组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡及其逆转耐药的机制研究

目的 探讨新一代组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589单药或联合蛋白酶体抑制剂硼替佐米对多发性骨髓瘤(MM)细胞增殖的影响及其机制.方法 以MM细胞系U266细胞及地塞米松耐药细胞系MMlR细胞为对象,不同浓度LBH589或LBH589与硼替佐米联合作用上述细胞后,采用MTT法检测对细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率的变化,Western blot分析组蛋白H4乙酰化程度及聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)、Bcl-X蛋白表达水平的变化;实时荧光定量PCR分析caspase-3、APAF-1以及TOSO基因表达水平的变化.结果 不同浓度LBH589(0、10、20、50 nmol/L)单药及其50 nmol/L LBH589与硼替佐米(10、20 nmol/L)联合均能够抑制U266和MM1R细胞增殖,呈剂量和时间依赖性,且LBH589与硼替佐米联合组抑制作用均较单药组明显(P值均＜0.05);MM1R细胞G0/G1期比例分别为36.60％、46.50％、51.40％、57.10％、75.48％、79.73％,凋亡率分别为5.27％、31.41％、39.78％、44.07％、73.60％、83.27％,作用呈剂量依赖性,且LBH589与硼替佐米联合组作用均较两者单药组明显(P值均＜0.05);MM1R细胞组蛋白H4乙酰化程度和PARP蛋白表达水平逐渐上调,而Bcl-X蛋白表达水平则逐渐下调,变化呈剂量依赖性(P值均＜0.05);MM1R细胞caspase-3、APAF-1基因表达水平逐渐上调,而TOSO基因表达水平则逐渐下调,变化呈剂量和时间依赖性(P值均＜0.05).结论 LBH589能够抑制MM细胞增殖,阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡,对耐药细胞具有抗耐药作用,同时与硼替佐米联合应用对MM细胞有协同作用,其作用机制及逆转耐药机制涉及多个基因的表达变化.     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA诱导骨髓瘤细胞的凋亡

背景：SAHA是一种新型的组蛋白去乙酰化酶抑制剂,目前有关其对多发性骨髓瘤细胞作用的研究还少见报道,而且其诱导细胞凋亡的分子机制还不十分清楚。目的：观察SAHA对多发性骨髓瘤细胞株U266细胞增殖和凋亡的影响,并分析其可能机制。方法：采用锥虫蓝拒染法、四氮唑蓝比色法检测SAHA对U266细胞增殖的影响。AllllexinV和PI染色后应用流式细胞仪检测SAHA作用U266细胞的凋亡率,Hoechst33342染色法检测凋亡细胞的形态。Western-blot方法检测信号转导通路Ras/Raf/Mek/Erk相关蛋白的表达水平。结果与结论：锥虫蓝拒染法和四氮唑蓝比色法均显示,SAHA可明显抑制U266细胞增殖,且具有时间剂量依赖性。0.5,2,4μmol/L SAHA作用U266细胞48h后,经流式细胞仪检测细胞凋亡率分别为（17.61±1.30）%,（43.13±3.80）%和（74.01±4.39）%,呈剂量依赖性（P〈0.05）。Hoechst33342染色荧光显微镜下可见,SAHA组细胞胞核出现明显的核固缩、核碎裂,而对照组改变不明显。Western-blot结果显示U266细胞经SAHA处理后,Raf-1和Erk蛋白的磷酸化水平受到明显抑制,药物作用48h时出现显著降低。提示SAHA抑制多发性骨髓瘤细胞株U266细胞增殖并诱导凋亡,信号转导通路Ras/Raf/Mek/Erk阻断是机制之一。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂治疗多发性骨髓瘤的研究进展

多发性骨髓瘤(MM)是恶性浆细胞肿瘤,近年来发现组蛋白去乙酰化酶(HDAC)在MM中呈过表达,并且出现HDAC过表达的MM患者预后常较差.蛋白的乙酰化可参与多种生物学过程.组蛋白乙酰化转移酶(HAT)和HDAC可使正常机体内乙酰化水平保持动态平衡.组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACI)是近年来出现的治疗MM的新型靶向药物,其治疗MM的疗效在大量临床试验中已经得到证实.笔者拟就HDACI治疗MM的研究进展进行综述.     

Xbp-1基因沉默对硼替佐米诱导人多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响

本研究旨在探讨xbp-1基因沉默对硼替佐米诱导骨髓瘤细胞株NCI-H929(H929)凋亡的影响。通过小发夹RNA(shRNA)干扰xbp-1基因表达,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测靶细胞凋亡率,采用Wes-ternblot检测XBP-1蛋白水平。结果表明:通过慢病毒载体PLL3.7介导的xbp-1 shRNA表达,能有效抑制H929细胞XBP-1蛋白表达,xbp-1 shRNA表达细胞的凋亡率显著高于对照组[(10.13±0.61)%vs(2.5±0.2)%,p0.05];经硼替佐米处理后,xbp-1基因功能缺陷的H929细胞的凋亡率显著高于空载体组[(45.07±1)%vs(2.73±0.25)%,p0.05]。结论:xbp-1基因沉默能够显著增强硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞的促凋亡活性。     

硼替佐米联合地塞米松治疗多发性骨髓瘤的临床研究

本研究观察硼替佐米治疗多发性骨髓瘤的疗效及不良反应。7例初治患者均采用硼替佐米联合地塞米松治疗；另3例复发难治患者中2例采用硼替佐米联合地塞米松，1例同时加用米托蒽醌和沙利度胺治疗。结果显示，根据EMBT标准判定疗效，7例初治患者中1例完全缓解（CR），5例部分缓解（PR），1例轻微缓解（MR）；3例复发难治患者中2例部分缓解（PR），1例轻微缓解（MR）。总缓解率（CR＋PR）80％。3例患者在治疗过程中出现血小板减少，1例出现腹泻，1例足部麻木，经对症处理后均恢复。结论：硼替佐米治疗初发及复发难治多发性骨髓瘤均有较好的疗效，对治疗相关的副反应患者可耐受。     

2-甲氧基雌二醇联合硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响

目的 探讨2-甲氧基雌二醇(2-ME2)联合硼替佐米的抗多发性骨髓瘤(MM)效应及与聚集小体(aggresome)形成之间的相关性.方法 以MM细胞系RPMI 8226、NCI-H929、U266、SKO-007细胞作为研究对象,采用硼替佐米单药或联合2-ME2处理,通过等效应线图法分析两者是否具有抗MM协同效应;通过免疫荧光技术在同一组细胞群中研究聚集小体阳性和阴性细胞的凋亡情况.结果 ①硼替佐米呈浓度和时间依赖性地显著提高聚集小体阳性细胞比例,且聚集小体几乎全部出现于非凋亡细胞中.②等效应线图法分析显示一定浓度范围的硼替佐米与2-ME2联合具有显著的协同作用.③硼替佐米与2-ME2联合应用后聚集小体阴性的凋亡细胞显著增多而聚集小体阳性的非凋亡细胞明显减少.在RPMI 8226及U266细胞中,硼替佐米单药与联合用药组相比,聚集小体阴性的凋亡细胞分别由(14.5±2.6)%及(20.1±2.9)%增加至(80.7±6.9)%及(71.6±6.2)%;聚集小体阳性的非凋亡细胞分别由(75.3±5.7)%及(69.1±8.6)%减少到(13.8±3.8)%及(19.5±4.2)%.结论 硼替佐米诱导生成的聚集小体对MM细胞具有保护作用;2-ME2通过抑制聚集小体途径可以显著增强硼替佐米的抗MM效应.     

自噬抑制剂ROC-325抗多发性骨髓瘤作用的研究

目的:探讨自噬抑制剂ROC-325对人多发性骨髓瘤细胞株增殖、凋亡、自噬的影响及其与硼替佐米联合用药的细胞学效应.方法:不同浓度的ROC-325作用于骨髓瘤细胞,用CCK-8法检测药物对细胞增殖的作用,用Caspase-3/7、Caspase-9活性测定法检测药物对细胞凋亡的影响,用单丹磺酰戊二胺染色观察自噬小体数量,...     

硼替佐米治疗多发性骨髓瘤的护理

[目的]总结硼替佐米治疗多发性骨髓瘤的临床护理经验。[方法]对20例多发性骨髓瘤病人应用硼替佐米联合地塞米松方案进行治疗,做好心理护理、用药护理、药物不良反应的护理。[结果]20例病人有10例完全缓解,8例部分缓解,2例轻微反应。出现的不良反应主要有疲乏、胃肠道反应、周围神经病变、骨髓抑制、带状疱疹。[结论]硼替佐米治疗多发性骨髓瘤有较好的疗效,加强不良反应的护理能顺利完成治疗。     

蛋白酶体抑制剂协同组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导T细胞淋巴瘤凋亡及其与蛋白聚集体关系的研究

本研究探讨蛋白酶体抑制剂硼替唑米（bortezomib）和组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA）对T淋巴瘤细胞株Jurkat和Hut78的协同诱导凋亡作用,以及两药联合对蛋白聚集体形成的影响。硼替唑米（10nmol／L）单药或硼替唑米（10nmol／L）联合SAHA（2μmol／L）处理Jurkat和Hut78细胞,应用台盼蓝拒染法计数细胞生长抑制率;细胞涂片观察细胞形态学改变;流式细胞术检测细胞凋亡变化;透射电子显微镜观察细胞凋亡和聚集体形成的超微结构特征。研究结果表明,与对照组和单用硼替唑米组比较,两药合用能够显著抑制Jurkat和Hut78细胞生长,促进细胞凋亡。流式结果显示,两药舍用组的Jurkat和Hub78细胞凋亡细胞比例分别为（41．8±4．7）％和（72．7±11．7）％,显著高于对照组[（3．6±1．3）％和（7．0±1．9）％]和单用硼替唑米组[（6．3±2．3）％和（18．7±9．2）％]（P均〈0．01）。超微结构显示,单用硼替唑米组细胞内多为典型的聚集体结构,两药合用组细胞内聚集体密度降低,数量减少甚至消失,且凋亡细胞明显增多。结论：蛋白酶体抑制剂联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂能有效诱导T淋巴瘤细胞凋亡,两药具有协同作用。硼替唑米促进聚集体形成,SAHA能破坏聚集体结构,是增强硼替唑米促凋亡效应的可能机制之一。     

硼替佐米治疗多发性骨髓瘤的应用进展

多发性骨髓瘤(MM)作为中老年常见的血液肿瘤之一,预后相对较差,常规化学疗法(化疗)疗效欠理想。硼替佐米作为一种新药,属于蛋白酶体抑制剂,通过全新的机制达到抗骨髓瘤的作用。国内外临床研究表明硼替佐米单药以及同常规化疗药物组成的联合化疗方案对初始治疗,以及复发难治的MM患者均有良好疗效。因此以硼替佐米为主的联合化疗方案已被美国国家综合癌症协作网推荐作为MM患者治疗的重要选择之一。现将硼替佐米在MM治疗上的进展作一综述。     

丙戊酸钠抑制人多发性骨髓瘤U266细胞增殖及组蛋白乙酰化调控的研究

本研究探讨丙戊酸钠（valproic acid sodium,VPA）对U266细胞增殖的抑制作用及对组蛋白乙酰化修饰调控的影响。采用CCK-8法检测VPA对U266细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测VPA作用前后U266细胞周期的变化,半定量RT—PCR检测VPA作用后U266细胞中组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）mRNA的表达变化,Western blot方法检测VPA作用后HDAC1及组蛋白H3、H4乙酰化蛋白水平的变化。结果表明,VPA对U266细胞增殖的抑制作用呈时间一浓度依赖性;2．5mmol／L的VPA处理细胞48小时后,细胞周期检测显示G0／G1期细胞比例增高,S期细胞比例下降,细胞被阻滞在G0／G1期（P〈0．05）;RT—PCR证实VPA能够抑制HDAC1mRNA的表达水平;Western blot方法证实不同浓度VPA作用细胞48小时后HDAC1蛋白水平降低,组蛋白H3、H4乙酰化表达水平提高。结论：VPA能够抑制U266细胞增殖,使细胞阻滞于G0／G1期,这可能与VPA抑制HDAC1表达,上调组蛋白H3、H4乙酰化水平有关。     

异硫氰酸苯己酯诱导骨髓瘤细胞凋亡的实验研究

为了评价异硫氰酸苯己酯（phenylhexly isothiocyanate,PHI）体外对骨髓瘤细胞RPMI8226增殖和分化的影响,用不同浓度的PHI与RPMI8226细胞共同孵育,用原位末端标记法（TUNEL）检测PHI处理后细胞凋亡,流式细胞术分析PHI处理后的细胞周期变化;以JC-1为探针,检测PHI处理后瘤细胞线粒体膜电位的变化,用定量夹心ELISA方法检测PHI处理后瘤细胞分泌血管内皮生长因子（VEGF）的变化。研究结果显示,PHI在低浓度（0.5μmol/L）时显著抑制瘤细胞增殖,诱导瘤细胞发生凋亡,抑制效应与PHI浓度有关,PHI处理后细胞生长停滞在G0/G1期。用10μmol/LPHI处理瘤细胞48小时后,线粒体去极化和膜电位丢失较对照组增加3-4倍,瘤细胞分泌VEGF显著减少,仅为对照组的35%。结论：PHI在体外能够抑制骨髓瘤细增殖,诱导细胞凋亡;细胞凋亡的发生与线粒体去极化和膜电位丢失有关,PHI抑制瘤细胞VEGF的分泌可能是引起细胞凋亡原因之一,PHI是一种潜在的骨髓瘤的治疗药物。     

醋酸棉酚诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡及其机制的实验研究

本研究探讨醋酸棉酚对经典人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226的作用及其机制。采用四唑盐比色试验（MTT）、细胞形态学观察、流式细胞仪检测、DNA电泳、Western—blot等方法分剐观察醋酸棉酚对RPMI8226细胞的抑制增殖、诱导凋亡效应及其机制。结果表明：醋酸棉酚在〉16μmol／L浓度时可显著抑制RPMI8226细胞的增殖、促进其凋亡,随着剂量的增加以及时间的延长,效应越明显。研究还发现,醋酸棉酚是通过抑制线粒体膜电位（△ψm）、诱导Bax、Caspase-3等凋亡相关蛋白的表达来实现上述效应的。结论：醋酸棉酚对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞具有选择性抑制增殖、促进凋亡的效应。     

MEK抑制剂AZD8330对多发性骨髓瘤抗肿瘤作用的初步研究

本研究探讨MEK抑制剂AZD8330对多发性骨髓瘤细胞IM9及NCI-H929细胞增殖、凋亡的影响及其可能的作用机制.使用不同浓度AZD8330处理NCI-H929及IM9细胞48 h,用CCK-8检测细胞活力,并计算出48 h的IC50;分别用5、10及100 nmol/L的AZD8330处理上述两种细胞,然后用PI标记流式细胞术分析细胞周期的变化;Western blot方法检测细胞周期相关蛋白cyclin D及cyclin E;分别用10、100、1000及2000 nmol/L的AZD8330处理骨髓瘤细胞,AnnexinV/7-AAD双标记法分析细胞凋亡,并应用Western blot方法检测凋亡相关蛋白caspase-3.结果表明,AZD8330可显著抑制NCI-H929及IM9的细胞活力,且抑制效应呈一定的时间和剂量依赖性,IM9细胞48 h的半数抑制浓度（IC50）为19.88±2.7 nmol/L,NCI-H929细胞48 h的半数抑制浓度（IC50）为29.3±2.03 nmol/L.细胞周期结果显示,两种骨髓瘤细胞均发生G1期阻滞;AZD8330处理后cyclin D水平显著增高,但是cyclin E水平降低,促使细胞发生G1期阻滞.AnnexinV/7-AAD结果显示,随着AZD8330浓度增加,细胞凋亡数量也相应增多,并且活化的caspase-3蛋白水平增高.结论：MEK抑制剂AZD8330可有效抑制骨髓瘤细胞NCI-H929和IM9的增殖,使细胞周期阻滞于G1期,并促进细胞发生凋亡.     

硼替佐米和柔红霉素联合应用对多发性骨髓瘤细胞株KM3的作用

为了研究硼替佐米（bortezomib,Bor）单用及与柔红霉素（daunorubicin,DNR）联合应用对多发性骨髓瘤（multiple mydoma,MM）细胞株KM3细胞的抑制作用,采用MTT法检测Bor单用及与DNR联合应用对KM3细胞的抑制作用,求出其IC50。结果表明：Bor、DNR对KM3细胞生长抑制作用呈浓度依赖性,IC50分别为0．27μmoL／L,0．16μmol／L;Bor联合DNR对KM3细胞生长抑制作用明显增强（P〈0．05）。结论：在体外,Bor联合DNR对KM3细胞生长抑制有协同作用。     

多发性骨髓瘤血管新生的体外研究

探讨多发性骨髓瘤细胞系培养上清液对人骨髓来源内皮细胞系(HBMEC)的增殖、迁移及血管新生的作用。用含2％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养液培养骨髓瘤细胞系获得上清液,将此培养液培养HBMEC,研究其时HBMEC的增殖及迁移的影响,并将此液放入含有携带HBMEC微珠的三维纤维蛋白中,研究其对血管新生的影响。结果表明,与含2％FBS的RPMI 1640培养液比较,骨髓瘤细胞系培养液对HBMEC的增殖有明显促进作用(P<0.001),并促进HBMEC的迁移,诱导毛细血管管腔的形成(长度及宽度)(P<0.001)。结论:骨髓瘤细胞系可能通过分泌某些细胞因子促进HBMEC增殖、迁移及血管新生。     

白桦脂酸对人多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226凋亡的诱导

为了探讨白桦脂酸对多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226的诱导凋亡作用,用MTT、Annexin—V／PI双标记流式细胞术、PI单标记流式细胞术和Hoechst33258染色分别检测白桦脂酸对RPMI一8226增殖抑制、凋亡诱导、细胞周期的作用和形态学变化.用RT—PCR技术检测加药后RPMI-8226凋亡相关基因bcl—xl和caspase3的表达的变化。结果表明：白桦脂酸对RPMI-8226作用24和48小时的Ic50值分别为10．156±0．659和5．434±0．212ng／ml,在一定浓度范围内,白桦脂酸对其增殖的抑制作用呈时间和剂量依赖性。RPMI．8226细胞的凋亡率随药物浓度的增加而增加。细胞周期测定显示,随药物浓度的增加G0／G1期的细胞比例增高,处于S期的细胞比例减低,药物对G2／M期细胞影响不明显。Hoechst33258染色在荧光显微镜下可见药物处理组和对照组之间细胞形态的显著变化。RT—PCR测定示,随加药浓度的增加,bcl—xl基因的表达呈降低趋势,而caspase3基因的表达呈增高趋势。结论：在一定的浓度范围内,白桦脂酸可诱导RPMI-8226发生凋亡且呈时间剂量依赖性,该过程可能与其上调caspase3和下调bcl—xl基因的表达有关。白桦脂酸还可以影响RPMI-8226细胞系的G1／S期,使细胞阻滞在G0／G1期。     

多发性骨髓瘤细胞DNA含量和细胞周期分析

本研究探讨MM的遗传学背景和细胞增殖特点。应用直接免疫磁珠法分选19例多发性骨髓瘤（MM）患者的骨髓瘤细胞，用流式细胞术检测骨髓瘤细胞的DNA含量和细胞周期。结果表明：19例患者中4例骨髓瘤细胞为超二倍体，15例骨髓瘤细胞均为二倍体；正常人浆细胞处于S＋G2／M期细胞的比例为（1．15±0．60）％，MM患者骨髓瘤细胞处于S＋G2／M期细胞比例为（10．06±12．60）％，两组相比具有显著性差异（P=0．001）。初治组患者出现超二倍体比例为11．76％，复治组患者为100．00％，两组相比有显著性差异（p=0．035）；初治组骨髓瘤细胞处于S＋G2／M期的比例为（7．12±4．98）％，复治组为（35．10±32．56）％，两组相比有显著性差异（P=0．001）。结论：MM患者骨髓细胞DNA含量和细胞周期分布的变化提示了该病遗传背景的复杂性和细胞增殖的异常。而此与病程可能具有一定的相关性。