靶向人GSK-3β基因的shRNA真核表达质粒的构建及其在人胰腺癌细胞株PANC-1中的稳定表达

目的 构建针对人糖原合成激酶-3β(GSK-3β)基因的shRNA真核表达质粒,并筛选基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体;转染人胰腺癌细胞株PANC-1,建立稳定表达GSK-3β shRNA的细胞模型.方法 针对GSK-3β基因的mRNA序列设计并分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经...     

GSK-3β特异的siRNA腺病毒对高脂诱导内皮细胞GSK-3β表达的影响

目的构建糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）特异的RNA干扰（RNAi）腺病毒，观察其抑制高游离脂肪酸（FFA）诱导下人脐静脉内皮细胞（HUVEC）GSK-3β的表达情况。方法利用体外同源重组技术构建GSK-3β特异的siRNA腺病毒表达载体，在HEK293A细胞中包装并扩增病毒、空斑以实验法测定病毒滴度。GSK-3p特异的siRNA腺病毒感染HUVEC，以Western印记法测定其对GSK-3β蛋白表达的影响。结果成功构建了GSK-3β特异的siRNA腺病毒，获得高滴度的腺病毒液；构建的重组腺病毒感染HUVEC，可显著抑制正常培养及游离脂肪酸诱导下的细胞的GSK-3β蛋白的表达，Ad—DEST组与Ad-640组比较，Ad-640组明显下降（P〈0．05）。结论构建的GSK3特异的RNAi腺病毒能有效抑制HUVECGSK-3β蛋白的表达，有可能保护高脂诱导的HUVEC损伤。     

慢病毒载体靶向介导p66shc基因沉默

目的：构建p66shc基因重组慢病毒表达载体,并将之转染至293T细胞,通过RNA干扰致使p66shc基因沉默,为进一步研究p66shc基因功能奠定基础。方法筛选3个RNA靶点,命名为p66shc‐shc1、p66shc‐shc2、p66shc‐shc3,与双酶切后的pLenR‐绿色荧光蛋白（GPH）（含有GFP表达）连接,转化入感受态的DH5α细胞,挑取阳性克隆测序正确后,与pRsv‐REV、pM‐Dlg‐pRRE、pMD2G一起转染293T细胞,于倒置荧光显微镜下检测GFP的表达,证实病毒包装成功。使用荧光定量PCR及Westernblot技术检测p66shc在基因及蛋白水平的表达,选取有效沉默p66shc基因的p66shc‐shc1靶点,为后续试验做准备。结果成功构建表达p66shc的shRNA慢病毒载体并转染至真核生物细胞内,通过荧光定量PCR及Westernblot技术检测其通过RNA干扰导致细胞内p66shc基因沉默。结论靶向表达p66shc的shRNA慢病毒载体,转染入真核生物细胞内可通过RNA干扰在分子及蛋白水平导致p66shc基因沉默。     

中药调控GSK-3β治疗阿尔茨海默病研究进展

阿尔茨海默病（AD）致病机制复杂,糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)已被证实可以通过参与多条信号通路,介导AD的进程。近年来,大量研究发现多种中药提取物、复方能够明显改善AD患者的症状,其机制可能与其抑制GSK-3β激活从而调控β-淀粉样蛋白（Aβ）的生成、tau蛋白过度磷酸化、细胞凋亡及细胞炎症反应等神经病理进程有关。对近年来国内外中药抑制GSK-3β干预AD的相关研究进行综述,探讨其内在机制,为深入研究中药参与AD的作用机制拓展思路。参考文献47篇。     

慢病毒介导的犬WRD细胞p53基因沉默及稳定感染细胞系的建立

目的构建靶向犬p53基因慢病毒干扰载体,建立稳定沉默p53 基因的WRD/p53-细胞系。方法设计并构建4条针对犬
p53基因的特异性shRNA干扰质粒。将构建的慢病毒表达载体（pGMLV-p53）和包装质粒（packaging mix）组成的包装系统共
转染293T细胞,包装病毒,收集病毒原液,超滤浓缩,并测定滴度。包装好的慢病毒感染WRD细胞,Western blot 和实时荧光定
量PCR方法检测不同靶点RNA干扰载体对p53基因的干扰效果,确定有效靶点。针对有效靶点慢病毒颗粒以最适感染复数
（multiplicity of infection, MOI）感染WRD细胞,puromycin抗生素筛选稳定感染细胞系WRD/p53-。结果结果显示p53 RNAi
慢病毒载体构建成功,成功包装四种不同靶点的p53基因RNA干扰慢病毒, 病毒滴度均达到1×109 TU/ml。四种干扰载体慢病
毒均具有较好的干扰效果,选用沉默效果最好的pGMLV-p53A1 为最优靶点,成功建立p53 RNAi慢病毒载体稳定感染细胞系
WRD/p53-。结论成功构建p53 RNAi慢病毒载体,并有效干扰WRD细胞中p53 mRNA和蛋白表达,同时成功筛选并建立p53
RNAi慢病毒稳定感染WRD/p53-细胞系。
     

GSK-3β介导七氟醚对脓毒症相关性脑病大鼠的脑保护作用

目的探讨糖原合成激酶3β(GSK-3β)介导七氟醚对脓毒症相关性脑病大鼠的脑保护作用。方法健康雄性SD大鼠48只,随机分为假手术(Sham)组、脓毒症相关性脑病(SAE)组、SAE+七氟醚后处理组和SAE+七氟醚后处理+GSK-3β抑制剂组四组,每组各12只。用腹腔注射脂多糖(LPS)建立SAE模型。建模后连续吸入2.5%的七氟醚30 min,利用Morris水迷宫实验评估大鼠认知功能,七氟醚处理后1 d检测大鼠海马区细胞凋亡率、IL-6浓度、GSK-3β表达。结果与Sham组相比,SAE组、SAE+七氟醚后处理组和SAE+七氟醚后处理+GSK-3β抑制剂组大鼠逃避潜伏期均延长,穿越平台次数均减少,原平台所在象限停留时间均缩短,海马区细胞凋亡率增加,IL-6浓度升高,GSK-3β表达减少;与SAE组相比,SAE+七氟醚后处理组大鼠逃避潜伏期缩短,穿越平台次数增加,原平台所在象限停留时间延长,海马区细胞凋亡率降低,IL-6浓度降低,GSK-3β表达增加;与SAE+七氟醚后处理组相比,SAE+七氟醚后处理+GSK-3β抑制剂组大鼠逃避潜伏期延长,穿越平台次数减少,原平台所在象限停留时间缩短...     

充血性心力衰竭大鼠心肌及海马组织GSK-3β表达的变化

目的：探讨充血性心力衰竭大鼠心肌及海马区GSK-3β的变化。方法：将25只成年雄性SD大鼠随机分为正常组（5只）、假手术组（10只）和模型组（10只）,采用腹主动脉部分缩窄术建立大鼠慢性充血性心力衰竭模型。术后l、2、4、8周应用超声心动图动态监测左室舒张末期内径（LVEDd）、舒张末期室间隔厚度（IVSd）和左室后壁厚度（LVPwd）;计算心肌重量指数[心重／体重（HW／BW）、左室重／体重（LVW／BW）];免覆组织化学染色法检测大脑海马区GSK-3β和P-GSK-3β表达变化,结果：模型组LVEDd、1VSd、INPWd高于正常组和假手术组,且呈时间依赖性上升趋势（P〈0．01）,模型组心肌重量指数与正常组和假手术组比较,差异有统计学意义（P〈0．01）。模型组心肌和海马组织p-GSK-3β灰度值明显高于假手术组（P〈0．01）。结论：压力超负荷性心力衰竭发生过程中,大脑海马区p-GSK-3β表达量明显增高,GSK-3β活性明显下降。     

p38MAPK基因RNAi慢病毒载体的构建及在MC3T3-E1细胞的表达

目的 构建小鼠p38MAPK基因RNAi慢病毒载体,观察其对MC3T3-E1成骨细胞p38MAPK表达及细胞凋亡的影响.方法 设计并合成3对互补的针对小鼠p38MAPK mRNA的oligoDNA片段,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ酶切后的载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.重组质粒与慢病毒包装载体共转染293T细胞,包装产生慢病毒,流式细胞仪检测病毒滴度,p38MAPK-shRNA慢病毒载体转染体外培养MC3T3-E1细胞,荧光定量PCR 检测MC3T3-E1细胞p38MAPK mRNA表达,进行p38MAPK干扰有效靶点的筛选.22.2 mol/L葡萄糖刺激培养MC3T3-E1细胞7 d,Western blot检测MC3T3-E1细胞p38MAPK蛋白的表达,流式细胞术检测MC3T3-E1细胞凋亡.结果 酶切和测序均证实各重组质粒核苷酸序列插入正确,所得质粒分别命名为p38MAPK-shRNA1、p38MAPK-shRNA2、p38MAPK-shRNA3,流式细胞仪测定病毒滴度分别为2.4×108、2.8×108、2.5×108 TU/ml. p38MAPK-shRNA转染MC3T3-E1细胞效率达到74%以上,RT-PCR检测结果显示,各p38MAPK-shRNA转染组MC3T3-E1细胞p38MAPK mRNA表达较正常对照组分别下降了78.8%、84.3%和60.2%(P<0.01),其中以p38MAPK-shRNA2的干扰效率最高.Western blot检测结果显示,与正常对照组相比,高糖组、空载体转染组MC3T3-E1细胞p-p38MAPK蛋白表达明显增加(P<0.01).p38MAPK-shRNA慢病毒转染组MC3T3-E1细胞p-p38MAPK蛋白表达水平较高糖组明显下调(P<0.01).流式细胞仪检测结果显示,与正常对照组相比,高糖组MC3T3-E1细胞凋亡率显著增加(P<0.01);p38MAPK-shRNA慢病毒转染组以及p38MAPK信号转导阻断剂组较高糖组MC3T3-E1细胞凋亡率明显减少(P<0.05,P<0.01).结论 成功构建了靶向p38MAPK基因RNAi慢病毒载体,其能有效抑制MC3T3-E1细胞p38MAPK基因表达,减少高糖诱导的MC3T3-E1细胞凋亡.     

乙型肝炎患者胎盘组织中GSK-3β表达与HBV母婴传播的关系

目的 探讨乙型肝炎（以下简称乙肝）患者胎盘组织中糖原合成激酶3β（GSK-3β）表达与乙型肝炎病毒（HBV）母婴传播的关系。方法 选取2014年4月—2018年1月中国医科大学附属盛京医院定期产检及分娩的乙肝孕妇189例（研究组）,另选取同期正常孕妇106例（对照组）。两组均于产前抽取肘静脉血,并于胎盘娩出后30?min内留取胎盘组织,采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）对HBV-DNA进行检测,采用免疫组织化学法检测两组孕妇胎盘组织中GSK-3β表达情况,另于研究组新生儿出生后24?h内采集股静脉血,采用酶联免疫吸附试验检测乙肝5项（乙肝两对半）,根据检测结果将新生儿分为感染组与未感染组。比较感染组与未感染组胎盘组织GSK-3β表达情况,并分析GSK-3β表达与HBV感染孕妇出现新生儿HBV感染的关系。结果 研究组胎盘组织中GSK-3β阳性表达率及GSK-3β吸光度值与对照组比较,差异有统计学意义（P?<0.05）,研究组高于对照组;研究组孕妇外周血HBV-DNA滴度>1×102 copy/ml的胎盘组织GSK-3β阳性表达率及GSK-3β吸光度值高于HBV-DNA滴度≤1×102 copy/ml孕妇（P?<0.05）;研究组189例新生儿中有19例发生HBV感染,新生儿HBV感染率为10.05%（19/189）;感染组胎盘组织中GSK-3β阳性表达率及GSK-3β吸光度值与未感染组比较,差异有统计学意义（P?<0.05）,感染组高于未感染组;经Logistic多元逐步回归模型分析,乙肝孕妇血清HBV-DNA载量>1×102?copy/ml、血清HBeAg阳性及胎盘组织GSK-3β阳性表达是新生儿HBV感染的危险因素（OlR=1.956、1.978和1.931,均P?<0.05）。结论 乙肝患者胎盘组织中GSK-3β阳性表达率增加,且随着孕妇外周血HBV-DNA滴度的升高而增加,GSK-3β高表达可增加HBV母婴传播发生风险。     

GSK-3β在肾脏疾病中的作用

糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)是一种丝/苏氨酸激酶,GSK调节多种细胞反应,如细胞生长、分化、程序性死亡和炎性反应。目前研究发现,GSK-3β调控着促炎因子核因子κB(NF-κB)的活化,及NF-κB介导的趋化因子的表达。近年来一些研究揭示GSK-3β参与人和实验模型中的炎症性疾病,如急性肾衰竭、糖尿病肾病、慢性移植肾肾病。因此,抑制GSK-3β的活性可作为治疗肾脏疾病的靶点。     

GSK-3β、Snail和E-cadherin在三阴乳腺癌组织中的表达及临床意义

目的 探讨GSK-3β、Snail和E-cadherin在三阴乳腺癌(TNBC)中表达及意义.方法 选择2006年9月至2013年9月收治的48例TNBC患者作为观察对象即TNBC组,并随机选出60例非TNBC患者作为对照即NTNBC组,应用免疫组织化学SP法检测GSK-3β、Snail和E-cadherin的表达情况,并进行统计分析.结果 TNBC组GSK-3β、Snail的阳性表达率显著高于NTNBC组(P＜0.05),E-cadherin的阳性表达率显著低于NTNBC组(P＜0.05).GSK-3β与Snail表达呈正相关(P＜0.05),与E-cadherin表达呈负相关(P＜0.05).结论Snail、GSK-3β、E-cadherin可能共同参与乳腺癌上皮间质转化过程,可成为综合评价TNBC的重要标志物.     

GSK-3β参与抑制肺癌细胞增殖的实验研究

目的:探讨糖原合成酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)对肺癌A549细胞增殖的影响及可能机制.方法:MTT法检测不同浓度曲古抑菌素A(TSA)和联合GSK-3β抑制剂SB216763对A549细胞增殖的影响;Western Blot法检测各组细胞中GSK-3β和磷酸化GSK-3β(pGSK-3β)蛋白表达的变化;流式细胞仪分析细胞周期;免疫细胞化学法检测p27蛋白水平.结果:TSA以剂量依赖性抑制A549细胞生长,使细胞周期阻滞于GdG1期,用SB216763预处理后明显减弱了TSA对A549细胞的生长抑制作用和细胞周期阻滞.TSA对细胞GSK-3β蛋白表达无明显影响,却降低了pGSK-3β蛋白水平.p27蛋白表达增加;抑制剂SB216763使pGSK-3β表达增加,下调p27蛋白水平.结论:GSK-3β参与并促进了TSA对肺癌细胞的生长抑制和细胞周期阻滞效应,其机制可能与GSK-3β对p27蛋白的调节有关.     

补肾健脾方对阿尔茨海默病模型大鼠胰岛素和GSK-3β水平的影响

目的:研究补肾健脾方改善阿尔茨海默病(AD)模型大鼠学习记忆能力的作用机制。方法:雄性SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、假手术组、小剂量干预组、大剂量干预组。采用鹅膏蕈氨酸毁损大鼠脑Meynert基底核制备AD模型,分别用大、小剂量的补肾健脾方灌胃。30 d后测试大鼠学习记忆能力、血清胰岛素含量及脑组织中糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的表达。结果:药物干预组大鼠的学习记忆功能显著优于AD模型组,大剂量干预组空腹胰岛素水平显著下降,药物干预组大鼠脑组织中GSK-3β的表达显著下降。结论:补肾健脾方可改善AD大鼠的学习记忆能力,调节血清胰岛素水平及脑组织GSK-3β的表达。     

GSK-3β参与氯化锂修饰颅内感染后癫痫发作的可能机制

目的 探究糖原合成激酶-3β(GSK-3β)是否参与氯化锂(LiCl)修饰颅内感染后癫痫发作的机制.方法 取大鼠110只,其中5只作为对照组(注射生理盐水),余下大鼠利用脂多糖(LPS)诱导颅内感染在此基础上,用毛果芸香碱(Pilo)致痫实验大鼠.将实验大鼠进行分组:LPS组,LPS-10、20、40、80 mg/kg...     

罗格列酮调节IDE和GSK-3β的活性改善阿尔茨海默病动物认知能力

目的：研究作为胰岛素增敏剂的过氧化物酶体增殖因子活化受体γ（peroxisome proliferator-activated receptors γ,PPARγ）激动剂-罗格列酮对阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）动物模型的认知水平、β淀粉样蛋白（amyloid β-peptide,Aβ）和Tau的影响,并探讨其改善AD模型认知能力的可能机制。方法：通过侧脑室注射链脲佐菌素建立AD动物模型,并用罗格列酮处理动物,第1次手术后21 d用Morris水迷宫检测动物的学习和记忆水平;采用Western blot检测胰岛素降解酶（insulin-degrading enzyme,IDE）、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β）、磷酸化糖原合成酶激酶-3β（pGSK-3β）、Tau、磷酸化Tau（phosphoTau,pTau）的表达;通过免疫组化检测Aβ40和Aβ42在大脑的沉积。结果：Morris水迷宫结果显示罗格列酮可以明显改善AD大鼠的认知能力（P<0.001）;Western blot结果显示罗格列酮能增加IDE的表达（P=0.028）、降低GSK-3β的活性（P=0.012）、减少Tau的磷酸化水平（P=0.001）;免疫组化结果显示罗格列酮处理的大鼠,其大脑皮质Aβ40和Aβ42的沉积量均较模型组减少。结论：罗格列酮可以明显改善AD动物的认知能力、Aβ的沉积和Tau的磷酸化,机制可能与其调节胰岛素信号通路相关的IDE和GSK-3β的表达有关。     

PIK3CA基因RNA干扰慢病毒载体的构建和鉴定

目的构建靶向PIK3CA（P110α）基因的RNA干扰慢病毒载体。方法针对PIK3CA—mRNA（NM_006218）设计4个RNA干扰靶点序列和一个阴性对照靶点,构建慢病毒转移质粒pGCL—GFP。构建成功的RNA干扰质粒与PIK3CA表达质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观测转染效果,Western Blot检测PIK3CA蛋白表达,筛选出干扰效果最好的RNA干扰质粒。将该质粒与两种辅助包装原件载体质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒并检测其滴度。结果4个靶点和阴性对照靶点的RNA干扰质粒均构建成功;通过Westem Blot检测获得最有效干扰靶点,并成功包装成滴度为2×10^8TU／ml的慢病毒。结论成功构建可供感染的PIK3CA基因RNA干扰慢病毒载体,为进一步研究PIK3CA功能和用慢病毒进行卵巢癌基因治疗奠定了基础。     

KIR2DS2基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建携带KIR2DS2基因短发夹状干扰RNA(short hairin RNA,shRNA)的RNAi慢病毒载体.方法针对已经筛选确定的KIR2DS2基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的pSicoR-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shKIR2DS2慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用LV-shKIR2DS2及Packaging system质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果PCR和测序证实,成功构建KIR2DS2shRNA的慢病毒载体LV-shKIR2DS2.293T细胞测定病毒滴度为6×108TU/ml.结论成功构建携带KIR2DS2基因短发夹状干扰RNA的RNAi慢病毒载体.     

GSK-3β在结直肠癌细胞凋亡中的作用

目的探讨糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)在结直肠癌细胞凋亡中的作用机制.方法以化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)诱导结直肠癌细胞colo320凋亡,应用Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡百分率,用Western blot检测凋亡细胞总GSK-3β,分离细胞核与细胞浆蛋白,分析细胞浆/核GSK-3β和转录因子NF-κB水平.结果 Colo320细胞凋亡比例随5-Fu作用剂量增加和时间延长显著提高.对照组细胞GSK-3β和NF-κB主要位于胞浆中,凋亡组细胞总GSK-3β水平没有明显改变,但发生了细胞浆到细胞核的迁移.结论 GSK-3β以细胞浆/核迁移方式参与并促进了5-Fu诱导的结直肠癌细胞凋亡,其机制可能是通过抑制转录因子NF-κB向核中移位,从而阻断NF-κB的促生存作用.     

GSK-3β在结直肠癌细胞凋亡中的作用

目的探讨糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)在结直肠癌细胞凋亡中的作用机制。方法以化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)诱导结直肠癌细胞colo320凋亡,应用Annexin V／PI双染流式细胞术检测细胞凋亡百分率,用Western blot检测凋亡细胞总GSK-3β,分离细胞核与细胞浆蛋白,分析细胞浆／核GSK-3β和转录因子NF—κB水平。结果Colo320细胞凋亡比例随5-Fu作用剂量增加和时间延长显著提高。对照组细胞GSK-3β和NF—κB主要位于胞浆中,凋亡组细胞总GSK-3B水平没有明显改变,但发生了细胞浆到细胞核的迁移。结论GSK-3β以细胞浆／核迁移方式参与并促进了5-Fu诱导的结直肠癌细胞凋亡,其机制可能是通过抑制转录因子NF—κB向核中移位,从而阻断NF—κB的促生存作用。