抗眼镜王蛇毒鸡卵黄抗体的研制及初步应用

目的　研制抗眼镜王蛇毒鸡卵黄抗体 ,并研究该抗体在鸡卵黄中表达过程。方法　以甲醛减毒处理的眼镜王蛇粗毒免疫莱航母鸡 ,母鸡免疫应答后 ,在卵黄中产生抗眼镜王蛇毒抗体 ,应用嗜硫色谱柱HiTrapIgYPurificationHP从鸡卵黄中提取抗眼镜王蛇毒抗体 ;以间接ELISA法及双向免疫扩散测定抗体的效价、特异性及免疫活性 ;采用Lowry氏法测定蛋白含量 ;采用SDS PAGE法测定相对分子质量 (Mr)及鉴定抗体纯度。结果　母鸡初次免疫第 9天即有抗体产生 ,初次免疫 6 0d后抗体效价超过 1∶10 0 0 0 0 ,卵黄抗体经嗜硫色谱柱纯化后 ,经SDS PAGE检测为电泳纯 ,纯化后抗体效价较纯化前提高 4倍 ,每枚蛋中平均可获得较纯抗体 97.5mg。动物体外中和试验表明 ,特异性IgY能有效中和眼镜王蛇毒 ,阻止眼镜王蛇毒对小白鼠的攻击。结论　研制并鉴定了抗眼镜王蛇毒鸡卵黄抗体 ,分析抗体在产蛋期卵黄液中表达的进度 ,为今后该抗体的持续、高质量诱导奠定基础 ,同时也促进其他抗蛇毒鸡卵黄抗体的研究开发及蛇毒单克隆抗体的研制     

广西眼镜王蛇毒杂合性酸性磷脂酶A2的基因克隆与序列分析

目的：研究广西眼镜王蛇毒杂合性酸性磷脂酶A2（APLA2）的基因克隆与序列分析。方法：从广西眼镜王蛇毒腺中提取总RNA，根据种属关系接近的台湾眼镜蛇毒APLA2两端非翻译区的保守序列设计引物，利用RT－PCR进行体外扩增，获得磷脂酶A2基因，克隆至pMD18-T载体，经测序筛选出APLA2－1，APLA2－2及一个新的酸性磷脂酶A2（命名为APLA2－3）。根据测序结果确定了APLA2－3基因的全序列，并由此推导编码的氨基酸序列。结果：利用Antheprot 4.3c蛋白质序列分析软件包计算它的等电点为4．885，相对分子质量为16．543kD，并预测了它的二级结构和部分理化性质，同源性比较表明，APLA2－3的1－39位氨基酸残基序列与APLA2－2相同，其同源性为64％，而40－108位氨基酸残基序列为APLA2－1相同，其同源性为69％，10位氨基酸残基序列皆不同于这两种APLA2。结论：揭示了APLA2具有基因多样性，可能与物种进化和生物活性有关，并为进一步研究PLA2的结构与功能的关系提供更多的信息。     

广西眼镜王蛇毒杂合性酸性磷脂酶A2的基因克隆与序列分析

目的研究广西眼镜王蛇毒杂合性酸性磷脂酶A2(APLA2)的基因克隆与序列分析.方法从广西眼镜王蛇毒腺中提取总RNA,根据种属关系接近的台湾眼镜蛇毒APLA2两端非翻译区的保守序列设计引物,利用RT-PCR进行体外扩增,获得磷脂酶A2基因,克隆至pMD18-T载体,经测序筛选出APLA2-1,APLA2-2及一个新的酸性磷脂酶A2(命名为APLA2-3).根据测序结果确定了APLA2-3基因的全序列,并由此推导编码的氨基酸序列. 结果利用Antheprot 4.3c蛋白质序列分析软件包计算它的等电点为4.885,相对分子质量为16.543kD,并预测了它的二级结构和部分理化性质.同源性比较表明,APLA2-3的1～39位氨基酸残基序列与APLA2-2相同,其同源性为64%,而40～108位氨基酸残基序列与APLA2-1相同,其同源性为69%,109位氨基酸残基序列皆不同于这两种APLA2.结论 揭示了APLA2具有基因多样性,可能与物种进化和生物活性有关,并为进一步研究PLA2的结构与功能的关系提供更多的信息.     

广西眼镜王蛇毒酸性磷脂酶A2—1的表达

将广西眼镜王蛇毒酸性磷脂酶A2—1(APLA2—1)基因克隆至表达载体pET28a( )，转化入大肠杆菌BL21，经过诱导，SDS—PAGE检测，重组质粒pET28a—APLA2—1在18 KD有一明显的表达条带，表达产物APLA2—1约占细菌总量30％，并以包涵体的形式存在，将产物变复性后用Sephadex G—75纯化，产物经过SDS—PAGE检测只有单一条带，通过Western—blot检测，证实纯化产物是酸性磷脂酶A2、对表达的APLA2进行酶活性和药理活性的测定、至此我们在大肠杆菌中表达了广西眼镜王蛇毒APLA2，这将为以后对PLA2的结构与功能的研究打下了良好的基础。     

广西眼镜王蛇毒酸性磷脂酶A2-1的表达

将广西眼镜王蛇毒酸性磷脂酶A2-1(APLA2-1)基因克隆至表达载体pET28a(+),转化入大肠杆菌BL21,经过诱导,SDS-PAGE检测,重组质粒pET28a-APLA2-1在18KD有一明显的表达条带,表达产物APLA2-1约占细菌总量30%,并以包涵体的形式存在,将产物变复性后用Sephadex G-75 纯化,产物经过SDS-PAGE检测只有单一条带,通过Western-blot检测,证实纯化产物是酸性磷脂酶A2.对表达的APLA2进行酶活性和药理活性的测定.至此我们在大肠杆菌中表达了广西眼镜王蛇毒APLA2,这将为以后对PLA2的结构与功能的研究打下了良好的基础.     

卵黄抗体用于眼镜王蛇毒抗原检测的初步研究

眼镜王蛇属于眼镜蛇科、王蛇属，是世界上个体最大的毒蛇，排毒量最大，致死、致残高，早确诊早治疗是降低该类毒蛇咬伤、致死、致残的关键。在蛇伤诊断及蛇毒检测方面，国外主要采用ELISA，由于其使用的诊断试剂中的抗体来源于马等哺乳动物，而这些哺乳动物源性IgG类抗体易产生假阴性或假阳性结果，降低诊断的准确性。卵黄抗体，又称IgY，不仅在预防、治疗人和动物的某些疾病中具有广阔前景，而且由于IgY不会与病人血液样品中类风湿因子、补体系统等发生反应，因而使得其在免疫诊断、生化检测等领域的应用上更具有开发的潜力。国外文献报道制备了针对响尾蛇毒、竹叶青蛇毒等多种蝰蛇科蛇毒的卵黄抗体。     

双价抗蛇毒鸡卵黄抗体制备与生物活性研究

目的 通过双价抗蛇毒鸡卵黄抗体(bivalent anti-snake venom immunoglobulin yolk,双价IgY)的制备及其相关特性研究,为多价抗蛇毒IgY的制备和应用奠定基础.方法 两种单一抗原(舟山眼镜蛇、圆斑蝰泰国亚种)按顺序依次交替注入单只鸡体内,水稀释法制备双价IgY;测定双价IgY效价(间接ELISA法)、交叉免疫特性(双向免疫扩散试验)及对溶膜活性(溶膜试验)、半数致死量(LD50)的中和作用.结果 初次免疫后第28-42天,以水稀释法提取的双价IgY对眼镜蛇毒及蝰蛇毒的效价分别为1:12 800和1:6400.双价IgY与眼镜蛇亚科、蝰业科6种蛇毒有明显的交叉免疫反应,而与蝮亚科4种蛇毒的交叉免疫反应不明显.双价IgY能显著降低眼镜蛇、蝰蛇毒对鸡卵黄膜的溶膜作用,也能显著延长眼镜蛇和蝰蛇伤小鼠的存活时间(P<0.05),同等剂量的双价lgY提高眼镜蛇伤存活率优于蝰蛇伤.结论 双价IgY能够显著中和眼镜蛇、蝰蛇毒的溶膜和致死活性,能有效保护机体免受眼镜蛇毒和蝰蛇毒的攻击.     

白细胞—内皮细胞的体外粘附反应及眼镜蛇毒的影响

F-MLP与白三烯B_4能增加中性多形核白细胞(PMNL)对人脐静脉内皮细胞的粘附率。白三烯B_4处理的PMNL刺激内皮细胞产生6-酮-PGF_1a,F-MLP或自三烯B_4处理的PMNL促进内皮细胞释放von Willebrand因子。眼镜蛇毒抑制F-MLP或白三烯B_4对PMNL粘附的刺激作用,但这种PMNL仍能促进内皮细胞的花生四烯酸代谢与von Willebrand因子释放。而用F-MLP、白三烯B_4和/或眼镜蛇毒预先处理内皮细胞,不影响白细胞的粘附,也不影响内皮细胞释放6-酮-PGF_1a与von Willebrand因子。这些体外试验结果表明,F-MLP与白三烯B_4在刺激PMNL-内皮细胞粘附中主要的靶细胞是PMNL而不是内皮细胞。PMNL在没有粘附于内皮细胞的情况下也可能通过释放某些介质影响内皮细胞的功能。     

蛇毒C型凝集素类似蛋白Agkisacutacin单克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备并鉴定抗蛇毒C型凝聚素类蛋白Agkisacutacin的单克隆抗体(mAb)。方法:以Agkisacutacin蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,通过常规的细胞融合方法制备抗Agkisacutacin蛋白的mAb。用间接ELISA法检测杂交瘤细胞分泌mAb的稳定性。用荧光染色法做杂交瘤细胞的核型分析。用Western blot检测mAb的特异性。结果:获得3株可稳定分泌抗AgkisacutacinmAb的杂交瘤细胞株。结论:成功制备了抗Agkisacutacin的mAb,为检测Agkisacutacin蛋白作为新型抗血栓药物的体内代谢规律的方法和研究抗血栓的机制提供了重要的工具。     

卡洛芬单克隆抗体的制备

目的:制备卡洛芬单克隆抗体,为研制卡洛芬的免疫学快速检测奠定基础。方法:通过活性酯法制备了以牛血清白蛋白(BSA)为载体的免疫抗原卡洛芬-BSA(Carprofen-BSA)和以卵清白蛋白(OVA)为载体的检测抗原卡洛芬-OVA(Carprofen-OVA)。通过免疫BALB/ c 小鼠、杂交瘤技术获得稳定分泌卡洛芬单抗的细胞株51C3,并通过变异系数及添加回收率的测定初步建立了卡洛芬的ELISA 检测方法。结果:将该细胞株注射BALB/ c 小鼠制备腹水单抗。腹水纯化后效价为1 .3.2*105 ,属于IgG1 型。卡洛芬单抗的灵敏度为0.32 ng/ ml,IC50 为0.882 ng/ ml。单抗与布洛芬、酮洛芬、萘普生、非诺洛芬、吲哚洛芬、芬布芬的交叉反应率均小于0.04%。且猪肉样品中卡洛芬的添加回收率在81.4% ~ 104.4% 之间,变异系数在16.3% ~25.8%之间。结论:本研究成功制备了卡洛芬单克隆抗体,该单抗可以成功应用于卡洛芬的ELISA 快速检测,为研制卡洛芬的胶体金快速检测奠定基础。     

SPA单克隆抗体的制备与纯化

以SPA作基础免疫BALB/C小鼠后,融合前三天直接脾内免疫,取脾细胞与SP_2/O瘤细胞常规融合,融合率100％;以快速EIISA检测抗体,阳性率60％。5次有限稀释法克隆化后获得7株杂交瘤细胞,作中和抑制试验,证实为SPA特异性抗体。经鉴定属IgG2a及IgG2b亚类。电镜观察细胞融合,发现细胞内含逆转录病毒。经MAPS—100法纯化单抗腹水,获得了高纯度McAb。     

抗DESMOPLAKIN I单克隆抗体的制备

作者从水牛鼻表皮中分离桥粒,提取桥粒中的Desmoplakin I(DPI)。用DPI作免疫原,免疫BALB/C小鼠,建立了一株分泌抗DPI单抗的细胞AD-1。免疫组化染色证实,该单抗与上皮组织呈阳性反应,与非上皮性组织呈阴性反应。提示该单抗可作为区分上皮性肿瘤与非上皮性肿瘤的免疫组化探针。     

结肠癌单克隆抗体的制备和鉴定

用1高碘酸处理结肠癌组织,然后免疫小鼠制备单克隆抗体.获得2株产生高效价、针对结肠癌抗原的抗体杂交瘤细胞株C_8和C_(102)。经免疫组织化学染色后知其抗原定位于结肠癌腺体的上皮细胞及其分秘物.由Immunoblotting知其抗原的分子量为20万道尔顿.初步研究表明,C_8和C_(102)是特异性较强的针对结肠癌的单克隆抗体(IgG2b).经高碘酸(或胰酶)处理证明,其相应抗原决定基部分是蛋白质而不是多糖.     

甲胺磷单克隆抗体制备及鉴定

目的：制备并鉴定甲胺磷农药单克隆抗体。方法：用500mg/mL PEG 4000作融合剂进行细胞融合，HAT（H，次黄嘌呤；A，氨基喋呤;T,鹃腺嘧啶）培养基选择性培养，自制的显微操作装置进行亚克隆。用间接ELISA（酶联免疫吸附测定）和间接竞争ELISA方法对2株细胞进行鉴定，并测定与其它农药的交叉反应率。结果：得到2株稳定分泌甲胺磷抗体的单克隆细胞株，命名为1C3和2C6；间接ELISA法表明2株细胞与载体牛血清蛋白质（Bovine serum albumin,BSA)和卵清蛋白质（Ovalbumin,OVA)反应成阴性；间接竞争ELISA法表明2株细胞上清液内的抗体可以竞争性地与甲胺磷结合；2株单克隆细胞均系IgG1亚类；1C3细胞诱导腹水纯化后的抗体与其它有机磷农药几乎没有交叉反应。结论：成功制备2株分泌抗甲胺磷抗体的单克隆细胞株，并可用于检测甲胺磷的研究。     

免疫抑制法制备单克隆抗体的研究

用马的红细胞作抗原，先用不含靶抗原的Ｍ２６红细胞和环磷酰胺免疫小鼠，而后再用含靶抗原的Ｍ１７红细胞免疫小鼠。结果显示：经用环磷酰胺抑制后，试验组产生抗非靶抗原抗体的孔数为１５孔，而对照组为１７９孔。试验组获得仅与Ｍ１７红细胞起反应的抗体为１１孔，对照组为８孔。经克隆后，结果显示：在与５５匹含靶抗原的马红细胞反应中。试验组与５２匹起反应，而对照组与４６匹起反应。在与１０１匹不含靶抗原的马红细胞反应中，试验组与３４匹起反应，而对照组与６０匹起反应。这表明，采用环磷酰胺做抑制剂的免疫抑制法，可有效的抑制抗非靶抗原抗体的产生，减少筛选的工作量，而获得的单克隆抗体（单抗）特异性要比对照组强。