹水,纯化腹水,并进行mAb的各项生物学鉴定.辣根过氧化物酶(HRP)标记纯化后的抗体,以4B7为包被抗体,1B4为酶标抗体,建立了双抗体夹心ELISA法.结果:获得3株抗Pfs25的杂交瘤细胞株,其中2株有良好的稳定性和特异性.并建立了双抗体夹心ELISA检测法,检测有效范围在0.07～1 mg/mL,其检测灵敏度为41.6 ng/mL.结论:成功制备抗Pfs25蛋白的单克隆抗体,并建立了一种可用于Pfs25蛋白检测的双抗体夹心ELISA法,为Pfs25蛋白制备传播阻断型疟疾疫苗奠定了基础.     

抗狂犬病病毒CVS-11株单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备抗狂犬病毒单克隆抗体,为建立快速准确的狂犬病毒抗原检测方法奠定基础.方法 将狂犬病病毒CVS-11株纯化浓缩后免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经细胞克隆和间接ELISA筛选,获得稳定分泌抗狂犬病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株.小鼠腹腔注射法制备大量单克隆抗体并测定腹水效价,用G蛋白亲和层析柱进行纯化,间接ELISA法和间接荧光法鉴定单克隆抗体的类型、特异性及敏感性.结果 细胞融合率达100%,经克隆筛选获4株稳定分泌抗狂犬病病毒抗体的杂交瘤细胞株,其腹水效价分别为1×104,1×105,1×104和1×105;4株单抗均为IgG类型且特异性好.结论 制备的单抗具有良好特异性和敏感性.     

抗Ig融合蛋白Fc段单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究

目的：制备并鉴定抗Ig融合蛋白Fc段的单克隆抗体(mAb)，建立用于检测Ig融合蛋白的夹心ELISA法和纯化Fc融合蛋白的亲和层析法。方法：以hBCMA—Ig融合蛋白为抗原免疫BALB／c小鼠，通过细胞融合制备抗Fc段mAb，用ELISA等方法鉴定mAb的Ig亚类、表位以及种属特异性，建立用于检测Ig融合蛋白的夹心ELISA法;Western blot检测mAb对变性Ig融合蛋白的反应性。将mAb与Sepharose4B交联，制备亲和层析柱，对LAIR1-Ig融合蛋白进行纯化。结果：获得7株稳定分泌抗Fc段mAb的杂交瘤(FMUFcl-FMUFc7)。利用FMUFc4作为包被mAb，FMUFc5作为酶标记mAb，成功地建立了检测Ig融合蛋白的ELISA法，敏感度达到2μg／L；在7株mAb中，FMUFc6可用于Ig融合蛋白的western blot检测。用FMUFc 6mAb制备的亲和层析柱，可有效地纯化LAIRl—Ig融合蛋白。结论：成功地制备了抗Ig融合蛋白Fc段的mAb，建立了可用于Ig融合蛋白检测和纯化的方法，为Ig融合蛋白的应用提供了有力手段。     

LAIR-1/LAIR-2(CD305/CD306)推定配体分布的研究

目的：研究LAIR-1（CD305）及LAIR-2（CD306）推定配体在多种细胞系上的分布，为鉴定LAIR-1／LAIR-2推定配体提供了实验依据。方法：建立稳定表达LAIR-1-Fc和LAIR-2-Fc融合蛋白的细胞系。以纯化的融合蛋白进行活细胞免疫荧光染色，用流式细胞仪检测LAIR-1及LAIR-2推定配体在多种细胞系膜表面的表达，并比较LAIR-1和LAIR-2推定配体的分布及可能结合的位点。结果：LAIR-1推定配体及LAIR-2推定配体均在人羊膜来源的上皮细胞系WISH上高表达，在人黑色素瘤细胞系C32、人胚肾上皮细胞系293T及人脐静脉内皮细胞系ECV304上有一定程度的表达。LAIR-1-Fc和LAIR-2-Fc融合蛋白与推定配体的结合，可分别被可同时识别LAIR-2和LAIR-1的单克隆抗体（mAb）FMU-LAIR-2．2和FMU-LAIR-2．1阻断。结论：LAIR-1推定配体及LAIR-2推定配体的分布基本一致，主要表达于WISH、C32、293T和ECV304细胞系。LAIR-1和LAIR-2可能拥有共同的配体。     

抗多囊蛋白1氨基端单克隆抗体的制备和鉴定

目的 :用杂交瘤技术制备抗多囊蛋白 1胞外区氨基端的单克隆抗体 (mAb) ,并对其特异性进行鉴定。方法 :以肾组织总RNA为模板 ,用RT PCR扩增多囊蛋白 1胞外区氨基端的编码基因PKD1cDNA。将该基因克隆到融合蛋白表达载体pQE3 0中 ,转染大肠杆菌M15。以异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达多囊蛋白 1胞外区氨基端的组氨酸融合蛋白 (PC1 e2 ) ,用亲和层析法纯化。以纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠 ,取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株Sp2 / 0进行细胞融合 ,间接ELISA筛选阳性克隆 ,有限稀释法进行单克隆化。mAb的特异性用间接ELISA和Westernblot鉴定。结果 :克隆到两个编码多囊蛋白 1氨基端的cDNA片段 (50 2bp和 471bp)。构建的表达质粒经酶切和DNA测序证实 ,为所需要的质粒。表达出相对分子质量 (Mr)分别为 1980 0和 1890 0的融合蛋白 ,经Westernblot鉴定 ,均为多囊蛋白 1的融合蛋白。用Mr 为 1890 0的融合蛋白免疫小鼠 ,得到杂交瘤细胞株 7B1。Westernblot分析表明 ,该细胞株分泌的mAb能特异地与多囊蛋白 1氨基端结合。结论 :本实验表达了PKD1多拷贝区所编码的PC1 e2 ,成功地制备了抗多囊蛋白 1胞外区N端的mAb。     

T7噬菌体衣壳蛋白P11的原核表达、纯化及其单克隆抗体的制备

目的:表达、纯化T7噬菌体衣壳蛋白P11,并制备其单克隆抗体(mAb).方法:克隆并表达T7噬菌体P11蛋白,其氨基端带有6-His标签.纯化后的蛋白免疫BALB/e小鼠,经融合、筛选制备特异性mAb.结果:成功表达了P11蛋白. SDS-PAGE显示所表达蛋白的相对分子质量(Mr)约为27 000.获得了1株稳定分泌抗P11抗体的杂交瘤细胞株(2G11),其分泌的mAb的Ig亚类(型)为IgG2b.ELISA检测,对应腹水mAb的效价为1∶8.1×105.Western blot结果显示抗P11mAb具有良好的特异性.结论:成功地制备了P11蛋白及其mAb.     

制备单克隆抗体检测PES1的表达

目的:制备PES1单克隆抗体(mAb)并用所制备的抗体检测PES1在多种肿瘤细胞中的表达及其在成年大鼠不同组织中的表达分布。方法:纯化GST-PES1(1-322aa)融合蛋白后注入小鼠进行免疫,经过细胞融合、筛选以及用Western blot进行特异性鉴定后获得mAb。再用制备的mAb检测PES1在不同的人肿瘤细胞和大鼠不同组织中的表达。结果:所制备的PES1 mAb能特异地识别PES1。用所制备的mAb检测发现,在所检测的人乳腺癌、卵巢癌、肝癌以及肺癌等细胞中均有不同程度的表达;PES1类似物pescadillo在大鼠的乳腺和卵巢组织中表达,但在其他组织中没有被检测到。结论:成功地制备了PES1的mAb。PES1可能与肿瘤的发生发展有一定的关系;由于PES1明显表达于雌激素重要的靶器官,所以可能参与雌激素信号通路。     

免疫亲和层析纯化大肠癌相关抗原

目的 :从培养的大肠癌细胞Hce 86 93中分离纯化并鉴定大肠癌相关抗原。方法 :利用流式细胞术选择高表达大肠癌相关抗原的大肠癌细胞系 ,分别用单去污及三去污裂解液裂解细胞。然后用 5株抗大肠癌单克隆抗体 (mAb)CYL 1～CYL 5进行Westernblot,分析与大肠癌细胞结合反应最强的mAb。以此mAb作为配基进行亲和层析纯化大肠癌相关抗原 ,纯化结果利用Westernblot法进行鉴定。结果 :大肠癌细胞系Hce 86 93上相关抗原的表达量最高 ;抗大肠癌mAbCYL 2与Hce 86 93的结合力最强。纯化所获与CYL 2特异结合的大肠癌相关抗原 ,Mr 约为 13× 10 3 。该抗原由Mr 为 6 0× 10 3 和70× 10 3 两种亚基组成。结论 :利用mAbCYL 2进行亲和层析 ,从大肠癌细胞系Hce 86 93中获得纯化的肿瘤相关抗原。     

人CD112(Nectin2/PRR2)单克隆抗体的制备和鉴定

目的：表达和纯化CD112 胞膜外区重组蛋白, 制备针对CD112胞膜外区的单克隆抗体（mAb）, 并且研究CD112的分布.方法：采用基因重组技术在真核系统表达CD112-Fc融合蛋白, 亲和层析法进行蛋白纯化;纯化的CD112-Fc融合蛋白免疫BALB/c小鼠, 杂交瘤技术建立分泌CD112 mAb的杂交瘤细胞株, 间接ELISA、 Western blot及FCM鉴定mAb 的特异性.用流式细胞术（FCM）检测 CD112 的细胞系分布.结果：构建了高效真核表达载体pIg3C-CD112, 表达并纯化了CD112-Fc融合蛋白, 其纯度大于 90%.以纯化重组蛋白为免疫原共制备9株分泌抗CD112 mAb的杂交瘤细胞株（命名为FMU-CD112.1 ～FMU-CD112.9）, 制备腹水并纯化 mAb.FMU-CD112.1、 3、 6和8能用于Western blot, FMU-CD112.1、 4、 6和8可用于 FCM.CD112细胞分布检测显示该分子主要分布在正常上皮及内皮细胞系、巨核细胞谱系和部分T细胞系, 并高表达于上皮及内皮来源的肿瘤、胶质瘤等细胞系.结论：成功地表达纯化了CD112-Fc融合蛋白并建立了稳定分泌CD112 mAb的杂交瘤细胞株, 为CD112的功能研究打下坚实的基础.     

乙型脑炎病毒prM蛋白单克隆抗体的制备

目的 克隆日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)前膜蛋白(prM)编码基因,原核表达、纯化prM蛋白,以纯化产物为免疫原制备单克隆抗体(mAb);方法从感染JEV病毒的鼠脑中克隆编码JEV prM蛋白的基因并将其克隆入原核表达载体pET32a,转化大肠埃希菌BL21(DE3)LvsS后以IPTG诱导表达.表达产物经Ni-NTA纯化后进行SDS-PAGE分析.用纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合和亚克隆后筛选出能分泌识别prM蛋白的mAb的杂交瘤细胞株.用Western Blot和免疫组化方法检测单克隆抗体的特异性.结果 从鼠脑中克隆出约500 bp的JEV prM基因,将其克隆入原核表达载体中,在大肠埃希菌中获得了较好表达.纯化的prM蛋白免疫BALB/c小鼠,经传统细胞融合及筛选方法制备出单克隆抗体,抗体滴度为105.ELISA、Western Blot和免疫组化检测结果证实该株单抗具有较好的特异性.结论 成功的表达和纯化了日本乙型脑炎病毒的prM蛋白,并完成了单克隆抗体的制备,为乙型脑炎病毒感染的早期诊断及预防的研究奠定了良好的基础.