结核分枝杆菌小分子热休克蛋白16.3蛋白的原核表达及功能检测

目的进行结核分枝杆菌小分子热休克蛋白MTB Hsp16.3原核表达载体的构建、表达、纯化并初步观察其生物学效应。方法提取临床H37Rv分离株基因组DNA,PCR扩增Hsp16.3基因,将其重组到原核表达载体Pet28a中,构建原核表达载体Pet28a-Hsp16.3,进行双酶切及测序鉴定。将测序正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE检测,同时通过镍柱纯化试剂盒纯化Hsp16.3,测定纯化后蛋白浓度,并进行Western blot法检测。将不同浓度纯化后蛋白作用小鼠腹腔巨噬细胞,实时定量PCR(qRT-PCR)检测巨噬细胞IL-10和IFN-γ的表达,同时设定空白对照组及阳性对照组。结果成功构建重组质粒Pet28a-Hsp16.3,并在E.coli BL21(DE3)中获得成功表达,通过镍柱纯化系统得到纯化Hsp16.3融合蛋白。qRT-PCR检测结果显示,不同浓度纯化后Hsp16.3蛋白作用小鼠腹腔巨噬细胞,可促进IFN-γ的产生而抑制IL-10的产生。结论成功克隆、表达和纯化了MTB Hsp16.3蛋白,Hsp16.3能促进小鼠腹腔巨噬细胞产生IFN-γ,抑制IL-10的产生。     

MTB Hsp 16.3通过TLR4对小鼠M1型巨噬细胞的作用研究

探讨MTB Hsp16.3通过TLR4对小鼠M1型巨噬细胞的作用。从BALB/c小鼠胫腓骨取骨髓来源巨噬细胞,经IFN-γ诱导得到M1型巨噬细胞,MTB Hsp16.3与M1型巨噬细胞共培养,qRT-PCR和ELISA检测M1/M2型巨噬细胞相关细胞因子表达水平;用siRNA-TLR4和PMB抑制M1型巨噬细胞,qRT-PCR和ELISA检测IL-10、Arg1、iNOS、TGF-β及TNF-α等细胞因子的表达水平,western blotting法检测MAPK-NF-κB信号通路中各蛋白的表达水平。结果发现MTB Hsp16.3作用后的M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的细胞因子IL-10、TGF-β及Arg1mRNA在各时间点均升高,M1型细胞因子TNF-α、iNOS表达水平降低。抑制TLR4后,IL-10、Arg1及TGF-β水平降低,TNF-α、iNOS、IL-6表达水平升高,MAPK-NF-κB信号途径被抑制。由此MTB Hsp16.3可能通过TLR4促进小鼠M1型巨噬细胞发生M2样转化。     

热休克蛋白16.3多克隆抗体的制备

目的大肠杆菌表达Hsp16.3,制备其多克隆抗体。方法设计引物,从H37Rv基因组中扩增出目的片段Hsp16.3,pET28a-Hsp16.3质粒的构建、克隆和表达。对His-Hsp16.3进行诱导、表达和纯化。用纯化好的蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,用ELISA检测抗血清中多抗的效价,用Western blot法检测多克隆抗体的生物活性。结果重组质粒pET28aHsp16.3在E.coli BL21(DE3)中成功表达,SDS-PAGE结果显示在His-Hsp16.3的相对分子质量(Mr)约为20 000。制备的多克隆抗体效价为1∶800,且特异性较好。结论成功的克隆、表达、纯化出His-Hsp16.3,并且成功制备了抗Hsp16.3多克隆抗体。     

结核分枝杆菌Hsp16.3 刺激小鼠巨噬细胞向M2 分化

目的:探讨结核分枝杆菌热休克蛋白16.3(Mycobacterium tuberculosis heat shock proteins 16.3,MTB Hsp16.3)在体外细胞水平对小鼠骨髓来源M1型巨噬细胞的影响作用。方法:从BALB/c小鼠的胫股骨中取骨髓细胞,与GM-CSF共培养获取骨髓来源的M0型巨噬细胞,流式检测CD11b和F4/80的表达;分别用IFN-γ、IL-4诱导M0型巨噬细胞,光镜下观察细胞形态,荧光定量PCR、ELISA检测各组细胞IL-12、TNF-α、i NOS、IL-10、TGF-β、Arg-1的表达情况,构建小鼠骨髓来源M1/M2型巨噬细胞的技术平台;用MTB Hsp16.3刺激M0、M1型巨噬细胞,分别孵育24、48、72、96 h,采用ELISA、qRT-PCR检测不同时间点细胞培养液上清和细胞内的IL-12、TNF-α、i NOS、IL-10、IL-4、TGF-β、Arg-1的表达情况。结果:光镜下观察M0型巨噬细胞形态不规则,细胞伪足较短;M1型巨噬细胞形状呈长梭形,并有伪足伸出现,突触很长;M2型巨噬细胞伪足较短,细胞整体形态较为收拢。FCM检测有90%以上的骨髓细胞细胞具有CD11b和F4/80双阳性的特征。ELISA和qRT-PCR检测发现,M1型巨噬细胞高表达IL-12、TNF-α、i NOS;M2型巨噬细胞高表达IL-4、TGF-β、IL-10、Arg-1。MTB Hsp16.3刺激巨噬细胞后,M0和M1型巨噬细胞均高表达IL-10、TGF-β,低表达TNF-α、i NOS,且在48-72 h增加或降低的水平达到峰值。结论:成功诱导了小鼠骨髓来源的M1、M2型巨噬细胞;MTB Hsp16.3促进M1型巨噬细胞高表达M2型相关的细胞因子,可促进M1型巨噬细胞向M2型样巨噬细胞转换。     

小鼠PD-1胞外段的克隆、原核表达及活性分析

目的小鼠PD-1胞外段(ePD-1)原核表达载体的构建、表达、纯化及其生物学效应初步研究。方法应用小鼠脾细胞总RNA,采用RT-PCR克隆PD-1胞外段基因,将其重组到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达载体pGEX-4T-1-ePD-1,转化至E.coli DH5α,筛选阳性菌落,进行酶切及测序鉴定。将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-ePD-1转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot检测,同时通过蛋白质纯化仪纯化GST-ePD-1融合蛋白。利用流式细胞术和Alamar Blue法,检测纯化的PD-1胞外段融合蛋白对淋巴细胞增殖的影响,评价其生物学活性。结果成功构建重组质粒pGEX-4T-1-ePD-1,并在E.coli BL21(DE3)中获得了成功表达,利用蛋白质纯化仪得到纯化的GST-ePD-1融合蛋白。流式细胞术和Alamar Blue法结果均显示,不同浓度的融合蛋白作用于混合淋巴细胞,与阴性对照相比,可明显促进淋巴细胞的增殖。结论成功地克隆、表达和纯化了小鼠ePD-1蛋白,纯化的重组蛋白可有效促进淋巴...     

植原体免疫主导膜蛋白A的原核表达载体构建、表达及其抗血清制备

目的 构建植原体免疫主导膜蛋白A (IdpA)的原核表达载体,表达并纯化目的蛋白,制备抗血清.方法 以重组克隆质粒pMD18-T-IdpA为模板PCR扩增IdpA基因片段,经酶切连接将IdpA基因克隆到原核表达载体pET-28a(+),重组质粒转化感受态E.coli BL21(DE3),PCR和双酶切进行鉴定.IPTG诱导重组菌表达IdpA蛋白,并进行纯化和鉴定,以纯化获得的IdpA蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠制备抗血清,并采用ELISA和Western blot法检测抗血清的效价和特异性.结果 成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-IdpA,并在大肠杆菌中能稳定表达IdpA蛋白,经纯化获得了纯度大于90％的高纯度目的蛋白,用纯化的IdpA蛋白免疫BALB/c小鼠,获得了效价高于1:320 000的强特异性抗IdpA蛋白抗血清.结论 成功进行了IdpA的原核表达并制备了抗血清.     

结核分枝杆菌Hsp16.3蛋白影响小鼠巨噬细胞自噬形成的实验研究

目的:观察热休克蛋白Hsp16.3对感染结核分枝杆菌(MTB)的巨噬细胞自噬体形成的作用.方法:以50 ng/μL雷帕霉素诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬体形成后,用结核分枝杆菌毒株H37Rv感染巨噬细胞,再用Hsp16.3蛋白作用于巨噬细胞,电镜观察自噬体相成的变化,抗酸染色观察胞内细菌形态,计数MTB的菌落数.提取巨噬细胞总蛋白,Western blot方法检测自噬相关蛋白LC3表达水平的变化.结果:雷帕霉素诱导巨噬细胞形成自噬后感染结核分枝杆菌可使胞内细菌局限化,加入Hsp16.3蛋白可明显抑制了自噬体的形成,影响了结核分枝杆菌在巨噬细胞内的生存,显著增加了细菌的菌落形成单位,降低了自噬相关蛋白LC3的表达(P＜0.05).结论:Hsp16.3蛋白可能通过调节Atg8的表达水平抑制自噬体的形成.     

肺炎衣原体热休克蛋白10的表达及对炎症因子的诱生作用

目的在大肠杆菌中表达肺炎衣原体(Cpn)热休克蛋白10(Hsp10),并观察该蛋白诱生巨噬细胞(MΦ)分泌TNF-α和IL-6等促炎因子的作用。方法将Hsp10基因克隆于pQE30载体,在大肠杆菌(E.coli)M15中表达重组蛋白rHsp10,经亲和层析获得纯化rHsp10。以不同浓度的rHsp10作用于小鼠MΦRAW264.7,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞因子TNF-α和IL-6。结果成功构建了pQF30/Hsp10基因,并在大肠杆菌M15中得到高效表达,该蛋白能诱导小鼠MΦ以时间、剂量依赖方式分泌TNF-α和IL-6。结论表达并纯化的rHsp10蛋白能诱导MΦ分泌TNF-α和IL-6等促炎因子。     

小鼠精子Sp17与IL-5融合蛋白的构建、表达及其免疫原性鉴定

目的 构建和表达小鼠精子蛋白Sp17与白介素5(IL-5)融合蛋白,并对其进行纯化和免疫原性鉴定.方法 采用PCR技术从质粒pGEM-1-IL-5中扩增IL-5基因片段,将其克隆至pET/Sp17原核表达载体中与Sp17基因融合,构建重组质粒pET/Sp17-IL-5,经酶切鉴定后转化大肠杆菌B121(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni2+-NTA Agarose 纯化,SDS-PAGE检测、N端测序及Western blot;重组蛋白Sp17.IL-5免疫小鼠后ELISA检测小鼠血清特异性抗体.结果 成功构建小鼠精子蛋白Sp17与IL-5融合蛋白的高效表达质粒pET/Sp17-IL-5,重组工程菌pET-28a(+)-sp17-IL-5/BL21经IPTG诱导目的蛋白表达率约28%,PAGE初步测定目的蛋白相对分子量(Mr)约39 000,纯化后蛋白纯度达91%,免疫后小鼠血清中检测到特异性抗体.结论 Sp17-IL-5蛋白经基因克隆获得了较高的表达量,并初步显示了较好的免疫活性,为新型Sp17避孕疫苗的研制奠定基础.     

牛IgG2Fc受体(boFcγ2R)胞外区基因原核表达载体的构建及其表达

目的:构建牛Fcγ2R胞外区基因的原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达.方法:提取健康成年牛的白细胞总RNA,经RT-PCR扩增牛Fcγ2R胞外区基因片段,并将其克隆到载体pGEM-T Easy,经限制性内切酶EcoR I和 Not I双酶切鉴定及序列测定后,再将其亚克隆入原核表达载体pET28a中,构建重组质粒pET-2R,转化E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白.结果:获得682 bp的编码牛Fcγ2R胞外区基因片段.以构建的重组质粒pET-2R转化E.coli BL21(DE3)后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量(Mr)约为30 000的重组蛋白.SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coli BL21(DE3)的胞质中,Western blot检测表明该蛋白能和牛IgG2结合.结论:成功地构建了原核表达载体pET-2R,并表达出重组蛋白.为研究牛IgG和受体的相互作用机制及其介导的免疫反应打下了基础.     

小鼠白细胞介素17A的原核表达及对RAW264.7细胞分泌炎症因子的影响

目的 在大肠杆菌中高效表达与纯化小鼠白细胞介素17A(mIL-17A),并研究其对巨噬细胞分泌炎症因子的影响.方法 以活化的脾细胞为模板,通过RT-PCR法扩增小鼠IL-17a基因的编码序列,构建重组表达质粒pET28a/mIL-17a,并在大肠杆菌(E.coli)中诱导表达,经亲和层析获得纯化的mIL-17A蛋白.以mIL-17A蛋白刺激体外培养的鼠巨噬细胞RAW264.7,72 h后应用realtime PCR法分析IL-6、巨噬细胞炎症蛋白1(Ccl3)、巨噬细胞炎症蛋白2(Cxcl3)、β防御素2(defensinβ2)的mRNA表达量,并用ELISA法检测培养上清中Ccl3、Cxcl3、IFN-γ、IL-4及IL-6的蛋白质表达水平.结果 在E.coli中成功高效表达了有生物活性的IL-17A蛋白,可促进体外培养的RAW264.7细胞IL-6、Cxcl3、defensin β2 mRNA的表达,并能促进Ccl3、Cxcl3、IFN-γ、IL-4以及IL-6蛋白的表达.结论 成功表达并制备了具备生物学活性的mIL-17A,该蛋白具有刺激巨噬细胞表达趋化因子、防御素及细胞因子的能力.     

人survivin蛋白的原核表达、纯化及抗原活性鉴定

目的 构建人肿瘤抗原survivin的原核表达载体,优化在大肠杆菌中的表达条件,并对survivin/His融合蛋白进行纯化和抗原活性鉴定.方法 设计针对survivin基因序列的特异引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增人survivin全长基因序列(538 bp)克隆至原核表达载体pET28a(+),构建重组表达载体pET28 a-survivin,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达survivin/His融合蛋白,并采用Ni亲和层析凝胶纯化重组蛋白.纯化后的重组蛋白经Western blot法、ELISA鉴定其抗原活性.结果 重组表达载体经BamH Ⅰ和HindⅢ鉴定正确;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明获得了相对分子质量(Mr)24000大小的重组蛋白;纯化后的蛋白纯度达到90％.Western blot法和ELISA检测证实纯化的survivin蛋白能够与特异性抗体发生反应,表明其具有良好的抗原活性.结论 成功构建了原核表达载体pET28 a-survivin,利用大肠杆菌表达系统实现了融合蛋白的可溶性表达并进行纯化,纯化后survivin蛋白经鉴定具备较高的抗原活性.     

幽门螺杆菌Lpp20重组蛋白的表达、纯化及其免疫活性初步研究

目的表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)脂蛋白Lpp20基因的重组蛋白,并检测其免疫活性。方法应用PCR技术从H.pylori标准株26695染色体DNA中扩增出Lpp20的编码基因片段,将其克隆至表达载体pGEX-6P-2上,在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21中表达并进行GST亲和层析纯化,用Western blot方法检测纯化产物重组Lpp20(recombinantLpp20,rLpp20)的免疫反应性。免疫C57BL/6小鼠后,以rLpp20为包被抗原建立间接ELISA法对免疫小鼠血清进行特异性抗体检测;ELISA双抗体夹心法检测小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL-2、IL-4水平;MTT比色法检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应等指标以分析rLpp20的免疫活性。结果扩增的lpp20全长528 bp,与GenBank上公布的H.pylori 26695株lpp20序列作BLAST比较,结果完全一致;成功构建了pGEX-6P-2/Lpp20重组质粒,表达的rLpp20 M_r 43 000,纯化产物可被鼠抗H.pylori抗体识别;以...     

小鼠FcγRⅢ原核表达、纯化及鉴定

目的: 制备纯化重组蛋白mFcγRⅢ,并鉴定其生物学活性.方法: 从克隆载体mRⅢ-T中扩增mFcγRⅢ胞外区,构建原核表达载体pETmRⅢ,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot对重组表达蛋白进行鉴定;表达产物通过包涵体纯化后用稀释方法复性;ELISA检测复性蛋白活性.结果: 成功构建了重组表达质粒pETmRⅢ,纯化和复性了重组蛋白mFcγRⅢ;复性的重组蛋白mFcγRⅢ具有较强的体外活性.结论: 原核重组蛋白mFcγRⅢ复性后具有较强的体外结合配体特性,为探索重组蛋白治疗自身免疫病奠定了基础.     

小鼠Dectin-1胞外区的融合表达及其识别白念珠菌β-葡聚糖的研究

目的 克隆、表达并纯化小鼠腹腔巨噬细胞Dectin-1基因胞外区,探讨其识别并结合真菌β-葡聚糖的能力.方法 应用RT-PCR方法从小鼠腹腔巨噬细胞RNA中扩增Dectin-1基因胞外区,构建原核重组表达载体pET28-CRD,进行融合表达、纯化和复性.将融合蛋白与白念珠菌酵母相共同孵育,检测其识别、结合白念珠菌细胞壁β-葡聚糖的功能.结果 成功克隆并构建原核重组表达质粒pET28-CRD,表达并纯化了融合蛋白,该蛋白能识别、结合白念珠菌酵母细胞壁β-葡聚糖.结论 构建的原核重组表达载体能够在原核细胞内表达,表达产物有识别、结合真菌胞壁β-葡聚糖的功能,为进一步研究相应的真菌检测方法奠定了基础.     

TLR2 / 4 在MTB Hsp16.3 刺激小鼠巨噬细胞过程中表达及作用的初步探讨

目的:在体外细胞水平,初步探讨TLR2/4 在MTB Hsp16.3 刺激小鼠骨髓来源巨噬细胞的表达及作用。方法:从BALB/ c 小鼠的胫腓骨中取骨髓细胞,与GM-CSF 共培养获得骨髓来源的M0 型巨噬细胞,流式检测F4/80 和CD11b 的表达并观察其形态;100 ng/ ml MTB Hsp16.3 刺激M0 巨噬细胞,分别培养0、12、24、36、48、72 h,Real-time PCR 检测不同时间点TLR2/4 的表达水平;利用RNAi 干扰技术沉默巨噬细胞表面的TLR2/4 受体,MTB Hsp16.3 刺激沉默TLR2/4 的M0 巨噬细胞,分别培养0、12、24、36、48、72 h,Real-time PCR 检测不同时间点TLR2/4 及Ym-1、Fizz1、IL-10 、TNF 、iNOS、TGF 细胞因子的表达水平。结果:M0 型巨噬细胞在MTB Hsp16.3 刺激后出现了较短的伪足,沉默TLR2/4 的M0 型巨噬细胞在MTBHsp16.3 刺激后出现了较长伪足;M0 巨噬细胞在MTB Hsp16.3 刺激后高表达TLR2/4。MTB Hsp16.3 刺激沉默TLR2/4 的M0型巨噬细胞,高表达M1 型巨噬细胞相关的细胞因子IL-6、TNF 、iNOS,低表达M2 型巨噬细胞相关的细胞因子IL-10、TGF 、Ym-1、Fizz1。结论:MTB Hsp16.3 通过TLR2/4 促进M0 型巨噬细胞向M2 型转化,抑制M1 型巨噬细胞,这可能参与了MTB 躲避巨噬细胞的吞噬过程。     

TIGIT-Fc融合蛋白的表达以及对巨噬细胞功能的影响

目的:构建携带小鼠TIGIT-Fc融合基因的慢病毒载体,稳定整合基因至小鼠H22细胞,制备并纯化TIGIT-Fc融合蛋白,探讨其对巨噬细胞功能的影响。方法:利用分子生物学方法将小鼠TIGIT胞外段与人IgG3 Fc段基因融合,构建分泌型TIGIT-Fc载体,再重组入慢病毒载体,感染小鼠H22细胞,接种至C57BL/6小鼠腹腔产生腹水,收集腹水后通过蛋白A柱纯化获得TIGIT-Fc融合蛋白,以此干预LPS处理的巨噬细胞,检测其分泌IL-10的水平。结果:TIGIT-Fc蛋白在H22细胞中以分泌形式表达,经过纯化后的TIGIT-Fc融合蛋白可在体外作用于高表达PVR受体的成熟巨噬细胞,促进其分泌抗炎症因子IL-10。结论:TIGIT可负调节成熟巨噬细胞的功能,促进其分泌IL-10。     

TRBP分子克隆及其功能初步研究

目的:构建TRBP原核表达载体,评价表达的重组TRBP蛋白对双链RNA的结合能力。方法:利用RT-PCR扩增小鼠TRBP基因双链RNA结合区,构建其与His标签融合的表达载体,转化E.coli BL21(DE3)菌株,利用Ni-NTA磁珠对重组蛋白进行分离纯化;体外转录合成小鼠肝脏miR-122前体RNA Pre-miR-122,分别利用PAGE电泳和等温量热滴定仪检测TRBP与Pre-miR-122的结合能力。结果:分离纯化得到的重组TRBP蛋白为可溶蛋白,Mr为32 400,结合在NI-NTA磁珠上的TRBP能有效的结合Pre-miR-122。结论:成功建立了TRBP原核表达系统,初步研究了TRBP重组蛋白与双链RNA的结合能力。     

脆性X智力低下蛋白的克隆表达与纯化

目的 探讨脆性X智力低下蛋白(FMRP)的克隆表达与纯化条件.方法 用分子克隆的方法构建重组质粒pET22b( )-FMR1,并将其转入原核表达菌株E.coli BL21(DE3)中诱导表达;用固化Ni2 吸收色谱纯化重组FMRP,Western-blot鉴定并将纯化得到的蛋白与已知的RNA片段进行结合反应.结果 成功构建了重组表达质粒pET22b( )-FMR1,在E.coli BL21(DE)中表达出相对分子质量约79 000的蛋白;该蛋白为FMRP,且可与特定RNA相互作用.结论 在原核系统中表达得到了纯度和活性都较为理想的FMRP蛋白,为相关功能性研究奠定了基础.     

葡萄球菌肠毒素O表达及其生物学活性的初步分析

目的 克隆葡萄球菌肠毒素O(seo)基因,构建其两种原核表达载体,表达、纯化重组蛋白SEO,并对其生物活性进行初步研究.方法 设计引物PCR获得seo成熟肽基因,将其分别克隆至原核表达载体pGEX-6P-1、pET28a,转化E coli BL21、E coli BL21(DE3),重组蛋白分别经GST亲和层析、镍螫合层析纯化,利用Western blot验证重组SEO的免疫原性,MTT法测定重组SEO对ICR小鼠脾淋巴细胞的增殖作用,Caspase 3酶活及DNA电泳分析重组SEO诱导细胞凋亡的能力.结果 克降的seo基因序列与报道的序列完全相同.纯化获得重组蛋白GST-SEO和P28-SEO的表达量分别占菌体蛋白的25%和22%.免疫印迹表明两种蛋白均具有良好的免疫原性.生物活性检测表明,低剂量的肠毒素对小鼠脾淋巴细胞有刺激增殖作用,较高剂昔则会导致细胞凋亡.结论 两种重组的SEO仍具有超抗原的活性,对小鼠脾淋巴细胞具有诱导凋亡的能力.