抗HPV18 E6多肽单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备特异性抗人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)18 E6多肽抗体。方法 通过在线分析软件ABCpred和Bcepred预测HPV 18E6特异性多肽序列,将多肽序列与牛血清蛋白(bovine albumin,BSA)偶联,以偶联后多肽为抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗HPV18 E6多肽单克隆抗体; 以HPV18阳性分泌物标本DNA为模板,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)获得HPV 18 E6基因,将该基因插入表达质粒pET-28a,转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导目的蛋白表达; 采用Western Blot方法鉴定抗HPV18 E6多肽抗体与目的蛋白的反应性。结果 建立的杂交瘤细胞株能稳定产生HPV18 E6多肽单克隆抗体; 重组表达质粒pET-28a-HPV18 E6测序证明构建正确,成功表达HPV18 E6蛋白; 纯化后的抗HPV 18 E6多肽抗体可特异性识别原核表达HPV 18 E6蛋白。结论成功制备抗HPV18 E6多肽序列,该抗体具有较好的特异性。     

HPV16型E6蛋白单克隆抗体制备及检测

目的制备人乳头瘤状病毒(human papillomavirus,HPV)16型E6蛋白单克隆抗体并对其进行检测。方法 15只Balb-c小鼠分为3组,各5只。设计3条HPV16E6抗原多肽分别对3组小鼠进行免疫,筛选得到对B细胞表位有较高活性的线性多肽HPE601,并用该组的小鼠脾脏制备杂交瘤细胞。采用间接ELISA法对小鼠血清进行阳性克隆筛选和检测抗体效价,采用考马斯亮蓝染色鉴定抗体纯度,采用标准曲线计算抗体浓度,采用Western blot法检测并采用间接免疫荧光法验证纯化E6抗体对Caski、Hela和正常宫颈上皮细胞核蛋白特异性结合情况。行宫颈组织活检患者20例,其中HPV16型宫颈组织7例,HPV18型宫颈组织6例和正常宫颈组织7例,采用免疫荧光法检测单克隆抗体对3种组织的检出率。结果制备得到单克隆抗体Whu001,经鉴定抗体纯度较好,该克隆能特异性识别HPV16型E6蛋白;Whu001对HPV16型组织的检出率(80%)明显高于HPV18型宫颈组织(15%)和正常宫颈组织(0),差异有统计学意义(P0.05)。结论成功筛选出了针对HPV16E6抗原的单克隆抗体,其对HPV16的诊断具有特异性,为在蛋白水平上检测HPV E6蛋白提供了新途径。     

登革病毒1型E蛋白的原核细胞表达及多克隆抗体的制备

目的构建登革病毒1型（DENV-1）E蛋白的原核细胞表达载体并进行原核细胞表达,并制备其多克隆抗体。方法利用聚合酶链反应（PCR）扩增DENV-1E蛋白序列,经酶切后将其插入原核细胞表达载体pET-32a（＋）,构建重组质粒pET-32-D1-E。重组质粒转化E.Coli Rosetta（DE3）感受态细胞,目的蛋白经异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,纯化后采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）初步分析蛋白表达情况,并用纯化后的表达蛋白免疫家兔,制备该蛋白的多克隆抗血清,用间接酶联免疫吸附测定（ELISA）检测抗体的效价,Western blot检测抗体的特异性。结果成功构建了pET-32-D1-E原核细胞表达重组质粒,DENV-1E蛋白获得高效表达;纯化后的重组蛋白免疫家兔获得的特异性抗血清效价为1∶25 600,Western blot证实其特异性良好。结论成功构建了DENV-1E蛋白的原核细胞表达载体,并制备了可用于DENV快速检测的高效多克隆抗体。     

利用重组蛋白制备和鉴定分枝杆菌HSP65单克隆抗体

目的制备针对牛分枝杆菌热休克蛋白65（HSP65）的单克隆抗体（mAb）并进行鉴定。方法以CpG ODN1826／Alum为佐剂，不同的HSP65融合蛋白为免疫抗原和检测抗窄，用聚乙二醇（PEG）法制备杂交瘤细胞，ELISA检测杂交瘤细胞分泌抗体的效价和类型，Western blot分析抗体的特异性。结果获得5株稳定分泌抗HSP65蛋白的MeAb，3株细胞分泌的mAb为IgG1亚类，2株为IgG2a。ELISA和Western blot结果显示，mAb能特异性结合HSP65-PSA-tag、HSP65-MUC1-tag和HSP65重组蛋白，但与Chaperon-PSA重组蛋白和宿主菌BL21的菌体裂解蛋白不发生结合。结论纯化的重组蛋白可代替的牛分枝杆菌，用于HSP65 mAb的制备和鉴定。获得的HSP65 mAb为HSP65及其重组蛋白的功能研究奠定基础。     

超嗜热古菌组蛋白HPhA单克隆抗体制备与初步应用

目的 制备针对超嗜热古菌组蛋白HPhA的单克隆抗体并进行鉴定。方法 以重组纯化蛋白HPhA为抗原。用聚乙二醇（PEG）法制备杂交瘤细胞，ELISA检测杂交瘤细胞分泌抗体的效价和类型，Western blotting分析抗体的特异性。结果 获得3株稳定分泌抗HPhA蛋白的单克隆抗体（MAb），3株单克隆抗体1A12、3C11、384分别属于IgG1、IgM和IgG2b亚类。ELISA和Western blotting结果显示，单克隆抗体3B4能特异性结合HPhA及PEA-HPhA重组蛋白。结论 抗HPhA单克隆抗体可用于HPhA和PEA-HPhA检测。     

IL1RAP单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备针对白血病干细胞(LSC)表面标志蛋白IL1RAP(IL-1 receptor accessory protein)的特异性单克隆抗体并对其进行鉴定。方法:杂交瘤细胞3H6E10、10D8A7种植BALB/c小鼠腹腔,收获腹水,纯化后得到特异性抗人IL1RAP的单克隆抗体。分别应用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Nondenaturing-PAGE)、ELISA和Western blot法对纯化单克隆抗体分别进行抗体纯度、效价和敏感性检测。结果:获得了两种IL1RAP纯化单克隆抗体,命名为3H6E10 Mc Ab和10D8A7 Mc Ab,其纯度分别为95%和94%;两种纯化的单克隆抗体效价为1∶81000,且能特异性识别IL1RAP纯化蛋白、正常人及白血病病人的细胞内源性蛋白。结论:本研究成功制备了能特异性结合人IL1RAP的纯化单克隆抗体,为将来有效清除体内LSC提供了新途径。     

兔抗人KiSS-1抗体的制备与鉴定

目的 制备兔抗人KiSS-1多克隆抗体.方法 聚合酶链反应（PCR）法扩增出KiSS-1基因,将其克隆入原核表达载体pET28中,转化大肠埃希菌BL21（DE3）.采用异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白的表达,采用镍离子螯合琼脂糖凝胶（Ni^2＋-NTA）亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免疫家兔,制备多克隆抗体,并用酶联免疫吸附测定（ELISA）、Western blot及免疫组织化学法检测抗体.结果 成功构建了KiSS-1原核表达载体pET28/ KiSS-1,高效表达并纯化KiSS-1蛋白,间接ELISA检测所制备抗体的效价为1：6 400.Western blot鉴定制备的抗体与KiSS-1蛋白能特异性结合,免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人卵巢癌组织中的天然KiSS-1.结论 成功制备了效价高、特异性较强的兔抗人KiSS-1抗体,为进一步探讨KiSS-1在卵巢癌的发生、发展过程中的作用奠定了基础.     

铜绿假单胞菌VgrG1a蛋白的原核表达及其人鼠嵌合型单抗的制备与鉴定

目的：探究铜绿假单胞菌Ⅵ型分泌系统VgrG1a蛋白的原核表达方法，并制备鼠源性和人鼠嵌合型单克隆抗体为抗铜绿假单胞菌感染提供了研究基础。方法：根据NCBI网站上查找到的VgrG1a序列合成重组质粒pET-21a-VgrG1a，转化大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）plysS进行诱导。通过免疫沉淀法和酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）对诱导得到的重组蛋白进行表达、纯化和鉴定。用纯化后的VgrG1a重组蛋白免疫BALB/c小鼠，制备鼠源多克隆抗体，并利用ELISA方法测定小鼠血清抗体的效价和特异性。通过P3X63Ag8.653骨髓瘤细胞融合小鼠脾细胞制备杂交瘤细胞，再通过有限稀释法获得单克隆细胞。经多次ELISA筛选出能够稳定产出特异性抗体的细胞株。在公司测序后获得单克隆抗体的序列信息，并设计出含有此抗体的质粒，转染Expi293细胞，制备人源化单克隆抗体。结果：结果显示，实验成功构建了VgrG1a重组质粒，经探索在最佳表达诱导条件下（温度16℃，IPTG浓度0.5mM，诱导时间16小时），表达得到了重组蛋白VgrG1a，SDS-PAGE显示72kDa处重组蛋白浓度最高。检测制备的鼠源抗体在稀释到1/640000后效价仍较高，并且与目的蛋白能够能特异性的识别并结合。人鼠嵌合型单克隆抗体8A4F5对抗原VgrG1a亲和力高于鼠源单克隆抗体。结论：以上结果表明，该原核表达的重组蛋白具有良好的免疫原性，利用表达的重组蛋白制备的单克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性，为进一步研究蛋白的结构与功能、研制相关的诊断试剂及疫苗提供了生物材料。     

Galectin-7多克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备鼠抗重组半乳糖凝集素7(Galectin-7)多克隆抗体及其在膀胱癌组织中特异性鉴定。方法 PCR法从人包皮组织中扩增Galectin-7基因,并构建到pET28a表达载体中,使用IPTG诱导重组蛋白的表达,通过镍柱亲和层析纯化获得Galectin-7蛋白。以纯化的Galectin-7蛋白混合福氏完全佐剂免疫Balb/C小鼠制备抗体,并用ELISA,Western blot及免疫组织化学法检测抗体。结果 成功表达、纯化了Galectin-7重组蛋白,ELISA检测Galectin-7蛋白免疫的小鼠血清效价为1:32 000,Western blot显示该抗体能与天然的Galectin-7特异结合,免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人膀胱肿瘤组织的天然Galectin-7。结论 通过制备重组Galectin-7蛋白为免疫原,免疫家兔,成功地制备了效价高、特异性好的抗Galectin-7多克隆抗体。     

人心肌肌钙蛋白Ⅰ基因的原核表达及抗体制备

目的 进行人心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)基因原核表达裁体的构建,获得高纯度的心肌肌钙蛋白I并制备相应的多克隆抗体.方法 利用RT-PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人心肌肌钙蛋白I的cDNA片段,将其插入原核表达载体形成重组体并导入宿主菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达出带6个组氨酸标签的融合蛋白,Ni-NTA树脂纯化,纯化后的融合蛋白免疫小鼠,制备抗血清.通过ELISA,Western blot鉴定血清效价和特异性.结果 成功构建了cTnI的原核表达载体,并在大肠埃希菌中获得了高效表达.Western blot检测证实获得了抗cTnI抗体.结论 成功表达了cTnI蛋白并制备了其特异性抗体.     

人心肌肌钙蛋白I基因的原核表达及抗体制备

目的进行人心肌肌钙蛋白I（cardiac troponinI，cTnI）基因原核表达载体的构建，获得高纯度的心肌肌钙蛋白I并制备相应的多克隆抗体。方法利用RT—PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人心肌肌钙蛋白I的cDNA片段，将其插入原核表达载体形成重组体并导入宿主菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导，表达出带6个组氨酸标签的融合蛋白，Ni—NTA树脂纯化，纯化后的融合蛋白免疫小鼠，制备抗血清。通过ELISA，Western blot鉴定血清效价和特异性。结果成功构建了cTnI的原核表达载体，并在大肠埃希菌中荻得了高效表达。Western blot检测证实获得了抗cTnI抗体。结论成功表达了cTnI蛋白并制备了其特异性抗体。     

人Tamm-Horsfall片段蛋白的表达及单克隆抗体的制备和鉴定

目的 构建人Tamm-Horfall蛋白（THP）抗原决定簇的原核表达载体,表达纯化重组人Tamm-Horfall片段蛋白并制备单克隆抗体.方法 将人Tamm-Horfall蛋白片段cDNA克隆至原核表达载体pET28a,经大肠杆菌表达、纯化,获得的Tamm-Horfll蛋白片段免疫小鼠,取其脾淋巴细胞与sp2/0细胞融合,制备能产生THP蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,进一步采用Western blot、ELISA、免疫组化等技术对制备的单克隆抗体进行鉴定.结果 原核表达重组质粒在大肠杆菌中能高效表达THP蛋白抗原决定簌的蛋白片段,用纯化的THP蛋白片段制备了鼠抗THP单克隆抗体.结论 成功制备了9株THP单克隆抗体,为进一步研究THP蛋白的分布、结构、功能及检测试剂盒的研发奠定了基础.     

pEGFP-HPV16 E6重组质粒的构建及其在Hela细胞中的表达定位

目的 构建以绿色荧光蛋白（Green fluorescen ceprotein，GFP）为报告基因的重组表达质粒pEGFP—HPV16 E6。方法 利用脂质体转染体外培养的Hela细胞，在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pEGFP—HPV16 E6融合蛋白在细胞中的分布和定位，用Western blot方法验证其蛋白的表达。结果 表明在空载体pEGFP—C2转染组中，Hela细胞内绿色荧光呈弥散分布；重组质粒pEGFP—HPV16 E6转染组中，绿色荧光集中在细胞核中。Western blot的结果确证了pEGFP—HPV16 E6融合蛋白的表达。结论 提示pEGFP—HPV16 E6融合基因真核表达载体在真核细胞Hela中获得了表达，细胞所表达的融合蛋白具有HPV16 E6和EGFP的双重活性，可用荧光显微镜直接观察其表达情况及业细胞定位，为HPV16 E6的功能研究提供了线索。     

人survivin蛋白的表达、纯化与单克隆抗体制备

目的:表达人survivin重组蛋白并制备单克隆抗体.方法:表达含有survivin基因的重组质粒pRSETB-survivin,表达人survivin重组蛋白,以此为抗原,常规方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与NS21细胞融合,得稳定分泌survivin mAb的杂交瘤细胞株,ELISA检测mAb的相对亲和力,Western blot检测mAb的特异性.间接免疫荧光观察骨肉瘤细胞中survivin的表达情况.结果:重组载体pRSETB-survivin转化入大肠杆菌BL21中表达所得蛋白经Western blot验证为目的蛋白.筛选出2株能稳定分泌特异性抗人survivin的mAb杂交瘤细胞株,免疫球蛋白亚类均为IgG类;单克隆抗体的亲和常数为S1 1.52×10-9mol/L,S2 2.31×10-9mol/L.Western blot结果显示,2株单抗识别相对分子质量为20 000的survivin单一条带,并发现在骨肉瘤细胞中survivin主要表达在胞浆内.结论:成功地表达出人survivin重组蛋白,制备出抗人survivin mAb,为进一步用于survivin的免疫学检测及骨肉瘤生物学治疗奠定了基础.     

人肝素酶蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

目的构建人肝素酶蛋白的原核表达载体,表达并纯化重组人肝素酶蛋白和制备其单克隆抗体。方法将人肝素酶cDNA克隆至原核表达载体pET30a(+),经大肠杆菌表达、纯化后,获得的肝素酶纯化蛋白免疫小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合,制备能产生肝素酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株,进一步采用Western blotting、ELISA等技术对制备的单克隆抗体进行初步鉴定。结果原核表达重组质粒在大肠杆菌中能高效表达人肝素酶蛋白,并进一步从10株杂交瘤细胞中选取了3株能稳定分泌人肝素酶单抗的杂交瘤细胞株。结论成功制备了3株人肝素酶特异性单克隆抗体。     

抗热休克蛋白72多克隆抗体血清的制备和检测

目的 探讨在大肠杆菌中表达人热休克蛋白72（hHSP72）与组氨酸（His）的融合蛋白并制备其抗体血清的方法。方法 将hHSP72片断插入His融合表达载体pPROEX-1^TM，重组载体酶切鉴定后，在大肠杆菌中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达获得His-hHSP72融合蛋白。采用纯化后的HSP72免疫新西兰白兔，制备抗血清；蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测重组抗原的免疫活性。结果 重组质粒酶切鉴定结果表明，hHSP72基因已正确插入到pPROEX-1^TM中，经IPTG诱导后，表达出分子质量约为73ku的蛋白，获得了效价为1：100000的多克隆抗体。Western blot检测证明，所制备的多克隆抗体可以与hHSP72特异性结合，其效价高于市售的单克隆抗体。结论 用hHSP72片断在大肠杆菌中能成功表达，并能制备得到多克隆抗体；这种多克隆抗体是一种新的高特异性和高灵敏度的试剂。     

人肝素酶蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

目的构建人肝素酶蛋白的原核表达载体,表达并纯化重组人肝素酶蛋白和制备其单克隆抗体。方法将人肝素酶cDNA隆至原核表达载体pET30a（＋）,经大肠杆菌表达、纯化后,获得的肝素酶纯化蛋白免疫小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2／0细胞融合,制备能产生肝素酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株,进一步采用Western blotting、ELISA等技术对制备的单克隆抗体进行初步鉴定。结果原核表达重组质粒在大肠杆菌中能高效表达人肝素酶蛋白,并进一步从10株杂交瘤细胞中选取了3株能稳定分泌人肝素酶单抗的杂交瘤细胞株。结论成功制备了3株人肝素酶特异性单克隆抗体。     

戊型肝炎病毒pb166-GST融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 利用谷胱甘肽S转移酶（GST）融合基因表达系统表达、纯化及鉴定HEVpb166-GST融合蛋白，为研制戊型肝炎诊断抗原探索新的途径。方法 由本室制备的重组大肠杆菌（E．coli）B121株，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导HEVpb166-GST融合蛋白表达，用BDBiosience GST蛋白纯化系统对重组蛋白进行纯化，采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western blot对纯化的蛋白进行鉴定，并对实验条件和结果进行分析。结果 在LB培养液中的E．coliB121株能稳定、高效表达HEVpb166-GST融合蛋白；纯化后的成分单一，仅在43000处有表达，该蛋白能被GST特异性抗体识别。结论 我们的方法可获得高效的重组HEVpb166．GST融合蛋白，为进一步研制戊型肝炎诊断性抗原奠定了基础。     

人5型腺病毒六邻体蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗人5型腺病毒(HAdV5)六邻体(Hexon)蛋白的单克隆抗体并对其进行鉴定。方法用纯化的Hexon蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经ELISA间接法筛选和克隆化培养,获得4株分泌抗HAdV5的Hexon蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。纯化获得单克隆抗体,使用ELISA和Western blot鉴定单克隆抗体的敏感性和特异性。结果 ELISA和Western blot结果表明这4株单克隆抗体与HAdV5的Hexon蛋白可以特异性结合。单克隆抗体株4A9-HRP标记和8D6建立的ELISA夹心法具备较高灵敏度和特异性。结论获得4株抗HAdV5的Hexon蛋白的单克隆抗体,为HAdV5相关的疫苗研制和HAdV5感染性疾病的早期快速诊断奠定了基础。     

HPV 16型L2全长原核融合蛋白的交叉反应特性研究

目的 研究HPV 16型L2全长蛋白在HPV6、11、16和18型别间的交叉反应特性.方法 收集108例尖锐湿疣患者、156例宫颈癌患者和100名健康对照者的血清标本,采用PCR法从宫颈癌患者组织DNA中扩增HPV16 L2全长基因,将其克隆至原核表达载体PGEX-4T-1中,构建重组质粒PGEX-4T-1-HPV16 L2,将鉴定正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和WB鉴定;进一步通过WB检测HPV16 L2全长融合蛋白与HPV6、11、16和18型DNA检测阳性的患者血清的特异性结合能力.以镍螯合亲和层析柱(Nj-NTA Agarose)纯化HPV16 L2融合蛋白作为包被抗原,采用间接ELISA法检测3组标本中的HPV血清特异性IgG抗体.结果 成功构建了重组质粒PGEX-4T-1-HPV16 L2,含有HPV16 L2的融合蛋白在原核表达体系中呈较高效表达,表达量为27.2%;SDS-PAGE和WB检测结果显示在约相对分子质量82 000处可见特异性阳性信号条带;以HPV6、11、16和18 DNA阳性患者血清为一抗的WB结果显示,HPV16 L2全长融合蛋白在相对分子质量82 000处均出现特异性阳性信号条带.ELISA结果显示,尖锐湿疣组、宫颈癌组和健康对照组血清抗体A值分别为0.825±0.409、0.808±0.376、0.128±0.15,阳性率分别为92.6%、92.3%和6.0%.3组间血清抗体A值及阳性率差异均具有统计学意义(H=207.292,x2=251.846,P均＜0.01),而尖锐湿疣组与宫颈癌组之间的血清抗体均值(0.825和0.808)差异无统计学意义(H=0,P＞0.05).结论 HPV16 L2全长原核融合蛋白具有较强的抗原性,与HPV6、11、16和18型别间具有交叉反应,可进一步用于HPV感染及其相关肿瘤ELISA血清学检测试剂的通用型靶抗原研究.