缺氧诱导人视网膜色素上皮细胞19中血管内皮生长因子mRNA表达及金雀异黄素的抑制作用

目的:观察缺氧对人视网膜色素上皮细胞19中血管内皮生长因子mR-NA表达的诱导作用,以及金雀异黄素对其血管内皮生长因子mRNA和蛋白表达的抑制作用。方法:实验于2004-02/12在南京医科大学生理学实验室完成。视网膜色素上皮细胞缺氧(体积分数为0.05的CO2/体积分数为0.95的N2)2,12,24,36h后,用反转录聚合酶链反应检测该区域血管内皮生长因子mRNA表达;细胞用50,100,200μmol/L金雀异黄素和50μmol/LPD98059预处理后缺氧2和24h,用反转录聚合酶链反应检测人视网膜色素上皮细胞19细胞中血管内皮生长因子mRNA表达,用酶联免疫吸附分析检测细胞培养液上清中血管内皮生长因子蛋白表达。结果:①缺氧2,12,24,36h人视网膜色素上皮细胞19细胞血管内皮生长因子mRNA表达是正常组的2.6,3.1,8.4,2.9倍(P<0.05,n=8)。②缺氧2h:50,100,200μmol/L金雀异黄素和50μmol/LPD98059可以抑制缺氧组血管内皮生长因子mRNA表达的51.1%,71.6%,79.7%和55%(P=0.01,n=10),蛋白表达分别为(97.00±12.79),(58.85±20.21),(37.93±14.41),(57.83±9.66)ng/L。③缺氧24h:50,100,200μmol/L金雀异黄素和50μmol/LPD98059可以抑制缺氧组血管内皮生长因子mRNA表达的55.0%,78.7%,90.7%和67.2%(P=0.000,n=10),蛋白表达分别为(189.60±20.20),(117.70±21.97),(49.7±13.17),(86.33±12.47)ng/L。结论:缺氧对血管内皮生长因子mRNA表达的诱导呈时间依赖性;金雀异黄素可以在转录及转录后水平抑制缺氧诱导的人视网膜色素上皮细胞19细胞中血管内皮生长因子表达的上调。金雀异黄素对血管内皮生长因子mRNA和蛋白表达的抑制作用也呈浓度依赖性。     

人血管内皮生长因子165基因转染对C17-2神经干细胞体外增殖分化的影响

目的：构建含有人血管内皮生长因子165基因的重组腺病毒载体，并观察其对C17．2神经干细胞体外增殖和分化的影响。方法：将血管内皮生长因子165基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV，经酶切线性化后，与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转染大肠杆菌BJ5183同源重组获得重组腺病毒质粒，将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得有感染能力但复制缺陷的重组腺病毒pAdCMV血管内皮生长因子165，转染体外培养的C17．2神经干细胞。以单纯携带绿色荧光蛋白腺病毒转染为对照1组。通过酶联免疫吸附测定检测其在C17．2神经干细胞中不同时间段的表达。C17．2神经干细胞培养24h后，将pAdcMV GFP和pAdCMV血管内皮生长因子165转染C17．2神经干细胞(pAdCMV绿色荧光蛋白和pAdCMV血管内皮生长因子165转染组)，24，48，72h后每孔加入四氮唑盐10μL，检测pAdCMV转染对C17．2神经干细胞增殖的影响。将未进行pAdCMV绿色荧光蛋白，pAdCMV血管内皮生长因子165转染C17．2神经干细胞设为对照2组。收集C17．2神经干细胞(C17．2神经干细胞组)和已经转染pAdCMVVEGF165的C17．2神经干细胞(pAdCMV血管内皮生长因子165的C17．2神经干细胞组)，对两组细胞进行培养，将上述细胞爬片进行多聚甲醛固定，行巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶免疫组化法检测。结果：①重组腺病毒AdCMV血管内皮生长因子165在293细胞中包装成功，病毒滴度达2&;#215;10^11efu／L。酶联免疫吸附检测转染pAd血管内皮生长因子165的C17．2神经干细胞上清VEGF浓度显示转染后第3天为(710&;#177;82)ng／L，明显高于转染前(118&;#177;20)ng／L，第5天和第7天血管内皮生长因子165达分泌高峰，分别为(1110&;#177;126)，(1135&;#177;138)ng／L，此后渐下降，于第13天(355&;#177;35)ng／L仍显著高于对照Ⅰ组(110&;#177;22)ng/L和转染前(t=5．87，P&;lt;0．01)。②C17．2神经干细胞培养24，48，72h后对照2组干细胞增殖率分别为(0．1367&;#177;0．0186)％，(0．3300&;#177;0．0134)％，(0．6603&;#177;0．0207)％，pAdCMV绿色荧光蛋白转染组C17．2神经干细胞24，48，72h后干细胞的增殖率分别为（0．1399&;#177;0．0183)％，(0．3730&;#177;0．0136)％．（0．67l3&;#177;0．233)％。pAdCMV血管内皮生长因子165转染组C17．2神经干细胞24，48，72h后干细胞的增殖率分别为(0．1469&;#177;0．0171)％。(0．3631&;#177;0．0136)％，(0．6353&;#177;0．0247)％。两个实验组神经干细胞增殖率与对照组1组比较，P&;gt;0．05。pAdCMV血管内皮生长因子165转染组C17.2神经干细胞增殖率与pAdCMV绿色荧光蛋白转染组比较，P&;gt;0．05)。③C17．2神经干细胞组和pAdCMV血管内皮生长因子165转染C17．2神经干细胞组的巢蛋白阳性细胞率分别为(15．72&;#177;1．003)％。(17．63&;#177;1．082)％。神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率分别为(17．63&;#177;1．082)％。(21．49&;#177;1．022)％，两组比较无明显差异(P&;gt;0．05)。结论：成功构建pAdCMV血管内皮生长因子165重组腺病毒，获得了稳定表达血管内皮生长因子165的神经干细胞克隆，体外pAdCMV血管内皮生长因子165未对C17．2神经干细胞增殖和分化产生影响。     

牛磺酸对经单细胞凝胶电泳技术检测人视网膜色素上皮氧化损伤的保护特征

目的：观察过氧化氢对人视网膜色素上皮细胞的氧化作用，以及牛磺酸对人视网膜色素上皮细胞的抗氧化作用。 方法：实验于2005—01／09在哈尔滨医科大学公共卫生学院中心实验室完成。①人眼视网膜色素上皮细胞来源：实验眼来自20—35岁男性意外死亡后12h内捐给黑龙江省眼库作为角膜移植的供体眼5眼，家属签署知情同意书。取8-10代人眼视网膜色素上皮细胞用于实验. ②过氧化氢损伤实验：将培养的细胞按随机数字表法分为5组：过氧化氢各浓度组分别加入终浓度为10，25，50，100μmol／L的过氧化氢，阴性对照组只加入等量的磷酸盐缓冲液。③牛磺酸实验：将培养的细胞按随机数字表法分为5组：阴性对照组用不含血清的DMEM-F12培养液培养，牛磺酸各浓度组分别用含有终浓度为300和600μmol／L的牛磺酸培养液进行培养。将上述每个浓度组的细胞悬液分成2份，向其中1份加入终浓度为25μmol几的过氧化氢，另一份加入等量的磷酸盐缓冲液。④指标检测：15min后，用单细胞凝胶电泳法检测人视网膜色素上皮细胞的DNA损伤的程度，以拖尾率（彗星细胞数／总细胞数）和拖尾细胞DNA迁移距离[400倍显微镜下测量25个拖尾细胞的DNA迁移长度，整个核DNA直径和迁移DNA（即彗星尾）长度，其差值为DNA迁移距离]的变化表示。⑤统计学分析：用四格表x^2检验（确切概论法）比较组间彗星细胞拖尾率；用t检验进行组间DNA迁移距离比较。 结果：①过氧化氢损伤实验结果：阴性对照组DNA荧光图像为红色圆球形，过氧化氢各组出现彗星样，随着过氧化氢浓度（10，25，50，100μmol／L）的增加，人视网膜色素上皮细胞拖尾率和DNA迁移距离均明显高于或长于阴性对照组[拖尾率：4．6％，26．0％，43．3％，86．6％，96．0％；DNA迁移距离：（4．13&;#177;0．52），（10．54&;#177;2．03），（20．59&;#177;4．42），（39．56&;#177;10．28），（51．54&;#177;15．93）μm，P〈0．01]。②牛磺酸实验结果：300和600μmol／L牛磺酸组视网膜色素上皮细胞拖尾率和拖尾细胞DNA迁移距离与阴性对照组相近（P〉0．05）。300和600μmol／L牛磺酸＋25μmol／L的过氧化氢组均明显低于或短于25μmol／L过氧化氢组[拖尾率：22．6％，20．0％，43．3％；DNA迁移距离：（17．46&;#177;7．13），（13．56&;#177;2．52），（20．59&;#177;4．42）μm，P〈0．05]，且牛磺酸浓度越高，差异越大。 结论：10μmol／L过氧化氢就能对人视网膜色素上皮细胞直接造成DNA断裂损伤，该作用呈剂量依赖性。适量的牛磺酸（300和600μmol／L）对人视网膜色素上皮细胞DNA的氧化断裂损伤起保护作用，该作用也呈剂量依赖性     

急性局灶性脑缺血早期血管内皮生长因子及其受体mRNA表达的时空特征

背景：血管内皮生长因子可加速新生血管形成，作为多功能细胞因子与其受体的相互作用在血管形成的过程中发挥关键作用。目的：检测血管内皮生长因子及其受体FLT-1及FLK-1mRNA在急性局灶性脑缺血中的表达，并探讨其表达的时间与部位的相互关系。设计：随机对照实验。单位：吉林大学第一医院神经内科、吉林大学白求恩医学部病理教研室。材料：实验于2001-06／2002-04在吉林大学白求恩医学部病理实验室完成。选择成年SD大鼠130只，雌雄各半，随机分为正常对照组10只,假手术组10只，脑缺血组110只。脑缺血组又随机分为0，1，2，3，6，24，48h，1，2，3，4周共11个时间点，每个时间点10只。方法：应用左侧颈总动脉结扎加缺氧诱导的方法，建立SD大鼠永久大脑中动脉闭塞模型，假手术组不进行动脉结扎和缺氧处理，其余步骤同脑缺血组。正常对照组不做任何处理。检测血管内皮生长因子及其受体基因在局灶性脑缺血后不同时间点的表达应用原位杂交技术。同时观察局灶性脑缺血后血管形成情况。主要观察指标：①血管内皮生长因子及其受体基因在急性局灶性脑缺血后不同时间点的表达。②急性局灶性脑缺血后不同时间点血管形成情况。结果：130只大鼠全部进入结果分析。①不同时间点血管内皮生长因子mRNA的表达：缺血3，6，24，48h时缺血周边区高于缺血中心区[（31．13&;#177;2．21）个／视野，（13．32&;#177;1．31）个／视野；（43．11&;#177;2．43）个／视野，（19．40&;#177;3．22）个／视野；（85．41&;#177;2．75）个／视野，（47．63&;#177;2．45）个／视野；（98．66&;#177;1．76）个／视野，（57．32&;#177;3．35）个／视野，（P〈0．05）]。48h后血管内皮生长因子mRNA逐渐下降，至2周恢复到对照水平。②不同时间点血管内皮生长因子受体FLT-1，FLK-1mRNA的表达：缺血3，6，24，48h时缺血周边区高于缺血中心区，血管内皮生长因子受体FLT-1及FLK-1mRNA表达在3周时达对照水平（P〈0．05）。②血管形成平均数：48h，1周时缺血周边区高于缺血中心区[（47．2&;#177;2．11）个／视野，（29．4&;#177;2．37）个／视野；（199．2&;#177;3．45）个／视野，（76．6&;#177;4．62）个／视野，（P〈0．05）]。结论：急性局灶性脑缺血早期血管内皮生长因子mRNA及血管内皮生长因子受体FLT-1及FLK-1mRNA在神经细胞、胶质细胞、血管内皮细胞均有表达，在缺氧情况下，脑内血管内皮生长因子及受体的表达明显增强，表达具有时空特性。     

血管内皮生长因子反义寡核苷酸对小鼠在体肺癌细胞的抑制作用

目的：探讨血管内皮生长因子反义寡核苷酸基因治疗方法对模型小鼠在体肺癌细胞的抑制作用。方法：于2001-05／2002-01在哈尔滨医科大学第一临床医学院实验动物中心制作C57BL／6小鼠皮下肺癌模型30只，分为血管内皮生长因子反义寡核苷酸治疗组、血管内皮生长因子正义寡核苷酸治疗组及对照组。接种Lewis肺癌细胞后24h内，用反义寡核苷酸及正义寡核苷酸皮下注射进行治疗，对照组只注射生理盐水，观察小鼠肿瘤的生长情况。用免疫组化方法检测血管内皮生长因子蛋白表达，强阳性为卅，弱阳性为+。通过反转录多聚酶链反应检测血管内皮生长因子mRNA的表达，计算血管内皮生长因子与β-actin比值作为血管内皮生长因子表达水平参数。结果：30只模型鼠均进入结果分析。①平均瘤质量：对照组、血管内皮生长因子反义寡核苷酸治疗组、血管内皮生长因子正义寡核苷酸治疗组分别为(7．83&;#177;0．78)，(4．49&;#177;0．43)和(7．73&;#177;0．69)g。②血管内皮生长因子在癌周表达强度高于癌内，在对照组及血管内皮生长因子正义寡核苷酸组多呈强阳性，而血管内皮生长因子反义寡核苷酸组多呈弱阳性。③血管内皮生长因子120／β-actin：血管内皮生长因子反义寡核苷酸组(0．1594&;#177;0．025)低于对照组[(0．4020&;#177;0．032)，P&;lt;0．01]，低于血管内皮生长因子正义寡核苷酸组【(0．3805&;#177;0．030)，P&;lt;．01】。④血管内皮生长因子164／β-actin：血管内皮生长因子反义寡核苷酸组(0．3073&;#177;0．021)低于对照组[(0．878O&;#177;0．029)，P&;lt;0．01]，低于血管内皮生长因子正义寡核苷酸组[(0．8481&;#177;0．020)，P&;lt;0．01]。结论：血管内皮生长因子反义寡核苷酸与肿瘤血管的生成密切相关。原位注射血管内皮生长因子反义寡核苷酸能抑制小鼠在体肺癌细胞的生长。     

比较猪去氧胆酸与牛磺熊去氧胆抗神经细胞缺氧缺糖再给氧损伤的作用

目的：研究猪、熊胆粉的主要成分猪去氧胆酸及牛磺熊去氧胆对神经细胞缺氧缺糖再给氧损伤的保护作用。方法：实验于2000-07／2002-08在北京中医药大学中医内科学教育部重点实验室完成。培养人神经母细胞瘤细胞，以含连二亚硫酸钠的无糖Earle液模拟造成缺氧缺糖再给氧损伤，随机分为正常培养对照组，缺氧缺糖再给氧组，猪去氧胆酸3.125，1．563，0.781μmol／L浓度组，牛磺熊去氧胆3.125，1.563，0.781μmol／L浓度组。应用锥虫蓝染色测定细胞死亡率，应用比色法测定乳酸脱氢酶漏出率，四甲基偶氮唑蓝比色法测定细胞存活率，应用以Hoechst33342和碘化丙啶原位双染法荧光显微镜检测细胞坏死率和凋亡率。结果：①细胞死亡率：猪去氧胆酸、牛磺熊去氧胆3．125，1563．0．781μmol／L浓度组细胞死亡率均明显低于缺氧缺糖再给氧组[(34．1&;#177;7.1)％，(32.8&;#177;8．2)％，(29.4&;#177;9．8)％，(27.7&;#177;6.9)％，(26.8&;#177;9．4)％，(26.2&;#177;11.1)％，(71.2&;#177;9.2)％，P&;lt;0.001]。②乳酸脱氢酶漏出率：猪去氧胆酸、牛磺熊去氧胆3.125，1.563，0.781μmol／L浓度组乳酸脱氢酶漏出率均明显低于缺氧缺糖再给氧组[(46．6&;#177;5.6)％，(49.8&;#177;5.3)％，(47．0&;#177;4.0)％，(48.5&;#177;2.7)％，(44.1&;#177;4.3)％，(40．2&;#177;7.5)％，(66.4&;#177;7．6)％，P&;lt;0.001)。③细胞存活率：猪去氧胆酸、牛磺熊去氧胆3．125，1．563，0.781μmol／L浓度组细胞存活率均明显高于缺氧缺糖再给氧组[(44.5&;#177;3.2)％，(45.3&;#177;2．0)％，(41.5&;#177;1．6)％，(41．6&;#177;2.4)％，(37.6&;#177;2．8)％，(40．1&;#177;18)％，(25.6&;#177;3．7)％，P(0.01～0.051。④细胞坏死率：猪去氧胆酸、牛磺熊去氧胆3．125，1．563，0．781μmol／L浓度组细胞坏死率均明显低于缺氧缺糖再给氧组[(19.7&;#177;6.2)％，(23.9&;#177;7.0)％，(26.0&;#177;6.9)％，(21.8&;#177;5．6)％，(18.7&;#177;6.1)％，(25.4&;#177;5．8)％，(46.8&;#177;10.4)％，P&;lt;0.01]。⑤细胞凋亡率：猪去氧胆酸3．125，1．563μmol／L浓度组和牛磺熊去氧胆3．125，1.563，0.781μmol／L浓度组明显低于缺氧缺糖再给氧组[(7.4&;#177;2.7)％，(8.3&;#177;4.0)％，(6.9&;#177;3.8)％，(9.2&;#177;4.5)％，(8．7&;#177;3.6)％,(16．0&;#177;4.8)％，P&;lt;0．05]。结论：猪去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸均可明显地降低神经细胞缺氧缺糖再给氧损伤时的细胞坏死率、凋亡率，显著提高细胞存活率，显著减少乳酸脱氢酶的漏出，表明猪去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸均具有显著的抗神经细胞缺氧缺糖再给氧损伤的作用，并且猪去氧胆酸与牛磺熊去氧胆酸之间没有显著差异。     

衰老大鼠卵巢Bax及血管内皮生长因子表达与滋阴理气中药的干预效应

目的：研究衰老大鼠卵巢中Bax和血管内皮生长因子的表达及滋阴理气中药对其表达的影响．探讨滋阴理气中药延缓衰老的分子机制。方法：实验时间：2004-02／09。实验地点：哈尔滨医科大学生理教研室实验室。将24只2．5个月龄雌性SD大鼠随机分为3组：对照组、模型组和中药组，每组8只。通过腹腔注射D-半乳糖建立衰老大鼠模型，应用反转录聚合酶链反应和免疫组化SP法检测各组卵巢组织中Bax mRNA及血管内皮生长因子蛋白的表达。结果：与对照组相比，模型组卵巢组织Bax mRNA表达增强，血管内皮生长因子蛋白表达阳性目标PU值(7．75&;#177;2．31)较对照组PU值(4．86&;#177;1．52)增大(P&;lt;0，01)；与模型组相比，中药组可下调Bax mR—HA的表达，血管内皮生长因子蛋白表达阳性目标PU值(5．93&;#177;1．78)较模型组(7．75&;#177;2，31)减小(P&;lt;0．05)。结论：D-半乳糖造模可引起卵巢Bax mRNA和血管内皮生长因子蛋白表达上调，滋阴理气中药可下调Bax mRNA和血管内皮生长因子蛋白的表达．这可能是滋阴理气中药延缓卵巢老化的机制之一。     

丹参酮ⅡA磺酸钠影响血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大及p-JNK和丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1的表达

目的：观察丹参酮ⅡA衍生物-丹参酮ⅡA磺酸钠对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大及p-JNK，丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1表达的影响。 方法：实验于2005-11／2006-03于华中科技大学同济医学院实验中心完成。取ld龄新生清洁级Wistar乳鼠10只。雌雄不拘，取心室肌组织分离培养新生大鼠心肌细胞，将细胞均匀地接种于6孔培养板，每孔2mL。第3天将培养的细胞分为5组，即对照组。血管紧张素Ⅱ组，丹参酮ⅡA磺酸钠2，10。50μmol／L组，分别给予相应药物。对照组给予生理盐水，其余各组均给予血管紧张素Ⅱμmol／L进行心肌细胞肥大诱导。在此基础上，丹参酮ⅡA磺酸钠2，10。50μmol／L组再分别给予相应浓度的丹参酮ⅡA磺酸钠，以上浓度为培养基内终浓度。采用考马斯亮蓝法测定心肌细胞蛋白含量；采用[^3H]亮氨酸掺入法测定蛋白合成速率作为心肌肥大指标；用Western-blot测定p-JNK，丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1表达。观察各组心肌细胞总蛋白质含量、[^3H]-亮氨酸掺入测定结果、p-JNK,MKP．1蛋白表达。 结果：①用刺激因素处理24h后，2。10，50μmol／L丹参酮ⅡA磺酸钠组总蛋白含量明显低于血管紧张素Ⅱ组[（65．38&;#177;1．26），（53．41&;#177;3．63），（48．42&;#177;2．61），（80．42&;#177;3．28）μg/孔，P〈0．05—0．011。②1μmol／L血管紧张素Ⅱ作用24h后，2，10，50μmol／L丹参酮ⅡA磺酸钠组心肌细胞合成速率显著低于血管紧张素Ⅱ组[（140．52&;#177;12．04）％，（120．58&;#177;8．72）％。（111．88&;#177;10．06）％，（163．04&;#177;11.38）％。P〈0．011。⑧1μmol／L血管紧张素Ⅱ作用24h后，2，10，50μmol／L丹参酮ⅡA磺酸钠组p—JNK蛋白表达显著低于血管紧张素Ⅱ组[（145．96&;#177;11．98）％，（133．04&;#177;6．54）％，（116．56&;#177;11．61）％，（167．04&;#177;12．72）％，P〈0．05—0．011。④丹参酮ⅡA磺酸钠（10μmol／L）显著上调丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1表达，在40min时达到高峰达（132．16&;#177;7．88）％，随后下降，在60，80min分别为（110．72&;#177;10．94）％。（104．32&;#177;9．55）％，（P〈0．01）。 结论：丹参酮ⅡA磺酸钠可以抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大，机制可能与上调丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1表达。降低p-JNK表达有关。     

体外构建血管内皮生长因子短发夹状RNA表达载体及其对人骨肉瘤细胞相应因子mRNA及蛋白的抑制

目的：设计并构建血管内皮生长因子短发夹状RNA表达载体，检测其对人骨肉瘤细胞血管内皮生长因子mRNA及蛋白表达的影响。方法：实验于2006—01／07在青岛市市立医院试验中心完成。人骨肉瘤细胞系MG-63购自武汉大学生命科学院；pSilence2．1-neo载体带有U6启动子和neo基因（Ambin公司）。①以人血管内皮生长因子的mRNA序列5’-GAT AAC GCG GAT ACC TTG G-3’为靶点，体外构建血管内皮生长因子短发夹状RNA表达载体pSilence2．1-neo-VEGF。②人骨肉瘤细胞MG-63常规培养，消化传代后分为3组：短发夹状RNA载体组转染pSilence2，1-neo-VEGF载体，空载体组转染pSilence2．1-neo载体，空白组无特殊处理。③转染后48h收集各组细胞，采用RT—PCR检测血管内皮生长因子mRNA的表达，免疫组化法检测血管内皮生长因子蛋白的表达。结果：①各组细胞血管内皮生长因子mRNA的表达情况：短发夹状RNA载体组VEGF165 mRNA的相对含量显著低于空白组、空载体组（0．181&;#177;0.010，1．064&;#177;0.019，1．052&;#177;0.036，P〈0．01），而空白组和空载体组之间差异无显著性意义。②各组细胞血管内皮生长因子蛋白的表达：空白组、空载体组多数细胞中出现明显的棕黄色颗粒状细胞质着色，而短发夹状RNA载体组细胞着色较淡。短发夹状RNA载体组的阳性细胞率显著低于空白组、空载体组[（20．12&;#177;2．63）％，（92．45&;#177;7．56）％，（91．76&;#177;5．26）％，P〈0．011，而空白组和空载体组之间差异无显著性意义。结论：pSilence2．1-neo—VEGF可显著抑制人骨肉瘤细胞MG-63血管内皮生长因子mRNA及蛋白的表达，为靶向血管的骨肉瘤基因治疗提供了参考依据。     

低氧条件小鼠胎肝间质细胞血管内皮生长因子的表达：对侧支和新血管生成的促进作用

目的：观察低氧培养条件下小鼠胎肝间质细胞中血管内皮生长因子的表达情况。方法：实验于2004-08／12在暨南大学医学院血液病研究所完成。取孕14．5d小鼠胚胎肝细胞进行贴壁培养及传代。生长至次融合状态的第5代细胞分别在体积分数0．95氮气和体积分数0．05二氧化碳混合气和常规条件下培养。在低氧和常氧培养后2，8，16，32h应用半定量反转录聚合酶链反应和蛋白质印迹技术检测其血管内皮生长因子基因mRNA和蛋白表达。结果：低氧培养2h时聚合酶链反应产物血管内皮生长因子与β-肌动蛋白信号比明显高于常氧培养[(9．83&;#177;3．41)％，(5．47&;#177;2．78)％，F=12．33．P&;lt;0．01]；低氧培养8h时血管内皮生长因子mRNA水平达到高峰，为常氧培养的6．17倍；16h后血管内皮生长因子mRNA表达水平开始下降；32h时血管内皮生长因子mRNA表达水平进一步下降，血管内皮生长因子与β-肌动蛋白信号比明显高于常氧培养组[(18．95&;#177;6．23)％，F=22．76，P&;lt;0．01]。低氧培养4h时血管内皮生长因子蛋白已显著增加，血管内皮生长因子与β-肌动蛋白信号比明显高于常氧培养组[(8．38&;#177;3．24)％，F=10．87，P&;lt;0．01]；16h时达到高峰水平，β-肌动；32h时血管内皮生长因子水平显著下降，血管内皮生长因子与β-肌动蛋白信号比仍明显高于常氧培养组[(17．27&;#177;6．35)％，F=19．38，P&;lt;0．01]。结论：低氧可诱导血管内皮生长因子在小鼠胎肝间质细胞中表达，提示低氧预处理间质细胞在组织缺血损伤如心肌缺血等疾病可能产生治疗作用。     

姜黄素Ⅲ对体内肺腺癌移植瘤裸鼠血管生成的影响

目的：观察中药姜黄的主要活性单体成分中双脱甲氧基姜黄素(姜黄素Ⅲ)抗肿瘤血管生成作用及对内皮细胞生长的抑制作用。方法：本实验于2003-10／2004-04在解放军第三军医大学大坪医院实验动物中心(动物实验)和解放军第三军医大学西南医院烧伤研究所(细胞培养及免疫组化)完成。实验选用BALB／c裸雄性小鼠15只。建立裸小鼠移植模型后，将15只荷有A549肺腺癌的裸小鼠随机分成3个组：①阴性对照组：含60mL／L无水乙醇和60mL／L聚乙二醇400的水溶液，0．2mL／次，隔日腹腔注射1次，共8次。②阳性对照组：O-(氯乙酰甲酰)夫马菌素醇30mg／kg，0．2mL／次，隔日腹腔注射1次，共8次。③姜黄素Ⅲ组：姜黄素Ⅲ100mg／kg，0．2mL／次，隔日腹腔注射1次，共8次。治疗结束后取移植瘤组织，应用免疫组化染色检测移植瘤中CD34，标记微血管密度、血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体1、血管内皮生长因子受体2的表达。结果：15只小鼠全部进入结果分析。姜黄素Ⅲ组微血管密度显著少于阴性对照组[(40．13&;#177;7．05)，(76．67&;#177;10．48)条／200倍视野，P&;lt;0．01]；姜黄素Ⅲ组血管内皮生长因子及其受体血管内皮生长因子受体1，2表达的阳性组织相对灰度值明显低于阴性对照组(1．63&;#177;0．13，1．47&;#177;0．12，1．48&;#177;0．15；2．49&;#177;0．15，1．78&;#177;0．12，2．27&;#177;0．18，P&;lt;0．01)。结论：姜黄素Ⅲ具有确切的抗人肺腺癌细胞系A549裸鼠移植瘤血管生成作用，可能与其抑制移植瘤中肿瘤细胞和／或内皮细胞血管内皮生长因子及其血管内皮生长因子受体1，2的表达有关。     

活血化瘀药对大鼠脑缺血再灌注血管源性脑水肿的影响

目的：探讨预防性应用活血化瘀药对大鼠脑缺血—再灌注所致血管源性脑水肿的作用。方法：大鼠138只单纯随机分为：对照组；假手术组；低剂量短时干预组；高剂量短时干预组；低剂量长时干预组和高剂量长时干预组，采用线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞模型。测定大鼠神经功能缺损程度，检测脑水含量、血清及脑匀浆一氧化氮含量及光镜、电镜的病理改变。结果：药物干预组鼠神经功能缺损程度较对照组轻(P&;lt;0．01)，药物干预组血清一氧化氮含量：假手术组(106．5&;#177;7．5)μmol／L，低剂量短时干预组(94．6&;#177;7．9)μmol／L，高剂量短时干预组(104．7&;#177;6．1)μmol／L，低剂量长时干预组(104．6&;#177;5．6)μmol／L，高剂量长时干预组(112．6&;#177;9．3)μmol／L较对照组(85．7&;#177;6．1)μmol／L高，差异有显著性意义(t=-7．673～-2．832．P&;lt;0．05)，脑匀浆一氧化氮含量：假手术组(46．9&;#177;7．8)μmol／L，低剂量短时干预组(85．9&;#177;5．2)μmol／L，高剂量短时干预组(86．7&;#177;5．3)μmol／L，低剂量长时干预组(81．6&;#177;3．9)μmol／L，高剂量长时干预组(65．5&;#177;7．2)μmol／L较对照组(99．8&;#177;2．6)μmol／L低(t=7．011～20．361，P&;lt;0．01)，病理损害较对照组轻。结论：活血化瘀药能减少缺血再灌注大鼠脑的一氧化氮产生，降低血管源性脑水肿的程度，减轻神经细胞损伤，具有抗缺血再灌注损伤作用。     

血管内皮生长因子基因诱导脑梗死大鼠热休克蛋白70变化与其梗死体积的关系

目的：观察血管内皮生长因子165基因治疗大鼠脑梗死前后热休克蛋白70表达的变化，进一步研究热休克蛋白70在脑梗死中的神经保护作用。方法：实验于2003-03／2004-03在郧阳医学院附属太和医院神经科学研究所完成。选择雌性Winstar大鼠40只，常规饲养观察1周后，随机分为正常对照组5只，不造模，余35只造模后分为假手术组5只，单纯梗死组10只，空载质粒对照组10只，血管内皮生长因子基因治疗组10只。采用改进的线栓法制成Wistar大鼠永久性大脑中动脉闭塞模型，空载质粒对照组和血管内皮生长因子基因治疗组用50μL微量进样器进针约3．5mm，分别注入5μL空载质粒和质粒载体与血管内皮生长因子165基因构成的重组DNA到梗死区．7d后断头取脑。用热休克蛋白70免疫组化染色的方法显示脑中的热休克蛋白70的表达情况；用苏木精-伊红染色显示梗死区，用图像分析仪测定梗死面积。结果：40只大鼠全部进入结果分析。①热休克蛋白70的着色部位在神经细胞的细胞浆和细胞膜，黄褐色细胞即为阳性细胞。②热休克蛋白70的表达：正常对照组与假手术组基本相似[(3．00&;#177;0．89)个／高倍视野，(6．31&;#177;0．63)个／高倍视野，(P&;gt;0．05)]，单纯梗死组与空载质粒对照组基本相似[(23．98&;#177;3．25)个／高倍视野，(23．31&;#177;2．77)个／高倍视野，(P&;gt;0．05)]，单纯梗死组比正常对照组和假手术组明显增加(P&;lt;0．01)。血管内皮生长因子基因治疗组均明显高于与各组[(57．60&;#177;3．46)个／高倍视野(P均&;lt;0．01)]。⑧血管内皮生长因子基因治疗组梗死体积百分率[(9．52&;#177;1．99)％]显著低于单纯梗死组(22．31&;#177;4．18)％和空载质粒对照组[(24．48&;#177;3．51)％，P&;lt;0．01]。空载质粒组与单纯梗死组梗死体积百分率比较基本一致(P&;gt;0.05)。结论：血管内皮生长因子基因可诱导热休克蛋白70的表达增高，脑梗死体积百分率降低。说明热休克蛋白70表达增多与脑梗死体积缩小之间有一种正向关系，亦证明其可能是与缺血有关的一种保护性蛋白。     

丝裂原细胞外信号反应激酶阻断剂对缺氧诱导人视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的：观察特异性丝裂原细胞外信号反应激酶1（MEK1）阻断剂（PD98059）对缺氧刺激的人视网膜色素上皮细胞增殖的影响，并初步探讨其作用机制。 方法：实验于2004-11／2005-1l在江苏省人民医院中心实验室完成。①利用体积分数为0．95的N2和0．05的CO2混合气体建立培养的人视网膜色素上皮细胞细胞缺氧模型。（砻用3种不同浓度（10，50和100μmol／L）的P42／P44MAPK特异性阻断剂PD98059处理视网膜色素上皮细胞细胞。③在缺氧24h后用四甲基偶氮唑盐的方法检测细胞的增殖情况。④用反转录-聚合酶链反应的方法检测周期蛋白DmRNA的表达。⑤收集细胞进行流式细胞仪的检测，判断细胞的周期情况。 结果：①缺氧刺激24h后视网膜色素上皮细胞增殖，缺氧组比正常组增加4．71％。②PD98059对视网膜色素上皮细胞细胞增殖有明显的抑制作用，并具有浓度依赖性；与缺氧组相比，缺氧＋10mmol／L组、缺氧＋50mmol／L组及缺氧＋100mmoL／L组抑制率分别是5．1l％，11．66％和16．36％。③缺氧24h后，细胞周期蛋白DmRNA的浓度明显增加，不同浓度的PD98059对周期蛋白D的mRNA生成有明显的抑制作用，并且呈浓度依赖性，缺氧组与正常组比较周期蛋白D增加26．67％，与缺氧组比较，缺氧＋10mmoL／L组、缺氧＋50mmol／L组及缺氧＋100mmol/L组抑制率分别为18．93％，37．72％，57．58％。④缺氧时DNA合成前期细胞明显增多，细胞的增殖减少。 结论：P42／P44MAPK信号转导通路可能通过对周期蛋白D的影响抑制缺氧时视网膜色素上皮细胞的增殖。     

一氧化氮对心肌细胞缺氧复氧时脂质过氧化损伤的保护作用

目的：研究一氧化氮对培养鼠心肌细胞缺氧复氧所致脂质过氧化损伤的保护作用，探讨心肌缺血修复机制。方法：采用细胞缺氧复氧损伤模型，培养细胞随机分为4组：A组正常对照组(培养3h)；B组单纯缺氧／复氧(A／R缺氧2h复氧1h)；C组缺氧预处理组(缺氧20min后复氧20min，然后缺氧复氧)；D组一氧化氮预处理组[加入S-亚硝基-已酰青酶胺(s-nitroso-n-acety1-penicil—lamine，SNAP)使其终浓度为1mmol／L，预处理40min后A／R。与复氧后测定培养液中肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脱氢酶(1actic dehydrogenase，LDH)活性变化及细胞内丙二醛含量和细胞存活率。结果：与正常组比，单纯缺氧／复氧组CK[(941．35&;#177;152．53)nkat／L]、LDH[(7416．48&;#177;984．20)nkat／L]、丙二醛[(1．35&;#177;0．26)μmol／g]，水平显著升高(P&;lt;0．01)，细胞存活率(54．68&;#177;6．00)％显著降低(P&;lt;0．01)。1mmol／L SNAP预处理组[细胞存活率为(74．55&;#177;4．11)．CK为(582．45&;#177;140．86)nkat／L，LDH为(5766．15&;#177;941．69)nkat／L，丙二醛为(0．89&;#177;0．16)μmol／g]和缺氧预处理组[细胞存活率为(74．69&;#177;6．14)．CK为(547．94&;#177;125．52)nkat／L，LDH为(5882．34&;#177;844．67)nkat/L，丙二醛为(0．85&;#177;0．12)μmol／g]上述变化明显减轻(P&;lt;0．01)。结论：一氧化氮可抑制脂质过氧化反应，减轻自由基对心肌细胞的损伤，对细胞缺氧复氧损伤具有与缺血预处理相似的保护作用。     

高血压心肌纤维化的发病机制：成纤维细胞在血管紧张素Ⅱ刺激下单核细胞趋化蛋白-1的表达状况

目的：研究成年大鼠心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFs)在血管紧张素Ⅱ刺激下单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotaxia protein-1，MCP-1)表达情况，探讨高血压合并心脏损害的可能机制，方法：成年大鼠CFs体外培养，在不同浓度血管紧张素Ⅱ不同作用时间刺激下，应用免疫蛋白印迹法和ELISA法分别测定细胞中和培养上清中MCP-1的含量。结果：①在细胞内和培养上清中均有MCP-1表达。②随着血管紧张素Ⅱ、刺激浓度的增加和刺激时间的延长，细胞内和上清中MCP-1的表达量也逐渐增加。在1&;#215;10^-11，1&;#215;10^-9，1&;#215;10^-8，1&;#215;10^-7，1&;#215;10^-6mol／L的血管紧张素Ⅱ作用下，上清中MCP-1的含量分别为(1．60&;#177;0．21)，(3．18&;#177;0．15)．(4．70&;#177;0．22)，(9．18&;#177;0．52)，(8．75&;#177;0．42)μg／L，与对照组(1．13&;#177;0．09)μg／L比较，除1&;#215;10^-11mol／L组外，差异均有显著性意义(t=26．21-39．67．P均&;lt;0．05)。③在1&;#215;10^-7mol／L的血管紧张素Ⅱ作用下，3，6，12和24h MCP-1的表达量分别为(2．13&;#177;0．31)，(3．25&;#177;0．20)．(5．28&;#177;0．50)和(9．18&;#177;0.52)μg／L，与空白对照组(1.13&;#177;0．09)μg／L比较差异均有显著性意义(t=6.93～34．11，P均&;lt;0．05)。结论：成年大鼠CFs的MCP-1的表达对血管紧张素Ⅱ的刺激有浓度和时间依赖性。CFs的MCP-1的表达可能参与高血压时心肌内的炎性反应和心肌纤维化。     

应用分离微血管段方法培养人脑微血管内皮细胞及对血管内皮细胞生长因子基因表达和细胞超微结构的观察

背景：观察缺氧状态下脑血管内皮细胞的血管内皮细胞生长因子表达及细胞超微结构变化，可为从细胞和分子水平认识血管生成及其相关的细胞因子参与缺血性脑血管疾病的病变过程。目的：构建分离微血管段体外培养人脑微血管内皮细胞的方法，并观察血管内皮细胞生长因子基因表达与细胞超微结构变化。设计：随机对照的技术方法研究。单位：一所军区总医院的神经外科，一所大学医院的神经外科。对象：2002年沈阳军区总医院神经外科脑动静脉畸形患者18例(spetzlerⅡ～Ⅲ级)，全部病例术前均经全脑血管造影证实。取材于手术中切除的完整脑动静脉畸形新鲜标本周围粘连的新鲜脑组织，采用匀浆、过滤和酶消化技术分离微血管内皮细胞。将在培养瓶内生长良好的细胞分成缺氧2，4，8h组和对照组4组，每4瓶为1组。方法：缺氧条件模拟：体积分数0．95N2，体积分数0．05 CO2。免疫组化方法检测细胞中第八因子相关抗原(FⅧ-RA)表达。选用RT-PCR技术观察每组内皮细胞血管内皮细胞生长因子mRNA表达，同时以ELISA方法检测每组细胞上清液中血管内皮细胞生长因子蛋白含量，透射电镜观察细胞超微结构的变化。主要观察指标：对照组和各缺氧组血管内皮细胞中血管内皮细胞生长因子mRNA表达和细胞上清液中血管内皮细胞生长因子蛋白含量，以及细胞超微结构的变化。结果：相差显微镜下，培养的活细胞具有单层“卵石样”排列的典型特征，90％以上的细胞为FⅧ-RA阳性染色。缺氧4h细胞血管内皮细胞生长因子mRNA和蛋白表达为0.98&;#177;0．19，(180、77&;#177;20．15)ng／L，较对照组显著升高[0，(26．20&;#177;6．33)ng／L，P&;lt;0．01]，8h后表达下调[0．35&;#177;0．07，(31．68&;#177;8．34)ng／L]，并出现线粒体肿胀、内质网扩张及溶酶体多囊泡形成。结论：采用分离微血管段方法培养人脑血管内皮细胞，操作简便易行，细胞纯度可靠。缺血缺氧早期血管内皮细胞生长因子表达不足以维持细胞超微结构完整，随缺氧时间延长细胞可发生损伤性变化。     

葛根素对糖尿病患者血液相关因子及血管内皮功能的影响

目的：通过观察葛根素对血内皮素、一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)水平的影响，初步探讨其对糖尿病患者血管内皮的保护作用。方法：将2002-01／2004-01抚顺市中医院内分泌科收治的76例单纯糖尿病患者随机分为单纯糖尿病葛根素治疗组(给予葛根素注射，39例)，丹参对照组(给予复方丹参注射液，37例)，同时选20名糖尿病并血管病变的患者作为糖尿病并血管病变葛根素治疗组(给予葛根素注射)，选20名健康成年人作为健康对照组。葛根素治疗30d，治疗前后检测内皮素、NO，NOS水平。结果：治疗后，单纯糖尿病葛根素治疗组和糖尿病并血管病变葛根素治疗组血内皮素浓度降低，治疗前后的值分别为(107．33&;#177;29．31)，(85．04&;#177;23．62)pg／L和(119．67&;#177;30．73)，(88．12&;#177;27．29)pg／L(P&;lt;0．05)，NO，NOS上升，NO为(50．49&;#177;20．31)，(59．51&;#177;21．19)μmol／L(P&;lt;0．05)；(50．67&;#177;21．19)，(56．88&;#177;22．11)μmol／L(P&;gt;0．05)；NOS为(109．02&;#177;21．84)，(116．86&;#177;16．34)nkat／L和(118．86&;#177;23．34)，(137．19&;#177;22．84)nkat／L(P&;lt;0．05)，以糖尿病并血管病变葛根素治疗组为明显；丹参对照组与治疗前比较，血内皮素略下降(P&;gt;0．05)，血NO，NOS水平稍升高(P&;gt;0．05)。结论：葛根素通过降低内皮素浓度，升高NO，NOS水平而发挥保护糖尿病患者血管内皮的作用。     

衰老对离体大鼠主动脉内皮依赖性血管舒张反应的影响

目的：研究增龄对离体大鼠主动脉内皮依赖性舒张的影响。方法：成年及老年大鼠各20只，利用组织器官水浴系统，通过乙酰胆碱、N-硝基左旋精氨酸，测量离体主动脉环的舒张反应变化(％)。同时利用免疫组织化学方法观察诱导型一氧化氮合酶(inducible nitrleoxide synthase，iNOS)和内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitricoxide svnthase，eNOS)在不同年龄大鼠主动脉中的表达。结果：①老年组大鼠主动脉环对1&;#215;10^-8，1&;#215;10^-7，1&;#215;10^-6，1&;#215;10^-5,1&;#215;10^-4mol／L乙酰胆碱诱发的内皮依赖舒张反应[(3．13&;#177;0．85)％，(12．60&;#177;2．18)％，(25．23&;#177;4．63)％，(37．73&;#177;6．95)％，(50．78&;#177;3．58)％]均较成年组明显减弱，两组之间有显著差异(P&;lt;0．01)。②离体大鼠主动脉环环经1&;#215;10^-4mol／LNNIA预处理20min，阻断一氧化氮合酶(nitricoxide synthase，NOS)后，同样剂量的乙酰胆碱不再诱发上述内皮依赖性舒血管反应。③eNOS组：在老年组血管内膜层可见棕褐色的阳性反应颗粒120．524&;#177;2．037，但较成年组相比，可发现阳性反应明显减弱。iNOS组：成年组内膜及中膜层可见较弱的棕褐色阳性反应颗粒沉在老年组(112．371&;#177;1．64)，阳性反应明显增强。结论：随增龄，血管内皮分泌的一氧化氮逐渐减少，导致血管内皮依赖性舒张减弱；NOS的异常表达对一氧化氮减少起着重要的作用，eNOS随增龄表达减弱，而iNOS随增龄表达则明显增强。     

改善血管桥舒张功能的实验研究：常温下尼可地尔对大隐静脉血管桥内皮源性超极化因子介导血管舒张功能的保护作用

目的：探讨常温下尼可地尔(nicorandil，NCR)和罂粟碱对大隐静脉血管桥血管内皮超极化因子(endothelium—derived hyperpolarizing factor，EDHF)介导血管舒张功能的影响。方法：采用器官槽法研究在37℃有氧条件下用重碳酸盐缓冲液(KH)、含0．1mmol／LNCR的KH、含1．2mmol／L罂粟碱的KH及在0．1mmol／LNCR的KH中分别加入0．12，1．2，12mmol／L罂粟碱浸泡血管环1h后，再用7μmol／L吲哚美辛(indomethacin，Indo)和300μmol／L N-硝基-L-精氨酸作用后，检测30nmol／L U46619及不同浓度A23187引发的血管收缩舒张反应。结果：单纯浸泡于KH中的血管环，A23187引发的血管舒张反应为(66．54&;#177;2．40)％，在含1．2mmol／L罂粟碱的KH和含12mmol／L罂粟碱加NCR的KH中，A23187引发的血管舒张反应分别为(31．36&;#177;2．27)％和(37.71&;#177;6．59)％，与前者相比，后两者明显减低；在含0．1mmol／LNCR的KH和含1．2mmol／L罂粟碱加NCR的KH中，A23187引发的血管舒张反应分别为(64．39&;#177;5．69)％和(63．09&;#177;6．51)％，与单纯浸泡于KH中的血管环无明显差异。电镜所见罂粟碱溶液损害血管内皮细胞，随浓度加深，损害程度加重。含NCR的罂粟碱KH内皮细胞损害减轻。结论：加入了NCR的1．2mmol／L罂粟碱溶液能很好的舒张血管环，并对EDHF介导血管舒张功能有保护作用，高浓度罂粟碱溶液破坏血管内皮，并抑制EDHF介导血管舒张功能。