TβR-Ⅱ-RANTES融合基因重组腺病毒的抗肿瘤作用

目的构建表达融合基因TGF-βⅡ型受体(TβR-Ⅱ)胞外区及活化T细胞表达和分泌的调节因子(RANTES)重组腺病毒载体,并观察其抗肿瘤作用。方法RT-PCR扩增小鼠TβR-Ⅱ胞外区和RANTES基因,重叠PCR扩增融合基因TβR-Ⅱ胞外区-RANTES。采用adMax adenovjrus vector creation试剂盒构建表达融合基因重组腺病毒。体外感染小鼠肺腺痛LA795细胞系,绘制细胞生长曲线。采用Western blot法检测感染后细胞融合基因的表达;酶联免疫吸附试验(FLISA)法检测其培养上清的蛋白含量;Annexin V-FITC法检测感染后细胞的凋亡;并观察感染后细胞培养上清对小鼠脾细胞的趋化作用。将感染后的细胞(1×105个)接种于T739小鼠,观察成瘤时间和生存时间;1×1010pfu的重组腺病毒局部注射荷瘤小鼠,观察肿瘤的大小变化,并统计肿瘤的重量和计算抑瘤率。结果经测序证实,RT-PCR正确扩增小鼠TβR-Ⅱ胞外区和RANTFS基因,重叠PCR正确扩增融合基因TβR-Ⅱ胞外区-RANTES。重组质粒pDC316-融合基因经酶切鉴定正确,与pJM17双质粒共转染获得表达融合基因重组腺病毒,病毒滴度为8×1010pfu/ml。Western blot结果表明,感染后的LA795细胞有融合蛋白的特异性条带出现;培养上清中,游离TGF-β1的水平显菩减低,而RANTES的水平显著升高。感染融合基因重组腺病毒的细胞生长速度明显减低,凋亡率为16.9%;培养上清可趋化小鼠脾细胞,与对照组之间差异均有统计学意义。感染融合基因重组腺病毒组与对照组相比,体内成瘤时间和生存时间明显延长;局部注射融合基因重组腺病毒可显著抑制肿瘤的生长,抑瘤率为37.6%。结论成功构建表达融合基因TβR-Ⅱ胞外区-RANTES重组腺病毒可有效结合TGF-β1,显著逆转TGF-β介导的免疫抑制状态,高水平表达RANTES强化肿瘤局部的免疫功能,具有显著的抗肿瘤作用。     

重组腺病毒载体CRT联合紫杉醇对乳腺癌细胞周期、增殖及凋亡的影响

目的:研究Ad-CRT联合紫杉醇对乳腺癌MDA-MB-231细胞周期、细胞增殖及凋亡的影响.方法:MTT法检测细胞增殖,相差显微镜观察细胞形态学变化;PI单染流式细胞术检测细胞周期和凋亡.结果:Ad-CRT联合紫杉醇对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的抑制率明显高于单纯Ad-CRT组和单纯紫杉醇组,且抑制作用呈时间依赖关系(P<0.05),且细胞形态发生明显的改变.Ad-CRT联合紫杉醇将乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞周期明显的阻滞在G2/M期,并且促进细胞的凋亡.结论:Ad-CRT联合紫杉醇能增强乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖抑制、阻滞细胞周期并且诱导细胞凋亡.     

重组腺病毒载体CRT联合紫杉醇对乳腺癌细胞周期、增殖及凋亡的影响

目的：研究Ad-CRT联合紫杉醇对乳腺癌MDA-MB-231细胞周期、细胞增殖及凋亡的影响。方法：MTT法检测细胞增殖,相差显微镜观察细胞形态学变化;PI单染流式细胞术检测细胞周期和凋亡。结果：Ad-CRT联合紫杉醇对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的抑制率明显高于单纯Ad-CRT组和单纯紫杉醇组,且抑制作用呈时间依赖关系（P〈0.05）,且细胞形态发生明显的改变。Ad-CRT联合紫杉醇将乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞周期明显的阻滞在G2/M期,并且促进细胞的凋亡。结论：Ad-CRT联合紫杉醇能增强乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖抑制、阻滞细胞周期并且诱导细胞凋亡。     

蜂毒素基因重组腺病毒对肝癌细胞的杀伤作用

目的：构建携蜂毒素基因及甲胎蛋白（AFP）启动子（rAFP)的重组腺病毒载体，探讨rAFP驱动的蜂毒素基因在体外对肝癌细胞的特异性杀伤作用。方法：人工合成蜂毒素基因，置于rAFP之后，用细菌内高效同源重组法将目的基因重组入腺病毒质粒中，转染人胚肾293细胞进行腺病毒包装；采用MTT法测定蜂毒素基因转染对AFP阳性，阴性肝癌细胞及正常肝细胞增殖的影响。结果：携蜂毒素基因重组腺病毒载体构建成功，MTT实验证明携蜂毒素基因重组腺病毒转染后，AFP阳性肝癌细胞的增殖受到明显抑制，而对AFP阴性肝癌细胞及正常肝细胞无明显影响；无蜂毒素基因的重组腺病毒转染，则对各种细胞增殖均无抑制作用。结论：表达rAFP驱动的蜂毒素基因的重组腺病毒在体外可特异性地杀伤AFP阳性肝癌细胞。     

腺病毒介导的shRNA沉默hTERT基因表达对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨靶向人端粒酶反转录酶（hTERT)的短发夹RNA（shRNA)对人鼻咽癌细胞株CNE-2 hTERT表达的影响,及其对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的效应。方法构建表达绿色荧光蛋白(EGFP)基因和靶向hTERT基因短发夹RNA的重组腺病毒质粒,观察其对鼻咽癌细胞株(CNE-2)的转染效果,RT-PCR检测hTERT mRNA表达水平,Western blot检测hTERT蛋白表达水平,CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡状况。结果Adv-EGFP-shTERT重组腺病毒质粒转染率可达90%以上,成功转染CNE-2细胞24 h后,hTERT mRNA的表达水平显著下降,转染48 h后,hTERT蛋白表达明显下调,细胞增殖活性受到显著抑制,细胞凋亡率可达23.0%。结论腺病毒载体介导靶向hTERT基因的RNA干扰,能显著抑制端粒酶反转录酶表达,进而抑制端粒酶活性,抑制CNE-2细胞增殖并诱导其凋亡,为鼻咽癌的基因治疗研究提供了理论基础。     

KDR 启动子介导CD/TK双自杀基因重组体腺病毒的高效构建

 新近以肿瘤血管为靶点的基因治疗逐渐成为肿瘤治疗的热点,其缘由为破坏供养肿瘤的毛细血管可导致其灌注区大量肿瘤细胞缺血坏死.研究表明：血管内皮细胞生长因子受体（KDR）高表达于肿瘤血管内皮细胞,而在正常组织内不表达,故KDR可作为肿瘤治疗的理想靶点.本研究从肿瘤的血管治疗出发,探讨KDR启动子驱动的双自杀基因腺病毒载体的高效构建方法,为肿瘤基因治疗的进一步深入研究奠定基础.     

重组腺病毒Ad-CRT/MAGE-A3联合表柔比星抑制乳腺癌细胞增殖及侵袭

目的:构建携带钙网蛋白(calreticulin,CRT)基因和黑素瘤抗原基因-A3(melanoma antigen gene-A3,MAGE-A3)的重组腺病毒载体Ad-CRT/MAGE-A3,观察其联合表柔比星对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖及侵袭的抑制作用.方法:构建Ad-CRT/MAGE-A3载体,感染MDA-MB-231细胞后,荧光显微镜观察其最适感染复数(multiplicity of infection,MOI).分表柔比星、Ad-GFP、Ad-CRT/MAGE-A3、表柔比星+Ad-GFP、表柔比星+Ad-CRT/MAGE-A3共5组,MTT法检测各组MDA-MB-231细胞的增殖,Transwell实验检测各组MDA-MB-231细胞的侵袭力.结果:成功构建重组腺病毒载体Ad-CRT/MAGE-A3,其感染MDA-MB-231细胞的最适MOI为100.与其他各组相比,应用Ad-CRT/MAGE-A3联合表柔比星能明显抑制MDA-MB-231细胞的增殖[(83.27 ±1.04)％ vs(57.42±1.27)％,(43.26 ±0.95)％,(61.23 ±1.47)％,(55.38±1.62)％;P＜0.05]和侵袭[(8.41 ±4.20)vs (14.62 ±5.33),(107.66±3.35),(100.60±4.42),(104.20±2.60);P ＜0.05].结论:腺病毒载体Ad-CRT/MAGE-A3能增强表柔比星抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖及侵袭的能力.     

细菌内同源重组法高效制备含CD、TK融合自杀基因重组体腺病毒

目的：采用细菌内同源重组法高效制备含ＣＤ、ＴＫ融合自然基因重组体腺病毒。方法：ＣＤ、ＴＫ融合基因ＣＤｇｌｙＴＫ自载体ｐＷＺＬｎｅｏＣＤｇｌｙＴＫ中切出,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成转移质粒ｐＡｄｔｒａｃｋＣＭＶ－ＣＤｇｌｙＴＫ,将之Ｐｍｅｌ酶切线性化后与腺病毒基因组质粒ｐＡｄｅａｓｙ０１共转化ＢＪ５１８３菌,抽提重组体腺病毒基因组质粒ＤＮＡ,Ｐａｃｌ酶切后转染２９３细胞包装成腺病毒颗粒,采用ＰＣ     

miR-21沉默下调β-catenin表达对食管癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨miR-21沉默对食管癌细胞增殖和凋亡的影响及其与β-catenin表达的关系。方法:通过脂质体转染法沉默食管癌Eca9706细胞株中的miR-21,采用荧光定量（RT-PCR）检测miR-21、β-catenin mRNA的相对表达水平;蛋白质印迹法（Western blot）检测β-catenin蛋白的相对表达水平。MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。结果:转染48 h后,与对照组和NC组相比,miR-21组Eca9706细胞中miR-21、β-catenin mRNA和β-catenin蛋白的相对表达水平均明显降低。MTT检测miR-21组细胞的光密度值（OD值）较对照组和NC组明显下降。与NC组和对照组相比,流式细胞仪检测miR-21组中细胞的凋亡率明显上升,G0/G1期细胞所占比例明显升高,S期细胞所占比例明显下降。结论:沉默miR-21能够通过下调β-catenin的表达来抑制食管癌Eca9706细胞增殖及诱导其凋亡。     

腺病毒载体介导的内皮抑素基因的体外生物活性及其对小鼠黑色素瘤形成的影响

新生血管形成对肿瘤的生长具有重要意义.因此抑制血管生成成为肿瘤治疗研究的热点之一.     

Vasohibin-1重组腺病毒对人卵巢癌SKOV-3细胞增殖的影响

[目的]研究内源性血管生成抑制因子vasobihin．1对人卵巢癌SKO~．3细胞体外增殖能力的影响。[方法]体外培养SKOV-3细胞,用vasohibin-1重组腺病毒感染SKOV．3细胞,采用蛋白质印迹法检测SKOV．3细胞中vasohibin．1蛋白的表达水平,应用CCK-8法检测不同时间点vasohibin-1重组腺病毒对SKOV．3细胞增殖的抑制能力。[结果]感染48h后,在SKOV-3细胞中vasohibin．1蛋白表达量与对照组相比显著性增加（P〈0．05）：25MOIvasohibin-1重组腺病毒感染SKOV．3细胞24h时．过表达组与阴性对照相比,两者之间没有统计学差异（P10．065）;余各组间相比差异均具有统计学意义（P〈0．05）,且抑制能力随MOI增大而增加（P〈0．05）,随时间的延长而增加（P〈0．05）。[结论]Vasohibin．1过表达能够抑制SKOV-3细胞的增殖能力。并具有浓度和时间依赖性,可为卵巢癌的治疗提供新思路。     

重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-hIL-2的构建及病毒滴度测定

目的:构建重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-hIL-2,并测定病毒滴度.方法:从Jurkat细胞中提取mRNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增hIL-2基因全编码区序列.将测序正确的片段用Bgl II和Pme I双酶切定向插入到pAdBM5-GFP腺病毒载体中.通过磷酸钙共沉淀法将线性化重组质粒和腺病毒骨架共转染HEK293A细胞,扩增纯化重组腺病毒,TCID50法测定重组腺病毒滴度.结果:成功构建出表达hIL-2基因的重组腺病毒载体(pAdBM5-GFP-hIL-2),获得了高滴度表达hIL-2基因的重组腺病毒.结论:重组腺病毒表达载体(pAdBM5-GFP-hIL-2)的成功构建及重组腺病毒的获得有利于进一步开展肝癌的转基因治疗研究.     

腺病毒介导的p27kip1cDNA对胃癌细胞增殖的影响

 目的　研究 p2 7基因对人胃癌细胞SGC 790 1的抗增殖作用。方法　构建重组体腺病毒Ad p2 7kip1并转染SGC 790 1细胞 ,绘制细胞生长曲线 ,克隆形成实验 ,免疫组化检测PCNA的表达情况。 结果　成功构建Ad p2 7kip1 ,病毒滴度为 1 .2 4× 1 0 12 pfu/ml,在MOI≥ 5 0时 ,即可达到 1 0 0 %的转导效率。在SGC 790 1细胞中表达 ,能抑制其生长和集落形成 ,Ad p2 7kip1和对照组PCNA标记指数分别为 3 5 .2 %及78.6% (P <0 .0 1 )。结论　p2 7可有效抑制胃癌细胞的增殖活性 ,这为采用 p2 7kip1cDNA基因治疗胃癌奠定了基础。     

腺病毒介导的p27kip1cDNA对胃癌细胞增殖的影响

目的　研究 p2 7基因对人胃癌细胞SGC 790 1的抗增殖作用。方法　构建重组体腺病毒Ad p2 7kip1并转染SGC 790 1细胞 ,绘制细胞生长曲线 ,克隆形成实验 ,免疫组化检测PCNA的表达情况。 结果　成功构建Ad p2 7kip1 ,病毒滴度为 1 .2 4× 1 0 12 pfu/ml,在MOI≥ 5 0时 ,即可达到 1 0 0 %的转导效率。在SGC 790 1细胞中表达 ,能抑制其生长和集落形成 ,Ad p2 7kip1和对照组PCNA标记指数分别为 3 5 .2 %及78.6% (P <0 .0 1 )。结论　p2 7可有效抑制胃癌细胞的增殖活性 ,这为采用 p2 7kip1cDNA基因治疗胃癌奠定了基础。     

复制缺陷型重组腺病毒介导mIFN-β基因治疗小鼠黑色素瘤的研究

目的:探讨人类复制缺陷型重组腺病毒载体介导mIFN-β基因治疗小鼠黑色素瘤的可行性和效果。方法:利用人类复制缺陷型重组腺病毒将目的基因mIFN-β经体外、体内两种途径导入小鼠黑色素瘤细胞(B16细胞)中,观察体外转mIFN-β基因的B16细胞的体内致瘤性和瘤苗作用,及通过腺病毒载体介导的mIFN-β对体内局部肿瘤治疗和抗肿瘤转移的作用。结果:1)携带目的基因的重组腺病毒感染B16细胞能获得较高的转移效率和目的基因的有效表达;2)将mIFN-β基因导入B16细胞对B16细胞的体外增殖能力无明显影响,但能显著提高细胞表面MHC-I类抗原的表达;3)将转mIFN-β基因的B16细胞接种小鼠,其体内致瘤性明显降低,且对对侧野生型B16细胞的致瘤性有抑制作用;4)瘤体内注射和经尾静脉注射途径给予AdCMVmIFN-β,对局部肿瘤和转移瘤有治疗作用。结论:利用人类复制缺陷型腺病毒载体介导mIFN-β基因治疗小鼠黑色素瘤是可行的,并具有较好疗效,提示用腺病毒载体携带有效的目的基因来开发瘤苗和治疗肿瘤具有良好的临床应用前景。     

双表达人Arid5a及报告基因eGFP的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建双表达人Arid5a(hArid5a)及报告基因eGFP的重组腺病毒载体,为研究Arid5a的生物功能打基础。方法:通过常规分子克隆方法及基因重组技术获得双表达hArid5a及eGFP的腺病毒载体。通过荧光显微镜观察eGFP的表达来确定病毒包装情况,Western blot检测Arid5a蛋白表达。结果:将hArid5a克隆到腺病毒穿梭载体中,获得pAd5-CMV-hArid5a载体,然后将Pac I线性化的pAd5-CMV-hArid5a与Pac I线性化的携带报告基因eGFP的病毒骨架通过基因重组,最终获得携带有报告基因eGFP及人Arid5a的腺病毒载体Ad5 CMV-hArid5a/eGFP。将纯化获得的腺病毒载体Ad5 CMV-hArid5a/eGFP感染U87细胞后,通过荧光显微镜观察eGFP的表达;通过Western blot检测到感染细胞中hArid5a表达。结论:成功构建了携带报告基因eGFP的hArid5a的腺病毒表达载体,为进一步研究hArid5a的生物功能奠定了基础。     

HBx基因重组腺病毒载体构建及其在SMMC-7721细胞中的表达

目的:利用pAdEasy1腺病毒载体系统构建人HBx基因重组腺病毒,感染肝癌细胞株SMMC7721使HBx基因有效表达。方法:自真核表达载体pcDNA3.1(-)HBx中获得HBx基因,插入腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV中构建pAdTrackCMVHBx,然后经PmeⅠ酶切线性化,电转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy1的BJ5183感受态细菌中。挑选和鉴定正确的同源重组质粒,然后将线性化的重组质粒转染293N细胞,产生重组病毒颗粒,并进一步感染SMMC7721细胞株。结果:经限制性内切酶酶切和基因测序鉴定,证实pAdTrackCMVpAdEasy1HBx重组成功,借助荧光显微镜可以观察到绿色荧光蛋白GFP在293N和SMMC7721细胞株中表达。结论:成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒载体,并在SMMC7721细胞中使HBx基因有效表达,为后续研究奠定了基础。     

含胞嘧啶脱氨酶基因的靶向腺病毒载体的构建及应用

目的　建立癌胚抗原 (CEA )启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶基因 (CD )自杀基因的腺病毒载体AdCEACD ,使CD基因只能在CEA阳性的细胞中表达。方法　采用同源重组法在人胚肾细胞株 2 93细胞中重组腺病毒 ,用点杂交、PCR法进行鉴定 ,并进行纯化和滴度测定 ,分别感染CEA阳性和CEA阴性的细胞 ,采用MTT法检测感染细胞对 5 Fc的敏感性。结果　重组腺病毒中含有CEA基因及CD基因 ,纯化后滴度可以达到 5 .0× 10 11pfu/ml ,CEA阴性的Hela细胞感染AdCMVCD后对 5 Fc很敏感 ,而感染AdCEACD后不能被 5 Fc杀伤 ,与之相反 ,CEA阳性的Lovo细胞感染AdCMVCD和AdCEACD后有相似的表达活性 ,均对5 Fc敏感。AdCEACD/ 5 Fc系统有明显的“旁观者”效应。结论　本实验建立的CEA启动子驱动的含CD自杀基因的腺病毒载体AdCEACD ,能使CD基因专一性地在CEA阳性细胞中表达 ,有助于对CEA阳性的肿瘤细胞靶向性自杀基因治疗。     

腺病毒介导的RA538基因转移及其对人结肠癌细胞

目的 进上步研究ＲＡ５３８对人结肠癌细胞生物学效应，选用介导ＲＡ５３８重组体腺病毒，观察其对人结肠癌细胞系ＨＣＴ的作用。方法 通过重组体腺病毒将ＰＡ５３８基因转导到人结肠癌细胞系ＨＣＴ中，观察转染ＲＡ５３８基因后的肿瘤细胞生长情况。经流式细胞仪、ＤＮＡ片段化分析及ＴＵＮＥＬ检测分析抑瘤机制。结果 由重组体腺病毒Ａｄ－ＲＡ５３８介导基因ＲＡ５３８转导在ＨＣＴ获得较主的转导效率，ＭＯＩ为１００时使８０     

重组survivin腺病毒的构建与鉴定

目的 构建人基因的重组survivin腺病毒载体,为喉癌的基因治疗研究提供实验基础.方法 聚合酶链反应(PCR)克隆survivin基因,PCR产物与克隆载体连接、转化,鉴定阳性克隆测序后再与腺病毒骨架质粒同源重组,对重组克隆行PCR鉴定和Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切鉴定,并包装、纯化.结果 核酸序列分析证明,所克隆的survivin基因与文献报道一致,克隆成功,而且外源survivin基因正确地插入到腺病毒载体中,表明已成功构建腺病毒载体pLP-Ad-SUR.结论 重组survivin腺病毒载体构建成功.

Abstract：

Objective To construct a recombinant adenovirus of survivin vector and provid valuable reference for gene therapy of laryngeal cancer.Methods The survivin gene was cloned by PCR.After confirmation by enzyme restriction analysis and sequencing, the gene and the adenovirus vector were recombined together to construct the recombinant adenovirus vector.The recombinant adenovirus vector was confirmed via both sequencing and digestion restriction analysis, and then linearized and transfected into the HEK 293 cell line to generate recombinant adenovirus.Results The Sequence analysis demonstrated that the survivin gene sequence was the same as published in the literature, suggesting that a recombinant adenovirus vector has been successfully constructed.Conclusions A survivin recombinant adenovirus has been successfully constructed.