两种不同方法分离、培养大鼠骨髓基质干细胞的比较研究

目的 对分别采用密度梯度离心法和贴壁筛选法分离、培养的大鼠骨髓基质干细胞（MSCs）的形态学和增殖动力学进行初步研究,以逐步完善MSCs体外培养体系.方法 取1月龄SD大白鼠胫骨和股骨骨髓,分别采用密度梯度离心法和贴壁筛选法进行体外分离、培养.倒置显微镜下进行MSCs的形态学观察和记录,MTT法测定细胞增殖度,绘制各自培养体系的传一代细胞生长曲线并比较.结果 培养获得的MSCs呈梭形或多角形,表面有不规则突起.采用密度梯度离心法培养获得的细胞纯度高,生长速率较贴壁筛选法获得的细胞快,增殖显著.另外,用小牛血清培养的MSCs生长曲线与文献报道的用胎牛血清培养的MSCs生长曲线一致。结论 密度梯度离心法可认为是目前体外培养MSCs的理想方法.用于体外培养MSCs的血清可能有更多选择。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及DiI荧光标记

目的:探讨兔骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离培养、表型鉴定和标记的方法.方法:采用密度梯度离心法及贴壁分离筛选法分离培养MSCs;采用免疫细胞化学方法检测细胞表面标志抗原CD29和CD106的表达,进行表型鉴定;DiI标记第3代MSCs,观察标记效率.结果:体外培养的原代MSCs 48 h内可见少量贴壁细胞,7～8 d达到90%汇合;免疫细胞化学方法检测细胞表面标志抗原CD29,CD106为阳性;DiI进行细胞标记后,荧光显微镜下见所有MSCs均被标记为红色荧光,敏感性好,标记效率高.结论:此培养方法可以作为培养兔MSCs的常规方法,为构建组织工程尿道提供充足的种子细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的研究

目的研究体外大鼠骨髓间充质干细胞的生长特性。方法在无菌条件下,取大鼠骨髓,采用密度离心法和全骨髓贴壁法联合培养并结合传代获取、纯化细胞,倒置显微镜观察其形态,流式细胞术检测其表面抗原CD29、CD90及CD34的表达。CCK-8法测定第1、3代细胞的增殖情况,并绘制其生长曲线。结果经全骨髓贴壁法和密度梯度离心联合培养,所得到的原代细胞形态呈椭圆形、圆形、三角形,接近融合状态时可呈现均一的长梭形,排列规则。传至第8代时,细胞的增殖能力减弱,其形态宽大畸形,呈树枝状。经流式细胞仪检测,所分离的细胞CD29的表达率为94.97%,CD90的表达率为88.50%,CD34的表达率为2.23%。CCK-8法显示第3代细胞有较强的增殖能力。结论体外培养的大鼠BMSCs是骨组织工程的优良种子细胞。     

成体大鼠骨髓间充质干细胞的表型研究

目的文献报道大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）不表达CD45,而本实验中却发发现CD45高度表达,针对这一现象做初步分析：方法成体大鼠骨髓MSCs的分离培养,对原代、第3代和第6代细胞做流式细胞仪检测MSCs的表面标记物以及染色体分析。结果体外培养的大鼠骨髓MSCs呈长梭型、有突起,排列成旋涡状。流式细胞仪检测示原代细胞：CD29（99．9％）,CD90（48．5％）,CD45（996％）,CD34（202％）;第3代细胞：CD29（100％）,CD90（97．1％）,CD45（100％）,CD34（089％）;第6代细胞：CD29（99．7％）,CD90（99．6％）,CD45（99．7％）,CD34（0．49％）。上述3代细胞的染色体分析床细胞核型为二倍体。结论体外培养的成体大鼠骨髓MSCs同时表达CD29,CD90和CD45,不表达CD34。     

C57/BL6小鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法的改良和鉴定

目的 建立一种体外纯化及培养扩增C57/BL6小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的简单有效方法.方法 利用骨髓MSCs在体外培养皿中培养时具有贴壁生长的特性,采用全骨髓法分离培养C57/BL6小鼠MSCs,通过体外培养和连续传代达到纯化和扩增MSCs目的,并与以优化.倒置显微镜下观察细胞形态变化情况;利用四唑盐比色(MTT)法测定MSCs的生长曲线;流式细胞仪(FCM)鉴定MSCs膜抗原.结果 C57/BL6小鼠胫骨全骨髓细胞在分离后与含15％优质胎牛血清DMEM/F12培养基混合,约5～10 min后即可见大量有核细胞贴壁,细胞形态为圆形,24～48 h后可见贴壁细胞转变为椭圆形、多角形及短梭形,7～12 d时细胞呈长梭形并达到90％单层融合.通过传代细胞进一步纯化及扩增.细胞传代后2d内处于潜伏期,3d后进入生长期,5d后进入平台期.第4代MSCs进行FCM检测CD45、CD44、CD29和CD54阳性率分别为2.4％、83.2％、95.1％和94.1％.激光免疫共聚焦结果显示造血细胞表面标物CD34和CD45阴性,而CD44和CD105阳性.结论 C57/BL6小鼠全骨髓贴壁法能有效得到分离纯化的MSCs,用此方法培养的C57/BL6小鼠MSCs生长稳定,增殖能力活跃,具有MSCs的一般生物学特性,可以为组织工程提供理想的种子细胞.     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及Dil荧光标记

摘要 目的　探讨兔骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离培养、表型鉴定和标记的方法。方法　采用密度梯度离心法及贴壁分离筛选法分离培养MSCs;采用免疫细胞化学方法检测细胞表面标志抗原CD29,CD106的表达,进行表型鉴定;DiI标记第3代MSCs,观察标记效率。结果　体外培养的原代MSCs48h内可见少量贴壁细胞,7-8d达到90%汇合;免疫细胞化学方法检测细胞表面标志抗原CD29,CD106为阳性;DiI进行细胞标记后,荧光显微镜下见所有MSCs均被标记为红色荧光,提示DiI标记法敏感性好,标记效率高。结论　此培养方法能在短时间内获得大量MSCs,操作简单,成功率高,可以作为培养兔MSCs的常规方法,为构建组织工程尿道提供充足的种子细胞,并进一步用于治疗重度尿道下裂、尿道下裂残废和较长的后尿道狭窄等顽症。     

B7-1与GM-CSF双顺反子慢病毒转染骨髓基质细胞的研究

目的 研究B7-1和粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)双基因共表达慢病毒载体是否可介导目的 基因在人骨髓基质细胞(MSCs)有效表达.方法 采用改良的磷酸钙沉淀法将包装质粒、包膜蛋白质粒和含目的 基因的转移质粒共转染293T包装细胞,收集的病毒上清感染密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离培养的MSCs,用荧光显微镜和流式细胞术(FCM)分析转导细胞绿色荧光蛋白(GFP)表达,PT-PCR分析目的 基因在转导细胞的表达.结果 密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离培养第三代的MSCs, CD90表达阳性率达到93.62%,包装好的慢病毒颗粒可成功感染293T包装细胞和MSCs,用荧光显微镜和FCM均可检测到转染细胞中GFP表达,阳性率分别为77.66%和43.97%,RT-PCR方法可扩增出转染细胞表达B7-1和GM-CSF基因片段.结论 B7-1和GM-CSF双基因共表达慢病毒载体可高效转移目的 基因至骨髓基质细胞并获得有效表达.     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离与培养

目的 建立体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞的方法.方法 应用全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行细胞传代培养.倒置显微镜下观察细胞形态及生长特征,测定细胞生长曲线,通过流式细胞仪检测细胞表面标志物,取第3代细胞分别加入成骨、成脂诱导剂并采用碱性磷酸酶染色及Von Kossa染色鉴定成骨能力,以油红O染色鉴定成脂能力.结果 获取的大鼠骨髓间充质干细胞形态呈均一成纤维细胞样,并呈集落样生长.传至第3代细胞纯度可达97%以上,其细胞表型CD29、CD44、CD105、CD166呈阳性表达,CD34、CD80、CD86呈阴性表达.经成骨诱导后细胞碱性磷酸酶染色及Von Kossa染色呈阳性,成脂诱导后细胞油红O染色呈现阳性.结论 应用全骨髓贴壁法可以分离培养出高纯度的大鼠bMSCs,培养的细胞扩增迅速、生物学特性稳定,是一种较为理想的体外分离扩增bMSCs的培养体系.     

人骨髓间充质干细胞体外分离培养方法的比较研究

目的 比较Ficoll密度梯度离心法分离人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)与全骨髓培养法之间的差异,以期建立一种简便、实用的基于临床移植需要的MSCs分离方法.方法 分别应用上述两种方法分离MSCs,比较用两种方法的细胞形态、MSCs细胞得率及以及细胞表面标志的差异.结果 两种方法均能有效培养出骨髓MSCs,且获得的第二代MSCs细胞形态无明显差异,细胞形态均一,为长梭形或三角形.5 ml骨髓细胞分离培养后,Ficoll密度梯度离心法获得的MSCs细胞总数显著小于全骨髓培养法(t=.639,P＜0.01).Ficoll密度梯度离心法与全骨髓培养法获得的第二代MSC8 CD29、CD105、CD105、CD34阳性表达率的差异无统计学意义(t分别为0.809、0.659、0.277、0.191,P均＞0.05),但前者的HLA-DR阳性表达率明显低于后者,差异具有统计学意义(t=2.347,P＜0.05).结论 与Ficoll密度梯度离心法相比较,全骨髓培养法分离MSCs具有培养时间较短,细胞得率较多的优点,虽纯度相对较低,但仍是一种较好的MSCs分离方法.     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(bMSCs)体外分离培养方法及其生物学特性。方法在无菌条件下取SD大鼠股骨、胫骨,采用差速贴壁法分离培养bMSCs,通过传代培养进一步纯化扩增。倒置显微镜下观察细胞形态及生长特征,绘制细胞生长曲线。流式细胞仪测定bMSCs表面标志。结果镜下bMSCs大小均一,呈梭形、多角形成纤维细胞形态,呈旋涡状生长。第3代bMSCs纯度可达97%以上,其细胞表型CD29,CD44,CD105和CD166呈阳性表达,CD34,CD80和CD86呈阴性表达。结论采用差速贴壁法分离培养的大鼠bMSCs纯度高、扩增迅速、生物学特性稳定,是一种较为理想的体外分离扩增bMSCs的培养体系。