去除αGal抗原的猪红细胞输入猕猴体内的初步研究

目的探讨经α-半乳糖苷酶(AGL)去除了αGal抗原的猪红细胞输注给灵长类动物的可能性。方法使用AGL体外去除猪红细胞表面的αGal抗原,应用流式细胞术和配血试验检测修饰效果:用FITC标记此红细胞,将AGL酶解的pRBCs与未酶解的pRBCs分别输注给使用免疫抑制剂(眼镜蛇毒因子及地塞米松)预注射的猕猴;流式细胞仪检测计算输注红细胞在猕猴体内的存活率,同时检测受试猕猴的血生化及尿液指标。结果AGL有效清除了猪红细胞表面的αGal抗原,使其与猕猴血清的凝集反应减弱。未酶解的pRBCs在猕猴体内存活<0.5h。AGL酶解后的猪红细胞输注后2h在猕猴体内有29%存活,8h猕猴体内仍可检测到荧光标记的pRBCs。结论AGL能有效清除猪细胞表面的αGal抗原,减弱HAR,延长异种移植物的存活时间。     

猪红细胞血型抗原修饰异种输血的研究进展

异种器官移植所取得的突破性进展为异种输血的研究带来了曙光。人与猪的红细胞的血清学和生物化学特性有许多相似之处，因此猪就成为实现异种输血最具有可能性的红细胞供体，猪红细胞上存在异种抗原，包括αGal抗原和non-αGal抗原。αGal抗原和人血清中天然存在的抗αGal抗体结合后引起的免疫排斥反应在抗体介导的凝集反应中起主要作用。但是non-αGal抗原和人血清中天然存在的抗non-αGal抗体结合引起的免疫排斥反应作用也不能低估，经特定修饰，改造以及的猪红细胞，是来源丰富的异种血源。     

牛、猪红细胞表面异种抗原改造的比较

把动物红细胞输用给人,即异种输血,可以缓解目前血源紧张的矛盾,但牛和猪的红细胞与人的血浆发生强烈的凝集反应,不能直接输用.本研究首次对牛和猪红细胞表面抗原进行修饰改造,并对改造后的猪、牛红细胞进行比较,从而为开拓丰富来源、安全有效的人血代用品奠定基础.使用基因重组的咖啡豆α-半乳糖苷酶清除牛和猪红细胞表面的主要异种抗原-α-Gal抗原,结合使用化学材料甲氧基聚乙二醇（mPEG）修饰遮蔽牛和猪红细胞表面的非主要异种抗原-non-αGal抗原,以实现对牛和猪红细胞表面异种抗原的改造.结果：改造后的牛、猪红细胞与人混合血浆的盐水凝集反应消失,具有和人红细胞相似的血清学特征;牛红细胞比猪红细胞脆性低,异种抗原的表达量低,及其他的一些特征说明牛红细胞比猪红细胞更适合作为人红细胞代用品.结论：改造后的牛红细胞与人血浆相匹配,有可能成为人红细胞代用品.     

利用新型α-半乳糖苷酶进行B→O血型改造

目的利用原核生物来源的α-半乳糖苷酶进行B→O血型改造研究。方法应用PCR的方法从脆弱类杆菌(Bacteriodes fragilis)中克隆了新型α-半乳糖苷酶基因,构建原核生物表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导α-半乳糖苷酶的胞内可溶性表达,应用重组酶的上清液进行B型红细胞(RBC)初步酶解试验。结果重组酶分子量约为64.6 kD,超声破碎的菌液上清中的酶活力约为2 U/ml。在26℃及pH 6.8的等渗柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲体系中2,h内完全酶解200μl B型RBC需要30μl的上清液,酶解后的B型RBC与抗-B和抗-A单克隆抗体不凝集,流式细胞术检测结果显示酶解后B型RBC的血型抗原呈现O型特征。结论重组的α-半乳糖苷酶可以有效的将B型RBC转变为O型RBC。     

联合应用α-半乳糖苷酶和α-N-乙酰半乳糖胺酶实现红细胞AB→O血型转变

目的研究酶解去除AB型红细胞表面的A和B抗原、实现AB→O血型转变的方法,以获得通用型红细胞。方法联合应用α-半乳糖苷酶和α-N-乙酰半乳糖胺酶酶解AB型红细胞,用单克隆抗-A、抗-A1和抗-B抗体检测酶解效果,用稀有血型抗体检测酶解前后红细胞表面的稀有血型,用流式细胞术检测酶解前后红细胞表面A、B、H抗原,原子力显微镜观察酶解前后红细胞形态,主侧配血试验检测酶解红细胞是否符合临床输血要求。结果A1B和A2B亚型红细胞的A、A1和B抗原均能够完全被酶解去除,酶解前后红细胞的稀有血型抗原不变;流式细胞术显示,酶解后AB型红细胞表面的A和B抗原消失,而H抗原明显增加,和O型红细胞相当;酶解不影响红细胞的形态;主侧配血试验证明酶解改造后的AB型红细胞可以安全输给O、A、B、AB等各型受血者。结论联合应用α-半乳糖苷酶和α-N-乙酰半乳糖胺酶成功实现了AB→O血型转变,获得酶解通用型红细胞。     

去除α1，3-半乳糖转移酶的猪红细胞用于人类输血的研究[英]／Rouhani FJ…／／Transfusion

背景猪是人类潜在的红细胞供血源，但由于其红细胞表面存在半乳糖-α，3-半乳糖(Gal)抗原决定基，而人类有抗-Gal，因此这是猪红细胞应用于人体的一个主要障碍。最近，去掉猪的α，3-半乳糖转移酶基因，使其红细胞表面不表达Gal抗原决定基(Gal-／-)，已经成为可能。设计和方法在体外，从Gal-／-猪采取的红细胞暴露于未经致敏的人血清．或狒狒血清，     

异种肌腱移植免疫反应的处理方法

背景：异体肌腱移植是目前修复肌腱缺损的理想方法。其中异种肌腱供源丰富,但移植后的排斥反应为其使用受到限制的主要原因。目的：对异种肌腱的抗原性和移植后的免疫反应及降低异种肌腱排斥反应的方法的研究进展进行综述。方法：第一作者应用计算机检索PubMed数据库和CNKI数据库中1995-01/2010-12在标题和摘要中以＂肌腱,异体移植,免疫＂或＂tendons,transplantation Immunity,＂为检索词进行检索。选择文章内容与肌腱移植免疫反应相关,同一领域文献则选择近期发表或发表在权威杂志文章。初检得到196篇文献,根据纳入标准选择30篇文章进行综述。结果与结论：目前对异种移植物抗原的研究包括半乳糖-a-1,3-半乳糖抗原（Gal）和非Gal抗原,以对Gal抗原基因研究的较多。Gal抗原由存在于哺乳动物细胞表面的Gal-a-1,3-Gal抗原引起,是引起超级排斥反应的主要因素。异种肌腱移植后早期以细胞免疫为主,晚期仅有体液免疫参与;动物实验表明经不同物理和化学方法处理后的异种肌腱有潜在应用价值。肌腱移植不同于器官移植,肌腱移植属于非功能性移植,异体肌腱只为受区提供一个生长支架,移植后的生物学特点主要体现在生物力学上,因此,探讨出新的消除免疫原性同时保留移植物生物力学特性的方法是异种肌腱移植获得突破的关键。     

异种肌腱移植免疫反应的处理方法

背景:异体肌腱移植是目前修复肌腱缺损的理想方法.其中异种肌腱供源丰富,但移植后的排斥反应为其使用受到限制的主要原因.目的:对异种肌腱的抗原性和移植后的免疫反应及降低异种肌腱排斥反应的方法的研究进展进行综述.方法:第一作者应用计算机检索PubMed 数据库和CNKI 数据库中1995-01/2010-12 在标题和摘要中以"肌腱,异体移植,免疫"或"tendons,transplantation Immunity,"为检索词进行检索.选择文章内容与肌腱移植免疫反应相关,同一领域文献则选择近期发表或发表在权威杂志文章.初检得到196 篇文献,根据纳入标准选择30 篇文章进行综述.结果与结论:目前对异种移植物抗原的研究包括半乳糖-a-1,3-半乳糖抗原(Gal)和非Gal 抗原,以对Gal 抗原基因研究的较多.Gal 抗原由存在于哺乳动物细胞表面的Gal-a-1,3-Gal 抗原引起,是引起超级排斥反应的主要因素.异种肌腱移植后早期以细胞免疫为主,晚期仅有体液免疫参与;动物实验表明经不同物理和化学方法处理后的异种肌腱有潜在应用价值.肌腱移植不同于器官移植,肌腱移植属于非功能性移植,异体肌腱只为受区提供一个生长支架,移植后的生物学特点主要体现在生物力学上,因此,探讨出新的消除免疫原性同时保留移植物生物力学特性的方法是异种肌腱移植获得突破的关键.     

原核基因工程制备新型重组α-半乳糖苷酶应用于人B→O血型改造的研究

本研究利用基因工程方法制备脆弱类杆菌来源的新型α-半乳糖苷酶并将其应用于人B→O血型改造.在获得了能够表达细菌α-半乳糖苷酶工程菌株的基础上,从诱导时间、诱导剂浓度两个方面对工程菌株的诱导条件进行优化,获得细菌α-半乳糖苷酶的最佳可溶性表达条件;超声上清经过阳离子交换层析和阴离子交换层析等方法进行纯化.利用纯化后的α-半乳糖苷酶在磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中处理B型红细胞2小时,制备O型红细胞.结果表明细菌α-半乳糖苷酶最佳诱导表达条件为:37℃、起始D(600)为0.8,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导时间为2小时.纯化后α-丰乳糖苷酶的纯度为电泳纯,比活由纯化前的0.42 U/mg提高到了2.1 U/mg.该酶在26℃、接近中性的pH条件(6.8)下经2小时可将B型红细胞改造成O型红细胞,需要的酶量为225μg/ml红细胞.结论:建立了重组细菌α-半乳糖苷酶的表达纯化工艺,制备的重组α-半乳糖苷酶可有效地将B型红细胞改造成O型红细胞,为B→O血型改造提供了更有效的工具酶.     

异种输血--猕猴受输猪红细胞的初步研究

本研究的目的是改造猪红细胞（pRBC）表面抗原，使之与灵长类动物相容，以探讨异种输血的可能性。结合使用α半乳糖苷酶（AGL）酶解和甲氧基聚乙二醇（mPEG）修饰改造猪红细胞表面异种抗原，并输注给猕猴，观察pRBC在猕猴体内活存时间及安全性；使用免疫抑制剂（蛇毒因子CVF和地塞米松）延长pRBC在猕猴体内的存活时间；建立失血性贫血猕猴模型，观察输注pRBC治疗失血性贫血猕猴的可能性。结果表明：AGL酶解能够去除猪红细胞表面主要异种抗原（α—Gal抗原），减弱其与猕猴血清的凝集反应，酶解技术与mPEG修饰技术结合可以使猪红细胞与猕猴血清更为相容。异种输血试验表明，双修饰的pRBC在猕猴体内存活时间为12小时，使用免疫抑制剂后，可延长至40小时；pRBC在猕猴体内8小时的存活率为38％，在输注pRBC的8小时内，失血猕猴的血红蛋白和红细胞压积可维持在失血前的正常水平。结论：改造后的pRBC可安全地输注给猕猴，改善失血猕猴的贫血症状．提示用猪红细胞进行异种输血是可能的。     

去除α1,3-半乳糖转移酶的猪红细胞用于人类输血的研究

背景猪是人类潜在的红细胞供血源,但由于其红细胞表面存在半乳精-α 1,3-半乳糖(Gal)-抗原决定基,而人类有抗- Gal,因此这是猪红细胞应用于人体的一个主要障碍。最近,去掉猪的α 1,3-半乳糖转移酶基因,使其红细胞表面不表达Gal 抗原决定基(Gal-／-),已经成为可能。设计和方法在体外,从 Gal-／-猪采取的红细胞暴露于未经致敏的人血清,或狒狒血清,     

α-Gal抗原与动物源性医疗器械免疫原性风险控制

背景：目前动物源性医疗器械被广泛应用于临床,尽管它的有效性得到了认可,但它的安全性特别是免疫原性日益受到人们的关注。目的：为了保证动物源性医疗器械的质量安全,研究其免疫原性风险控制。方法：作者应用计算机检索 Sciencedirect 数据库、Wiley-Blackewel 电子期刊数据库和万方数据库中1985年1月至2013年6月的文章,在标题和中以“α-Gal抗原,免疫原性,异种移植”或“α-Gal antigen, immunity, xenotransplantation”为检索词进行检索。结果与结论：目前对异种植入物抗原中Galα1-3Gal抗原（即α-Gal抗原）的研究较多。α-Gal抗原存在于大量非灵长类哺乳动物、新世纪猴体内糖基化合物中,在人类及旧世纪猴体内不表达,但在人体中存在抗α-Gal抗体。α-Gal抗原与抗α-Gal抗体的结合形成了异种移植的免疫屏障。为了保证动物源性医疗器械的使用安全有效,应对动物源性材料进行选择,采用适当的工艺减少或去除α-Gal 抗原,同时还应建立灵敏度高、重复性好的α-Gal抗原检测方法。     

重组血型改造工具酶稳定性的研究

目的研究血型改造工具酶,重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在不同保存条件下的稳定性。方法以酶解B型红细胞的活性和纯度作为主要检测指标,考察重组α-半乳糖苷酶的热稳定性。重组α-半乳糖苷酶在70℃条件下保存1d,37℃保存60d,室温、4、-20、-70℃分别保存6个月,定期取样观察样品的外观,检测样品的pH值、纯度、酶活性,并进行无菌试验;为确保临床使用中的安全性和有效性,我们对4℃保存的样品进行了长达3年的观察。结果重组α-半乳糖苷酶在70℃保存1d后失活,37℃保存2个月后活性降低了11.5%,室温保存6个月后活性降低了19%,-70℃保存6个月后活性降低了13%,4℃、-20℃保存的样品6个月内各项指标均正常,均未见蛋白明显降解,蛋白活性保持稳定。4℃保存3年的样品酶活性保持稳定,可按原剂量在26℃,2h内成功地将B型红细胞改造成O型红细胞。结论重组α-半乳糖苷酶对热不稳定,应保存4℃或-20℃,在此条件下,有效期至少2年,能满足常规临床要求。     

Alpha—Gal异种移植抗原在猪骨中的分布研究

目的通过观察α-Gal抗原在猪骨组织中的分布,为进一步寻找去除α-Gal抗原的方法提供理论依据。方法皮质骨和松质骨标本分别取自猪肋骨和股骨髁部,将标本分别制成0．5cm×0．5cm×0．5cm大小,分别用甲醛和甲基丙烯酸甲酯固定,以M86为特异性抗体,免疫组化和免疫荧光方法分别检测α-Gal抗原在猪骨组织中的分布。结果α-Gal免疫组化和免疫荧光阳性表达于骨细胞和Haversian管表面,骨细胞外基质未见α-Gal阳性表达。结论异种移植α-Gal抗原主要表达于猪骨细胞表面,异种骨移植时应破坏骨细胞减少α-Gal的表达,以避免猪骨移植时的异种免疫排斥反应。     

小鼠α1,3-半乳糖基转移酶RNA干扰重组慢病毒的构建与鉴定

背景:研究表明,通过抑制α1,3-半乳糖基转移酶的生成而减少甚至避免供体Gala(1,3)Gal的生成,是渡过器官移植后超急性排斥反应的一条切实可行的方法.目的:构建小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因的RNA干扰慢病毒载体,有效沉默小鼠血管内皮细胞的α1,3-半乳糖基转移酶基因表达,以期为有效控制异种移植超急性排斥反应提供稳定的转染细胞载体.设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-07/2007-05在天津医科大学总医院普外研究所完成.材料:慢病毒载体系统(四质粒)购自Tronolab公司,包装细胞293T细胞株购自中科院上海细胞所.方法:在线软件设计小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因发卡小分子干扰RNA片段.合成的双链DNA片段并将其连接到Tele-sh003/U6.2载体的黏性末端,产生重组质粒Tele-sh003/U6.2-shRNN/α1,3-半乳糖基转移酶.对干扰质粒做测序分析.用磷酸钙法将得到的阳性重组子与慢病毒包装质粒共转化293T细胞,72 h后收集含病毒上清液,超速离心后得到重组慢病毒.用实时定量聚合酶链反应测定病毒滴度.主要观察指标:干扰质粒的测序分析,慢病毒颗粒的包装和滴度测定.结果:小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因小发卡RNA片段被成功克隆进Tele-sh003质粒中,测序结果显示干扰质粒小干扰RNA编码序列与设计片段的序列完全一致.所得慢病毒亦为阳性克隆,经定量聚合酶链反应测定病毒滴度为2×108 Tu/mL.结论:成功构建出小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因的小发卡RNA慢病毒RNA干扰表达载体,为进一步控制异种移植超急性排斥反应提供了稳定的转染细胞的载体.     

猪红细胞表面抗原化学修饰后应用于异种输血的初步体外研究

目的使化学修饰的猪红细胞(pRBC)呈现出与人红细胞(hRBC)相似的血清学特性,减弱或消除人体对pRBC的免疫排斥。方法采用双修饰法即rSα-GalE酶解法(100U/mL的rSα-GalE处理)修饰改造pRBC表面的Gal抗原,再用mPEG包裹法(3mmol/L的mPEG-BTC)修饰遮蔽pRBC的non-αGal表面抗原。结果修饰后的pRBC与人混合血浆的盐水交叉配血试验为阴性;修饰后pRBC的结构、功能等指标基本正常。结论经rSα-GalE和mPEG双修饰法修饰改造的pRBC呈现出与hRBC相似的血清学特性。     

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移植物主要组织相容性抗原复合物在异种移植排斥反应中起关键作用，实验资料表明，用反义核酸技术处理人成纤维细胞再移植入帕金森病大鼠纹状体，可降低异种移植排斥反应程度，延长细胞的存活时间。     

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抑制异体周围神经移植免疫排斥反应的实验方法

移植免疫的核心问题是组织相容性复合体（MHC）。MHC的表达产物主要存在于细胞膜表面,构成了多种细胞的膜抗原,这是产生移植免疫的主要原因。在异种移植中,受者体内预存的异种抗体（天然抗体）能识别位于供体细胞表面并与之结合的特异位点。不同种属问进行异种移植引发超急排斥反应（HAR）的异种抗原可以不同。     

干血中半乳糖和半乳糖-1-磷酸的比色测定

半乳糖和半乳糖-1-磷酸筛选试验对新生儿遗传性半乳糖代谢障碍的早期诊断和有效的治疗是很重要的。干血斑中半乳糖(Gal)和半乳糖-1-磷酸(Gal-1-p)涉度测定是对半乳糖代谢中3种酶(D-半乳糖-1-磷酸转移酶、α-D-半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶和尿苷二磷酸葡糖-4-异构酶)的缺陷筛选方法。作为筛选试验必须具备灵敏、快速、廉价和较高临床确诊价值,而大多数实验室所用的筛选方法费时和用半定量的微生物学方法。有些学者推荐使用依赖NAD~+半乳糖脱氢酶的灵敏、快速