ERK1／2抑制剂PD98059对大肠癌细胞侵袭和转移的影响

目的观察细胞外信号调节蛋白激酶（ERK1／2）抑制剂PD98059对大肠癌细胞侵袭和转移的影响,探讨其可能机制。方法PD98059不同浓度（0、10、20、40μmo1／L）干预大肠癌细胞24h。用Boyden小室检测其体外运动和侵袭能力,Western blot法检测ERK1／2磷酸化蛋白和ERK1／2蛋白表达情况。结果随着PD98059剂量增大,大肠癌细胞穿膜数逐渐减少（P〈0．05）,磷酸化ERK1／2蛋白水平逐渐降低（P〈0．05）,ERK1／2蛋白水平无明显变化（P〉0．05）。结论PD98059能抑制大肠癌细胞的运动和侵袭力;其机制与PD98059抑制磷酸化ERK1／2有关。     

整合素与钙通道协同调节人肾小管上皮细胞转分化过程及其机制

目的 用转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导人肾小管上皮细胞（HK-2）转分化,探讨转分化过程中可能的细胞信号转导机制。方法 25ml TGF-β1（5ng／ml）刺激HK-2,用特异性细胞外信号调节激酶（ERK）抑制剂PD98059（25μmol／L）和（或）钙通道拮抗剂Nifedipine（10μmol／L）处理;于不同时间段分别用免疫荧光、S-P法和免疫印迹法检测黏着斑激酶（FAK）、整合素β1（β1-Integrin）。结果 相比空白组TGF-β1成功诱导HK-2转分化;TGF-β1刺激15min后FAK-Tyr397磷酸化增强,60min达顶峰。相比TGF-β1对照组,PD98059使FAK-Tyr397的磷酸化减弱（P〈0．05）,而Nifedipine无明显抑制作用（P〉0．05）,两者协同作用明显（P〈0．01）;PD98059使FAK蛋白表达呈时间依赖性减弱（P〈0．05）,PD98059及Nifedipine均呈时间依赖性抑制β1-Integrin表达（P〈0．05）。二者协同作用明显（P〈0．01）。结论 TGF-β1与Integrin信号通路之间通过ERK／FAK相互作用;钙通道参与调节FAK活化及FAK与β1-Integrin的表达。     

PGE2诱导人胃癌BGC-823细胞HIF-1α、VEGF表达的信号转导途径研究

目的研究前列腺素E2（PGE2）诱导人胃癌细胞株（BGC-823）、低氧诱导因子-1α（HIF—1α）、血管内皮生长因子（VEGF）表达的信号转导途径。方法应用100μmol／L的PGE。联合不同浓度的MAPK阻滞剂PD98059（10、50和100μmol／L）或磷酸肌醇3-激酶（P13K）阻滞剂Wortmannin（50、100和200nmol／L）作用于BGC-823细胞24h,收集细胞,行Western blot检测HIF-1α、VEGF的表达。结果正常对照组BGC-823细胞低度表达HIF-1α、VEGF蛋白,100μmol／LPGE。刺激细胞24h显著诱导HIF-1α、VEGF蛋白表达。PD98059或Wortmannin均对PGE2诱导的HIF-1α和VEGF蛋白表达产生剂量依赖性抑制,100μmol／LPD98059几乎全部阻断了PGE2对HIF-1α和VEGF蛋白表达的诱导（P〈0．01）,而200nmol／LWortmannin可部分阻断PGE2的这种作用。结论PGE2可能通过激活MAPK和／（或）P13K信号转导途径调控HIF—1α蛋白表达,进而促进VEGF表达。     

表型遗传修饰对人结肠癌细胞周期和抑癌基因表达的调控

目的：分析和探讨同一结肠癌细胞系DNA甲基化和组蛋白乙酰化对抑癌基因表达和细胞周期的影响。方法：培养结肠癌细胞HT－29、SW1116和Colo-320，分别以去甲基化制剂5－氮脱氧胞苷（5－aza-dC）和（或）组蛋白脱乙酰化酶（HDAC）抑制剂trichostatinA(TSA)及丁酸盐干预细胞。提取基因组DNA和RNA，部分行甲基化特异性PCR（MSP）检测p16^INK4A基因启动子区甲基化情况；以RTPCR研究p16^INK4A和p^21WAF1 mRNA表达水平；同时以流式细胞仪分析SW1116和Colo-320细胞周期。结果：干预前，HT－29、SW1116和Colo-320三种结肠癌细胞系中均有较弱的p16^INK4A表达；SW1116和Colo-320细胞的p21^WAF1表达缺如，对于HT－29细胞，1μmol/L的5－aza-dC干预时则无显著改变。在SW1116和Colo-320细胞中，5－aza-dC干预后p16^INK4A表达增强，且以10μmol/L或5μmol/L浓度干预24h者为最明显，相反p21^WAF1仍无明显表达，该两个细胞系经TSA或丁酸盐使细胞阻滞于G1期。结论：三种人结肠癌细胞中，p16^INK4A基因的表达均受甲基化调节。SW1116和Colo-320细胞中p21^WAF1基因表达主要受乙酰化调节，在该两个细胞系中，乙酰化使细胞周期停滞于G1期。     

罗格列酮对PDGF-BB刺激的人气道平滑肌细胞增殖的影响

目的探讨罗格列酮对血小板源性生长因子BB（PDGF-BB）刺激的人气道平滑肌细胞（HASMCs）增殖的影响。方法组织块贴壁法培养HASMCs鉴定后，接种于96孔板，除空白对照组外，A、B、C、D组各孔在加入PDGF-BB前30min分别加入0、1、5、10μmol／L罗格列酮。MTS／PMS微量比色法检测各组HASMCs细胞A490吸光度，流式细胞仪检测细胞周期分布。结果A组A490值高于空白对照组，B、C、D各组均高于A组（P均〈0．05）；与空白对照比较，单加入PDGF-BB后G0／G1期细胞比率降低，S期升高；用1、5、10μmol／L罗格列酮预处理的ASMCs在G0／G1期细胞比率逐渐升高，S期逐渐降低（P均〈0．05）。结论罗格列酮呈剂量依赖性抑制PDGF-BB刺激的HASMCs增殖。     

丁酸钠和1，25-（OH）2D3对人结肠癌细胞增殖和hTERT表达的影响

背景：端粒酶在肿瘤细胞永生化过程中起重要作用．人端粒酶逆转录酶（hTERT）是调节端粒酶活性的关键因素。有研究发现生物活性制剂丁酸钠和1n,25-二羟维生素D3[1．25-（OH）,D3]具有潜在抗肿瘤效应。目的：观察丁酸钠和1,25-（OH）：D3对人结肠癌细胞增殖的影响及其可能机制。方法：以不同浓度丁酸钠（0．5～2．0mmol／L）、1,25-（0H）2D3（10^-6～10^-6mol/L）或两者联合[1．0mmol／L丁酸钠＋10^-7mol／L1,25-（OH）2D3]诱导人结肠癌细胞株HT29,MTT法检测细胞生长抑制率,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,RT—PCR检测hTERTmRNA表达。结果：丁酸钠和1,25-（OH）2D3能剂量和时间依赖性地抑制HT29细胞生长：1．0mmol／L丁酸钠和10^-7mol／L 1．25-（OH）2D3能诱导HT29细胞G0／G1期阻滞和细胞凋亡,抑制hTERTmRNA表达。联合用药组的上述作用较两者单用更为明显（P〈0．05）。结论：丁酸钠和1,25-（OH）2D3抑制人结肠癌细胞增殖的作用与其通过下调hTERT基因表达而抑制端粒酶活性、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡有关：两者联合可产生协同作用．     

选择性环氧合酶-2抑制剂NS-398对人肝癌细胞株HepG2增殖和凋亡的影响

目的探讨选择性环氧合酶-2抑制剂NS-398对人肝癌HepG2细胞株的生长抑制、诱导凋亡及其对bcl-2表达的影响。方法采用MTT法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞周期、凋亡及凋亡相关蛋白bcl-2的表达。结果NS-398抑制HepG2的增殖活性，经20、40、80和160μmol／L的NS-398处理细胞48h后，其抑制率分别为6．72％、16．21％、20．86％和25．34％，呈剂量依赖效应关系；细胞经160bLmol／L的NS-398处理24h、48h和72h后，G。／G1期细胞由76．07±0．75％分别减少至62．27±0．74％、59．17±1．47％和53．03±1．60％（P〈0．05），S期细胞由11．40±0．79％分别增加至13．23±0．81％、16．20±1．95％和16．60±1．25％（P〈0．05），G2／M期细胞无明显变化；凋亡细胞增多，凋亡率分别为8．47％、16．3％和23．9％；细胞经160μmol／L的NS-398处理48h后bcl-2蛋白与对照组比，表达下调（P〈0．01）。结论NS-398对人肝癌细胞株HepG2有抑制增殖、诱导凋亡作用，细胞凋亡的机制可能与细胞凋亡相关基因bcl-2表达下调有关。     

MEK通路抑制剂对人胰腺癌细胞生长及细胞周期相关抑癌基因表达的影响

目的 观察细胞外信号调节激酶信号通路(MEK)抑制剂对人胰腺癌细胞生长及细胞周期相关的抑癌基因表达的影响。方法 培养人胰腺癌细胞系CFPAC1、PANC1和MiaPaCa2,应用50μmol/L的MEK抑制剂PD98059处理细胞24h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞仪分析细胞周期,实时定量PCR法检测p16INK4a、p21 WAF1和p27KIP1 mRNA的表达,蛋白质印迹法检测DNA甲基化酶(Dnmt)1、3a和3b表达,甲基化特异性PCR(MSP)分析p16INK4a基因启动子甲基化状况。结果 PD98059处理24h后,CFPAC1、PANC1和MiaPaCa2细胞的增殖抑制率分别为69％、78％和45％;G0/G1期细胞比例分别从(68.21±0.73)％、(56.54±0.68)％、(54.89±0.79)％增加到(80.37±0.65)％、(72.05±0.52)％、(79.21±0.93)％(P值均＜0.05);S期和G2/M期细胞比例相应减少。PD98059处理后,CFPAC1、PANC1细胞p27KIP1、p21WAF1和p16INK4a mRNA表达增加,Dnmt1和Dnmt3b蛋白表达减少;p16INK4a启动子甲基化状态被去除。而MiaPaCa2细胞仅p27KIP1 mRNA表达增加;p21WAF1、p16INK4a mRNA和Dnmt表达均无明显变化。结论 MEK通路抑制剂可能通过下调DNA甲基化酶、上调细胞周期相关抑癌基因表达而抑制胰腺癌细胞周期进展和细胞增殖。     

5-脱氧杂氮胞苷预防二甲基肼诱发小鼠大肠癌的研究

目的探讨二甲基肼（DMH）诱导小鼠大肠癌模型中5-脱氧杂氮胞苷（5-aza—dC）预防肿瘤发生的作用机制。方法80只ICR小鼠分为4组，每组20只。包括空白对照组、5-aza—dC对照组、DMH诱癌组和5-aza-dC干预组。处理20周后观察其对肿瘤发生率的影响。实时定量PCR检测Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b基因和抑癌基因p27^Kip1的表达。结果通过5-aza-dC干预能使诱导的大肠肿瘤发生率从95％降至35％，肿瘤数目（个）由9．43±4．21减少到3．98±2．95，肿瘤最大直径（单位：mm）由6．43±5．12缩小到3．44±2．11，差异有统计学意义（P〈0．05）。实时定量PCR检测发现肿瘤组织中存在Dnmt1和Dnmt3b的高表达，而p27^Kip1的表达量降低。5-aza—dC可以通过抑制甲基化酶活性，防止p27^Kip1基因的高甲基化失活。结论5-aza-dC可以显著降低DMH诱发小鼠大肠癌的发生率，阻止抑癌基因的高甲基化失活可能是5-aza-dC预防肿瘤的重要机制。     

ERK1／2抑制剂PD98059对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨ERKI／2抑制剂PD98059对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖和凋亡的影响。方法应用免疫组化法检测HepG2细胞中ERK1／2的表达,不同浓度PD98059处理HepG2细胞48h后,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡变化。结果HepG2细胞中ERK1／2呈强阳性表达,PD98059明显下调ERK1／2表达,抑制HepG2细胞增殖,诱导肝癌细胞凋亡,呈剂量依赖趋势（P〈0．05）。结论ERK1／2抑制剂PD98059能够通过诱导细胞凋亡从而抑制HepG2细胞增值。     

MSK1和RSK2介导的组蛋白磷酸化对人结直肠癌细胞恶性表型的影响

背景:ERK-MAPK信号通路与消化系肿瘤的发生、发展密切相关。前期研究发现抑制ERK-MAPK信号转导可能通过抑制其下游效应分子MSK1、RSK2活性而降低组蛋白H3磷酸化水平,进而下调原癌蛋白c-fos表达,抑制人结直肠癌细胞增殖。目的:探讨MSK1、RSK2与组蛋白磷酸化对人结直肠癌细胞肿瘤相关基因表达和恶性表型的影响。方法:以不同浓度ERK-MAPK阻断剂U0126干预人结肠癌细胞株HCT1 16和SW11 16,或以RNA干扰技术靶向沉默细胞中的MSK1、RSK2表达,分别采用CCK-8实验、流式细胞分析和蛋白质印迹法检测经不同处理的肿瘤细胞的增殖情况、细胞周期分布以及MSK1、RSK2磷酸化位点、组蛋白H3磷酸化水平和MSK1、RSK2、c-fos蛋白表达。结果:U0126能阻断人结直肠癌细胞MSK1(Thr581)、RSK2(Ser386)的磷酸化活化,转染MSK1 siRNA或RSK2 siRNA能特异性抑制MSK1、RSK2表达,导致组蛋白H3(Set10)磷酸化水平降低,c-fos蛋白表达下调,肿瘤细胞发生G0/G1期阻滞,细胞增殖显著受抑(P均<0.05)。结论:阻断ERK-MAPK信号转导可能通过抑制MSK1(Thr581)、RSK2(Ser386)磷酸化活化及其介导的组蛋白H3磷酸化而下调肿瘤相关基因如c-fos表达,从而抑制人结直肠癌细胞的恶性表型。     

抑制细胞外信号调节激酶转导结直肠癌细胞组蛋白磷酸化和基因表达的影响

目的 观察人结直肠癌细胞中细胞外信号调节激酶-丝裂原激活蛋白激酶(ERK-MAPK)信号转导途径与组蛋白磷酸化水平及其相关蛋白表达的关系,及其对细胞增殖和细胞周期的影响.方法 培养结直肠癌细胞系SW1116、HCT116,以终浓度分别为0、10、20及40μmol/L的ERK-MAPK阻断剂U0126干预细胞.细胞计数试剂盒(cell counting kit,CCK-8)检测细胞活力影响,以流式细胞术(flow cytometry,FCM)研究细胞周期变化,Western免疫印迹法分析组蛋白H3激酶核糖体S6丝氨酸-苏氨酸激酶2(ribosomal S6 kinase 2,RSK-2)、丝裂原和应激-激活的激酶1和2(mitogen-and stress-activated kinase 1 and 2,MSK1和MSK2)、组蛋白H3(Ser10)磷酸化水平及c-Fos蛋白表达变化情况.结果 CCK-8法检测发现ERK-MAPK阻断剂能以剂量和时间依赖方式明显抑制2种结直肠癌细胞的增殖,增殖率可下降至对照组的47%;并能明显增加G0/G1期细胞百分比(P<0.01),而S期细胞百分比明显减少(P<0.01).Western印迹结果显示U0126干预后,H3激酶MSK1和RSK2表达明显降低,分别为对照HCT116的28%和40%,而MSK2蛋白水平在2个细胞系中均无明显变化.相应地,组蛋白H3磷酸化(Ser10)水平亦降低,相关蛋白c-Fos的表达亦明显下降.结论 抑制ERK-MAPK信号转导可能通过抑制组蛋白H3激酶MSK1、RSK2活性而降低组蛋白H3磷酸化水平,进而减少c-Fos蛋白表达,从而抑制人结直肠癌细胞的增殖和生长.     

氧化苦参碱对人结肠癌细胞株SW1116细胞周期通路相关调控因子的影响

背景：氧化苦参碱为中药苦参的主要有效成分，研究显示其对结肠癌细胞具有杀伤作用。目的：观察氧化苦参碱对人结肠癌细胞株SW1116细胞周期通路相关调控因子的影响，阐明其抗结肠癌作用的分子机制。方法：分别以2、3、4mg／m1氧化苦参碱干预SW1116细胞24h或48h，以流式细胞仪检测细胞周期，以逆转录聚合酶链反应（RTPCR）和蛋白质印迹法检测细胞周期蛋白（cyclin）D1、细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）、CDK抑制剂p53、核转录岗子E2F1和S期激酶相关蛋白2（Skp2）mRNA和蛋白水平的表达。结果：氧化苦参碱干预可使SW1116细胞周期阻滞于G0／G1期，cyc1inD1、CDK4、E2F1和Skp2mRNA和蛋白表达显著下降，p53mRNA和蛋白表达显著上升，作用呈剂量和时间依赖性（P〈0．05）。结论：氧化苦参碱可通过影响细胞周期相关通路以抑制人结肠癌细胞增殖。     

肝癌细胞对5-氮杂-2'-脱氧胞苷的敏感性与细胞总DNA甲基化水平无关

目的 比较不同肝癌细胞株对5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-dC)的敏感性,探讨肝癌细胞对5-aza-dC的敏感性是否与细胞总DNA甲基化水平有关.方法 用不同剂量(0.5、5.0、10.0μmol/L)的5-aza-dC处理肝癌细胞株(HepG2、QGY7701和HepG2.2.15细胞)及正常肝细胞株L02,比较不同浓度处理前后的细胞增殖抑制率,比较10 μmol/L 5-aza-dC处理前后的Caspase-3活性及细胞DNA片段化水平(5-溴脱氧尿嘧啶核苷掺入率),比较不同细胞总DNA甲基化水平.组间检测结果比较采用t检验.结果 5-aza-dC对HepG2、QGY7701、HepG2.2.15、L02细胞的半数抑制浓度分别为0.5、0.5、4.5、11.4μmol/L,与HepG2细胞和QGY7701细胞相比,HepG2.2.15绌胞和L02细胞对5-aza-dC不敏感.HepG2和QGY7701细胞中Caspase-3的活性升高较L02和HepG2.2.15细胞明显(P值均＜0.05),QGY7701细胞中5-溴脱氧尿嘧啶核苷掺入率升高较L02细胞明显(P＜0.05).L02、HepG2、QGY7701和HepG 2.2.15细胞的DNA总甲基化水平分别为11.7%±0.9%、10.9%±1.3%、11.7%±1.7%和12.2%±1.0%,差异无统计学意义(P值均＞0.05).结论 细胞对5-aza-dC的敏感性与细胞总DNA甲基化水平无关.     

Effects of lysophosphatidic acid on human colon cancer cells and its mechanisms of action

AIM： To study the effects of lysophosphatidic acid （LPA） on proliferation, adhesion, migration, and apoptosis in the human colon cancer cell line, SW480, and its mechanisms of action. METHODS： Methyl tetrazolium assay was used to assess cell proliferation. Flow cytometry was employed to detect cell apoptosis. Cell migration was measured by using a Boyden transweU migration chamber. Cell adhesion assay was performed in 96-well plates according to protocol. RESULTS： LPA significantly stimulated SW480 cell proliferation in a dose-dependent and timeependent manner compared with the control group （P 〈 0.05） while the mitogen-activated protein kinase （MAPK） inhibitor, PD98059, significantly blocked the LPA stimulation effect on proliferation. LPA also significantly stimulated adhesion and migration of SW480 cells in a dosedependent manner （P 〈 0.05）. Rho kinase inhibitor, Y-27632, significantly inhibited the upegulatory effect of LPA on adhesion and migration （P 〈 0.05）. LPA significantly protected cells from apoptosis induced by the chemotherapeutic drugs, cisplatin and 5-FU （P 〈 0.05）, but the phosphoinositide 3-kinase （PI3K） inhibitor, LY294002, significantly blocked the protective effect of LPA on apoptosis. CONCLUSION： LPA stimulated proliferation, adhesion,migration of 5W480 cells, and protected from apoptosis. The Ras/Raf-MAPK, G12/13-Rho-RhoA and PI3K- AKT/PKB signal pathways may be involved.     

环氧合酶-2抑制剂吡罗昔康对结肠癌细胞生长的影响

目的观察非甾体类抗炎药、环氧合酶(COX)-2抑制剂吡罗昔康(Piroxicam)对结肠癌细胞的影响，并结合COX-2蛋白表达和细胞凋亡情况探讨结肠癌的预防。方法细胞株选用SW1116结肠腺癌细胞；细胞增殖实验时，用MTT法测定细胞增殖活性；用免疫组化及Western Blot方法检测细胞内COX-2蛋白表达；用DNA云梯电泳法检测细胞凋亡。结果吡罗昔康能够抑制结肠腺癌细胞的增殖，其效应与浓度呈正相关；浓度≥1．0mmol／L时呈现细胞毒作用。吡罗昔康作用12h即可显著抑制COX-2蛋白的表达；作用24h后，蛋白水平恢复程度与浓度成负相关。吡罗昔康浓度≥0．1mmol／L时可以诱导SW1116细胞的凋亡。结论吡罗昔康抑制结肠腺癌细胞的增殖与抑制COX-2过度表达和促进细胞凋亡有关，由于吡罗昔康的效应呈现浓度和时间依赖性，在进行预防或治疗结肠癌的临床研究时，要考虑其有效剂量和用药间隔。     

Microarray analyses reveal liver metastasis-related genes in metastatic colorectal cancer cell model

Purpose

To study the molecular mechanisms of colorectal cancer liver metastasis.

Methods

Cecal wall implantation was performed in nude mice to subclone a highly liver metastatic human colorectal cancer clone (SW1116-M) from SW1116. In vivo and in vitro assays were adopted to confirm the proliferation and metastasis potential. The human tumor metastasis PCR microarrays were used to analyze the differential gene expressions. The results were confirmed further by real-time quantitative PCR.

Results

SW1116-M and SW1116-S5, two human colon cancer cell clones with different metastatic potential, were subcloned from SW1116. In SW1116-M, in vitro invasion, migration and in vivo metastatic potential were higher, and in vitro proliferation rate was lower than SW1116-S5. In tumor metastasis PCR microarray, 24 genes related to cell invading, adhesion, cellular growth and differentiation were found with a twofold difference between SW1116-S5 and SW1116-M. Sixteen of these, including E-cadherins, MTSS1, TRAIL and TRPM1, were up-regulated; eight genes including cathepsin L, EphB2, HGF, MET, MCAM and RORβ were down-regulated.

Conclusions

We have established a highly liver metastatic clone. The subsequent metastasis PCR microarray analysis identified a procedure of cellular differentiation and mesenchymal to epithelial transition (MET) in liver metastasis. The colonization to from macrometastasis is not a switch from cell cycle arrest but a result of cell differentiation and MET.     

miR-93 suppresses proliferation and colony formation of human colon cancer stem cells

AIM:To identify differentially expressed microRNAs(miRNAs) in human colon cancer stem cells(SW1116csc) and study their function in SW1116csc proliferation.METHODS:SW1116csc were isolated from the humancolon cancer cell line,SW1116 and cultured in serumfree medium. A miRNA microarray was used to detect differential expression profiles of miRNAs in SW1116cscand SW1116 cells. Real-time quantitative polymer asechain reaction(PCR) was performed to verify the differential expression of candidate miRNAs obtained f...