构建携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的重组反转录病毒表达载体pLXSN-Kozak-EGFP及鉴定

背景:增强型绿色荧光蛋白作为报告基因可在活细胞中表达发光蛋白.研究表明通过促进表达增强的Kozak序列可促进基因编码的蛋白质在真核细胞中的表达.目的:构建含增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak-EGFP重组反转录病毒表达载体,并对此重组载体进行鉴定.方法:用聚合酶链反应方法从含增强型绿色荧光蛋白基因的表达载体pEGFP-N1上高保真克隆出EGFP基因,通过分子克隆技术将目的基因重组至反转录病毒表达载体pLXSN.用菌斑快速聚合酶链法筛选阳性重组子,针对目的基因插入载体的方向设计鉴别插入方向的引物,用聚合酶链反应法、限制性酶法鉴定目的基因及连接的正向性,并对pLXSN-Kozak-EGFP重组载体进行DNA测序分析.结果与结论:从pEGFP-N1载体中克隆出上游含Kozak序列的EGFP基因,目的条带大小约750 bp.构建的pLXSN-Kozak-EGFP重组子经菌落PCR鉴定,750 bp处有特异性条带.插入方向经PCR鉴定,350 bp处有特异性条带.限制性内切酶法鉴定,750与6000 bp处有特异性条带.DNA测序比对结果表明克隆的目的基因与Kozak-EGFP一致性为100%.结果提示实验成功构建了含EGFP报告基因与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak-EGFP重组反转录病毒表达载体,且插入方向为正向.     

慢病毒载体介导红色荧光蛋白基因转染人脑胶质瘤干细胞的实验研究

目的 探讨HIV-1来源的慢病毒载体介导红色荧光蛋白(RFP)基因转染人脑胶质瘤干细胞可行性和试验方法.方法用无血清干细胞培养基培养人脑胶质瘤干细胞,然后用细胞免疫荧光染色检测其干细胞特性表面标志物CD133、Nestin表达情况.以HIV-1来源的慢病毒为载体,以RFP基因为目的 的基因转染人脑胶质瘤干细胞,荧光显微镜下观察RFP阳性细胞表达情况及其转染率.MTT法检测转染后细胞与未转染RFP细胞组细胞增殖情况.再次用细胞免疫荧光染色检测转染后脑胶质瘤干细胞表面标志物CD133、Nestin表达情况.结果 红色荧光慢病毒转染胶质瘤干细胞体外连续培养后,RFP在干细胞中稳定表达,在荧光显微镜下即发出红色荧光,并且转染效率高.RFP- lentivirus转染后干细胞与未转染RFP组比较,生长曲线无明显差异,且转染后干细胞表面标志物仍表达阳性.结论 采用HIV-1来源的慢病毒载体介导以RFP基因为生物标记物标记人脑胶质瘤干细胞是可行的,以慢病毒转染对干细胞的生长影响小,转染效率高.     

报告基因系统的研究进展

综述氯霉素转乙酰酶（CAT），β-半乳糖苷酶（β-gal),β-葡萄糖苷酸酶（p-GUS)，分泌型碱性磷酸酶（SEAP），荧光素酶（luc)，绿荧光蛋白（GFP）等报告基因系统研究与应用进展；简要介绍主要报告基因分析系统商品化试剂盒的研制及其应用范围和优缺点。     

大鼠miR-1慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定大鼠miR-1慢病毒过表达系统。方法采用EcoRⅠ酶双酶切将目的基因从合成载体上酶切后连接入EcoRⅠ线性化慢病毒载体,连接产物转化后进行阳性克隆鉴定。成功构建的miR-1重组质粒与慢病毒辅助包装质粒及Lipofectamine 2000共转染293T细胞,产生慢病毒浓缩液并标定病毒滴度。重组慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,观察转染效率及miR-1表达水平。结果测序结果显示目的基因与Genebank序列完全一致;孔稀释法检测病毒滴度为3×108 TU/μL;以感染复数（MOI）50感染大鼠MSCs,感染效率达90%以上,聚合酶链反应显示miR-1高水平表达。结论成功构建大鼠miR-1慢病毒表达载体并可高效转染大鼠MSCs,为进一步研究miR-1基因的相关功能提供了合适的载体。     

慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在小鼠T淋巴细胞中的表达

本研究构建含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体三质粒系统,并观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。应用亚克隆技术将多聚嘌呤通道(PPT)元件、泛醌启动子(PUB)和绿色荧光蛋白基因(GFP)连接至pLO134载体,构建成pTK153载体。之后应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统(包括包装质粒△NRF、转移质粒pTK153和包膜蛋白质粒VSV-G)共转染293T细胞,12小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,72小时收集病毒上清并感染小鼠T淋巴细胞,在荧光显微镜下和应用流式细胞仪(FACS)观察感染情况。结果表明:慢病毒载体的三质粒系统转染293T细胞12小时后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,FACS分析转染效率为(63.04±7.24)%,病毒滴度测定为(3.09±0.61)×106U/ml。感染小鼠T淋巴细胞后,荧光显微镜下观察到GFP的表达,FACS分析转导效率为(37.98±6.26)%。结论:成功构建了含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体,对小鼠T淋巴细胞有较高的感染效率。     

人EZH2基因编码区及3’非翻译区融合蛋白重组慢病毒表达载体构建及其在293T细胞中的表达

目的构建携带人EZH2基因编码区(coding region,CDS)及3’非翻译区(3’untranslated region,3’UTR)融合红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)重组慢病毒表达载体,使mCherry-EZH2融合蛋白在293T细胞中稳定表达。方法运用In-Fusion定向克隆技术构建人EZH2基因CDS区及3’UTR融合蛋白重组慢病毒表达载体,测序无误后抽提质粒,转染293T细胞,包装病毒,测定病毒滴度。Western blot检测mCherry-EZH2的表达。结果测序证实重组慢病毒表达载体基因序列完全正确;病毒颗粒包装成功,滴度为1.59×109IU/ml;Western blot检测293T细胞中可以表达mCherry-EZH2融合蛋白。结论成功构建人EZH2基因CDS区及3’UTR融合蛋白重组慢病毒表达载体及病毒,其mCherry-EZH2可以在293T细胞中稳定表达。为进一步分析可能调控EZH2基因CDS区及3’UTR表达的miRNA奠定前期实验基础。     

构建携带重组人胰岛素基因慢病毒表达载体及其病毒包装

背景:腺病毒载体作为脂肪组织工程转基因载体,在应用中存在转导细胞免疫排斥及炎症反应等问题.应用慢病毒作为载体转染干细胞尤其是应用含胰岛素基因的慢病毒载体转染干细胞可避免腺病毒载体的诸多问题.目的:实验拟构建含有人重组胰岛素(insulin)与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并进行病毒颗粒包装.方法:应用聚合酶链反应方法获得目的基因,在目的基因上、下游分别加上BamHⅠ,AscⅠ两个酶切位点,进行T载体克隆,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选获得重组质粒.用限制性内切酶酶切,将目的基因片段和pLenti6.3-IRES-EGFP载体连接,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选获得慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并进行测序.抽提慢病毒载体,转染293T细胞,包装病毒,测定病毒滴度.结果与结论:通过聚合酶链反应获得长度为347 bp带有BamHⅠ和AscⅠ序列的目的基因.pMD1 8-T载体和慢病毒表达载体pLenti6.3-IRES-EGFP连接,慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP构建与预期相匹配,成功包装慢病毒颗粒.     

利用重组慢病毒载体建立稳定表达绿色荧光蛋白细胞系

目的：利用重组慢病毒载体将绿色荧光蛋白基因（GFP）导入293T细胞,建立稳定表达GFP的细胞系,将GFP作为靶基因观察不同方法调节基因表达的效力的差异。方法：以载体质粒pHR＇-pCMV-GFP、包装质粒pCMV-ΔR8.2及包膜质粒pCMV-VSVG用磷酸钙共沉淀法共转染包装细胞系293T,收集病毒颗粒再次感染293T细胞,用克隆环筛选出荧光亮度较强的细胞克隆。多次传代后,流式细胞术检测细胞荧光表达的稳定性。同时进行靶向GFP的RNA干扰,观察GFP表达下调情况,验证该细胞系用于研究基因调控方法的有效性。结果：利用重组慢病毒载体可有效建立GFP稳定表达的新细胞系,此细胞系中GFP阳性细胞占99%以上,12次传代前后GFP表达无明显差异;靶向GFP的RNAi可以显著下调GFP表达。结论：成功建立了表达GFP的G4细胞系,并可有效地用于基因调节方法的研究。     

HABP1基因慢病毒干扰和表达载体的构建及表达

摘要：目的：构建慢病毒介导的透明质酸结合蛋白1基因（HABP1）干扰载体及表达载体,建立HABP1降表达及过表达的稳定肾癌细胞系786-0。 方法：合成人HABP1基因短发夹RNA(shRNA)干扰序列,与慢病毒载体pLKO.1-TRC连接产生重组质粒pLKO.1-shHABP1;双酶切质粒pCDNA3.1(-)-HABP1-Flag,将目的基因片段连接到pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体上,组成重组表达载体pCDH-HABP1;酶切鉴定及DNA测序后,转染293T细胞,收集慢病毒颗粒感染786-0细胞,嘌呤霉素筛选稳定细胞系,western blot验证HABP1蛋白的表达水平。 结果：构建成干扰载体pLKO.1-shHABP1及表达载体pCDH-HABP1;与随机序列对照组比较pLKO.1-shHABP1转染的786-0细胞HABP1表达水平(0.30±0.01)明显降低(t=25.98,P<0.05),pCDH-HABP1转染786-0细胞后,HABP1的表达水平（3.20±0.40）明显升高(t=10.34,P<0.05)。 结论：成功构建HABP1基因的干扰载体及表达载体,且786-0细胞可稳定降表达及过表达HABP1。     

大鼠Ngb基因慢病毒表达载体构建及鉴定

目的:克隆大鼠脑红蛋白(Ngb)基因,构建其慢病毒表达载体Lentivirus-Ngb,并转染原代培养的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)。方法:人工合成大鼠Ngb cDNA,连接至pLenti6.3-IRES-EGFP慢病毒载体,选择阳性克隆进行酶切鉴定和测序,并将其包装至慢病毒,共转染293T细胞,收获病毒颗粒,检测病毒滴度,PCR检测Ngb的表达。用包装成功的病毒液感染BMSCs,显微镜下观察BMSCs细胞,Western-blot检测Ngb蛋白在BMSCs中的表达。结果:PCR产物双酶切和基因测序确定Ngb连接正确;感染72 h后,荧光显微镜下可以看到GFP阳性的BMSCs细胞,Westen-blot检测表明Ngb在感染慢病毒的BMSCs中表达。结论:成功构建大鼠Ngb基因慢病毒表达载体pLen-ti-Ngb-IRES-EGFP,并成功转染BMSCs。     

ELL慢病毒表达载体的构建及其感染前列腺癌PC3细胞的研究

目的构建ELL基因的慢病毒表达质粒,探讨其感染人前列腺癌PC3细胞的可行性。方法将含有全长ELL的质粒和慢病毒表达载体经双酶切后连接,构建成重组慢病毒载体质粒pCDH1-MCS1-EF1-copGFP—ELL。对慢病毒载体质粒进行双酶切和测序鉴定后,制备包装病毒并转染人前列腺癌细胞系PC3。结果慢病毒载体质粒pCDH1-MCS--EF1-copGFP—ELL的酶切和测序结果与预计的序列一致。慢病毒感染人前列腺癌PC3细胞后能稳定高表达ELL。结论成功构建了ELL的慢病毒表达载体,ELL可被成功转染人人前列腺癌细胞。     

截短型小鼠成纤维细胞生长因子受体-1基因慢病毒载体构建及在真核细胞中的表达

本研究旨在克隆小鼠成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1,fgfr1)基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的截短型fgfr1(△fgfr1)重组慢病毒载体并在真核细胞中表达。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以BALB/c胎鼠脑组织为模板克隆全长型fgfr1基因,连接至克隆载体pCR-Blunt,通过反向PCR技术删除胞内磷酸化区域获得△fgfr1,限制性内切酶酶切后亚克隆至慢病毒转移质粒,构建携带EGFP及△fgfr1双顺反子自身失活型重组慢病毒表达质粒,通过脂质体转染法与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染包装细胞293FT,超速离心浓缩病毒颗粒后转染293FT细胞,用荧光显微镜及流式细胞术(FCM)检测EGFP的表达,免疫印迹法(Western blot)鉴定截短型FGFR1蛋白表达。结果表明,成功克隆小鼠fgfr1基因,构建重组慢病毒转移载体LV-IRES-EGFP-△fgfr1及对照载体LV-IRES-EGFP,三质粒系统共转染293FT细胞后获得病毒滴度达到108 TU/ml。以重组病毒载体转染293FT细胞后第4天在荧光显微镜下观察到较强绿色荧光表达,FCM检测转染效率可达95%,Western blot检测显示,转染后293FT细胞表达截短型FGFR1蛋白。结论:成功构建了自身失活型慢病毒载体LV-IRES-EGFP-△fgfr1,并在真核细胞中获得表达。     

New developments in lentiviral vector design,production and purification

Introduction: Lentiviruses are a very potent class of viral vectors for which there is presently a rapidly growing interest for a number of gene therapy. However, their construction, production and purification need to be performed according to state-of-the-art techniques in order to obtain sufficient quantities of high purity material of any usefulness and safety.

Areas covered: The recent advances in the field of recombinant lentivirus vector design, production and purification will be reviewed with an eye toward its utilization for gene therapy. Such a review should be helpful for the potential user of this technology.

Expert opinion: The principal hurdles toward the use of recombinant lentivirus as a gene therapy vector are the low titer at which it is produced as well as the difficulty to purify it at an acceptable level without degrading it. The recent advances in the bioproduction of this vector suggest these issues are about to be resolved, making the retrovirus gene therapy a mature technology.     

携带TRAIL基因慢病毒载体的构建及其体外感染淋巴瘤细胞效率

本研究目的构建携带人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因的慢病毒载体,并研究其对不同细胞系的淋巴瘤细胞的感染效率。采用分子克隆技术,将针对TRAIL基因mRNA的cDNA片段插入到克隆载体pGM-T,构建pGM-T-TRAIL,然后将测序正确的TRAIL基因克隆至慢病毒表达载体pWPI,构建慢病毒表达载体pWPI-TRAIL。最后利用pWPI/VSV-G/Δ8.2慢病毒包装系统,通过转染293T细胞,制备重组慢病毒plenti-TRAIL,并进行浓缩和滴度测定。将重组慢病毒载体感染不同来源的淋巴瘤细胞系,测定荧光表达评价感染效率,利用RT-PCR和Western blot法评价TRAIL基因的表达情况。结果表明,酶切鉴定及测序结果表明pGM-T-TRAIL和pWPI-TRAIL载体构建成功,滴度测定结果显示浓缩的重组慢病毒plenti-TRAIL浓度可达109IU/ml。感染效率结果显示YTS细胞较DOHH2和Jurkat细胞更易被慢病毒感染(P<0.05)。RT-PCR和Western blot实验表明淋巴瘤细胞后plenti-TRAIL感染后可有效地表达TRAIL基因。结论:成功构建了慢病毒表达载体pWPI-TRAIL,并制备出重组慢病毒plenti-TRAIL。plenti-TRAIL可以有效感染不同细胞来源的淋巴瘤细胞系,同时感染后的淋巴瘤细胞可以有效表达TRAIL基因。     

携带人VE-cadherin基因的慢病毒载体的构建及其在Sup-B15白血病细胞株的表达

本研究旨在构建携带人血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)基因的重组慢病毒载体及探讨VE-cadherin蛋白在Sup-B15细胞中的表达。采用RT-PCR扩增人VE-cadherin基因并克隆至pCR-Blunt载体。将VE-cadherinDNA片段连入慢病毒转移质粒pLB,生成重组慢病毒质粒pLB-VEC。用三质粒共转染法包装慢病毒,重组慢病毒感染Sup-B15细胞,在光学显微镜下观察细胞状态,用流式细胞术及Western blot法鉴定VE-cadherin蛋白表达。结果表明,成功扩增出人VE-cadherinDNA片段并克隆至pCR-Blunt载体;亚克隆构建慢病毒载体pLB-VEC。经三质粒包装系统包装后获得高滴度慢病毒颗粒,体外可有效感染Sup-B15细胞。感染后细胞发生明显的形态改变,流式细胞术及Western blot检测到VE-cadherin蛋白表达。结论 :成功构建携带人VE-cadherin基因的慢病毒载体pLB-VEC,并可在Sup-B15白血病细胞株获得有效的表达。     

人GLIPR-2基因慢病毒RNAi载体的构建及鉴定

目的 构建人GLIPR-2基因慢病毒RNA干扰（RNAi）载体,并鉴定其感染人肝癌细胞系HepG2后缺氧条件下的GLIPR-2基因表达变化.方法 根据GLIPR-2基因序列合成siRNA片段,克隆至慢病毒载体pMAGic7.1上,转染293T细胞进行包装,收获并浓缩重组慢病毒颗粒.感染HepG2细胞,流式细胞术检测GFP的表达率,并用Western blot检测目的 蛋白在缺氧条件下的表达变化.结果 重组RNAi质粒pMAGic7.1-shRNA-GLIPR-2经菌落PCR鉴定及测序证实构建正确;稳定感染HepG2 细胞后,GFP的表达率为分别为84.48%、69.97% 和39.82%;Western blot结果显示慢病毒转染组GLIPR-2蛋白的表达水平较对照组明显降低.结论成功构建了GLIPR-2基因慢病毒RNAi载体,该载体在缺氧条件下可明显抑制目的 蛋白在HepG2细胞中表达,为进一步研究GLIPR-2的生物学功能奠定了基础.     

IGFBP7基因慢病毒载体的构建及在K562细胞中的表达

本研究构建胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)基因的慢病毒载体,为研究该基因在白血病中的作用提供基础。采用限制性内切酶酶切获得目的基因,基因重组构建慢病毒载体质粒venus-IGFBP7,用293T细胞包装慢病毒颗粒,感染K562细胞,并采用多种方法鉴定。结果表明,所获IGFBP7基因经测序与GenBank比对序列一致,慢病毒载体质粒venus-IGFBP7经BamHⅠ酶切鉴定片段大小正确,荧光显微镜及流式细胞术检测到绿色荧光蛋白在293T及K562细胞中表达,RT-PCR和Western blot检测到IGFBP7 mRNA和蛋白在K562细胞表达。结论:成功构建带有IGFBP7基因的慢病毒载体,为研究IGFBP7基因在K562细胞中的作用奠定了基础。