KAI1基因抑制胰腺癌细胞转移机制的探讨

目的　将pCMV KAI1重组质粒转染人高转移胰腺癌细胞株MiaPaCaⅡ中 ,观察转染前后KAI1基因对胰腺癌细胞侵袭转移能力和运动能力的影响 ,从基因水平探讨KAI1基因抗胰腺癌转移机制。方法　通过脂质体转染法成功将重组质粒转染到MiaPaCaⅡ中 ,利用Transwell小室测定细胞穿膜侵袭运动能力 ,采用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测明胶酶活性。结果　pCMV KAI1重组质粒转染后 ,显微镜下细胞计数示转染后胰腺癌细胞穿透基底膜的数量较转染前明显减少 (P <0 0 5 ) ,细胞运动能力明显减弱。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示负染带宽度比转染前变窄 ,亮度减弱 ,降解基质膜和细胞外基质的能力和侵袭转移能力下降。结论　KAI1基因控制胰腺癌细胞转移可能是通过抑制癌细胞侵袭及运动功能来实现的。     

KAI1基因抗胰腺癌细胞转移的研究

目的　将pCMV KAI1重组质粒转染入人高转移胰腺癌细胞株PANCⅠ和MiaPaCaⅡ中 ,观察转染前后KAI1基因对胰腺癌细胞增殖能力的影响 ,探讨KAI1基因抗胰腺癌转移的调控作用。方法　通过脂质体转染法将 pCMV KAI1重组质粒成功转染到人胰腺癌细胞株PANCⅠ和MiaPaCaⅡ中 ,采用MTT比色法、细胞集落形成和流式细胞术 (FCM )测定细胞增殖活力和生长周期的变化。结果　pCMV KAI1重组质粒转染PANCⅠ和MiaPaCaⅡ人胰腺癌细胞株后 ,细胞增殖能力较转染前分别降低 4 0 .5 9%和 6 5 .84 % (P <0 .0 5 )。转染KAI1基因的细胞集落形成率 (14 .0 0 % )较转染前 (4 9.5 6 % )明显减少 (P <0 .0 1)。转染后比转染前胰腺癌细胞数量在G0 /G1期明显增加 (PANCⅠ细胞由 4 0 .97%± 1.34%增加到 6 5 .36 %± 1.2 3% ,MiaPaCaⅡ细胞由 2 4 .10 %± 1.0 0 %增加到 4 3.18%± 1.0 6 % ) ,M/G2 期数量降低 (PANCⅠ从 2 1.4 6 %± 0 .96 %降至 13.35 %± 0 .2 2 % ,MiaPaCaⅡ由 2 4 .89%± 1.14 %降至 19.0 6 %± 0 .5 7% ) ,差异有显著性 (P <0 .0 5 )。结论　KAI1基因控制胰腺癌细胞转移可能是通过改变胰腺癌细胞的生长周期 ,抑制癌细胞的增殖及分裂功能来实现的。     

KAI1基因转染的胰腺癌细胞系的建立

目的转染pCMV-KAI1重组质粒入人胰腺癌细胞株MiaPacaⅡ和Panc 1,观察KAI1基因的表达,为进行KAI1基因在胰腺癌中抗转移作用的有关研究提供实验用靶细胞,并为今后利用KAI1基因治疗胰腺癌提供实验和理论依据.方法采用Western blot方法从7种胰腺癌细胞中筛选出无KAI1表达的MiaPacaⅡ和Panc 1细胞株,通过脂质体转染法将pCMV-KAI1重组质粒转染到MiaPacaⅡ和Panc 1中,经G418筛选4周,获得单克隆细胞系,应用Western blot、免疫荧光及免疫细胞化学方法检测转染细胞系KAI1蛋白的表达.结果获得了稳定表达KAI1基因的MiaPacaⅡ和Panc 1胰腺癌细胞克隆;经Western blot分析显示转染后的胰腺癌细胞株MiaPacaⅡ与Panc 1有明确的分子质量为29100 KAI1蛋白表达,而未转染细胞无KAI1蛋白表达;免疫荧光显示,转染的胰腺癌细胞质中可见明显的荧光,而无转染的母细胞无荧光;免疫细胞化学检测显示,无转染的细胞呈阴性反应,转染的细胞呈中到强度的阳性反应.结论 pCMV-KAI1重组质粒经转染入人胰腺癌细胞株MiaPacaⅡ和Panc 1后可表达KAI1蛋白,从而建立了KAI1蛋白表达的MiaPacaⅡ和Panc 1细胞系.     

KAI1基因转染的胰腺癌细胞系的建立

目的转染pCMV—KAI1重组质粒入人胰腺癌细胞株MiaPacaⅡ和Panc1，观察KAⅡ基因的表达，为进行KAI1基因在胰腺癌中抗转移作用的有关研究提供实验用靶细胞，并为今后利用KAI1基因治疗胰腺癌提供实验和理论依据。方法采用Western blot方法从7种胰腺癌细胞中筛选出无KAI1表达的MiaPacaⅡ和Panc1细胞株，通过脂质体转染法将pCMV—KAI1重组质粒转染到MiaPacaⅡ和Panc1中，经G418筛选4周，获得单克隆细胞系，应用Western blot、免疫荧光及免疫细胞化学方法检测转染细胞系KAI1蛋白的表达。结果获得了稳定表达KAI1基因的MiaPacaⅡ和Panc1胰腺癌细胞克隆；经Western blot分析显示转染后的胰腺癌细胞株MiaPacaⅡ与Panc1有明确的分子质量为29100KAI1蛋白表达，而未转染细胞无KAI1蛋白表达；免疫荧光显示，转染的胰腺癌细胞质中可见明显的荧光，而无转染的母细胞无荧光；免疫细胞化学检测显示，无转染的细胞呈阴性反应，转染的细胞呈中到强度的阳性反应。结论pCMV—KAI1重组质粒经转染人人胰腺癌细胞株MiaPacaⅡ和Panc1后可表达KAI1蛋白，从而建立了KAIl蛋白表达的MiaPacaⅡ和Panc1细胞系。     

胰腺癌细胞中KAI1蛋白的表达分析

目的研究KAI1基因在人高转移胰腺癌细胞株PANC Ⅰ和MiaPacaⅡ中的表达,并进行KAI1基因在胰腺癌中抗转移作用的有关研究,为今后利用KAI1基因治疗胰腺癌提供实验和理论依据.     

ME491和KAI1基因抗胰腺癌转移作用的评价

目的探讨不同转移抑制基因ME491和KAI1对胰腺癌抗转移作用的影响。方法2003-11～2004-02在沈阳军区总医院消化内科实验室采用原位杂交法和免疫组织化学技术分别对正常胰腺组织(17例)及胰腺癌组织(50例)中的ME491和KAI1基因及其蛋白表达进行检测。结果ME491和KAI1在胰腺癌组织中的表达高于正常组织,ME491在有转移和没有转移组织中的表达差异无显著性,但KAI1在无转移的组织中的表达高于有转移的组织。结论ME491可能与胰腺癌转移无明显相关,KAI1基因具有明显抗胰腺癌转移作用。     

KAI1 RNA探针的制备及其在胰腺癌中的应用

目的制备DIG标记KAI1 RNA探针和分析KAI1基因在胰腺癌中的表达.方法以线性KAI1 基因DNA质粒为模板,采用体外转录法掺入DIG-11-UTP制备RNA探针,并通过化学发光法检测.应用该探针通过Northern blot对12例正常胰腺组织和30例原发性胰腺癌组织中的KAI1基因mRNA进行分析. 结果该方法标记的KAI1 RNA探针浓度为1 ng/μl时即可检测.Northern bolt分析发现25例无转移的胰腺癌中KAI1基因在2.4 kb处存在明显的杂交信号,5例发生转移的晚期胰腺癌杂交信号较弱,正常胰腺组织中该基因的表达水平呈阴性或弱阳性.结论本法标记的KAI1 RNA探针灵敏度高,KAI1基因低表达与胰腺癌的转移有关.     

乏氧条件下PTEN、KAI1基因双转染对胰腺癌AsPC1细胞增殖、转移的影响

目的 观察乏氧环境下PTEN和KAI1基因双转染人胰腺癌AsPC1细胞后对其增殖、迁移的影响.方法 应用我们前期构建的PTEN和KAI1基因过表达载体同时转染乏氧环境培养的人胰腺癌AsPC1细胞,采用蛋白质印迹法检测PTEN和KAI1蛋白的表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖,克隆形成实验观察肿瘤细胞形成集落能力,Transwell小室实验观察细胞的迁移能力.结果 双基因转染后,乏氧培养的AsPC1细胞的PTEN、KAI1蛋白表达量较空载体转染组细胞增加2.05倍及1.51倍;细胞增殖显著减缓(0.5比0.8,P=0.000);克隆形成数显著下降[(41.67±5.03)个比(86.00±7.81)个,P=0.017)];细胞迁移能力明显减弱(0.68±0.05比1.23±0.03,P=0.003).结论 乏氧条件下PTEN、KAI1基因双转染AsPC1细胞后能够抑制其增殖、迁移能力,基因联合治疗胰腺癌可能具有潜在的应用价值.     

KAI1 PNA探针的制备及其在胰腺癌中的应用

目的：制备DIG标记KAI1 RNA探针和分析KAI1基因在胰腺癌中的表达。方法：以线性KAI1基因DNA质粒为模板，采用体外转录法掺入DIG-11-UTP制备RNA探针，并通过化学发光法检测。应用该探针通过Northern blot对12例正常胰腺组织和30例原发性胰腺癌组织中的KAI1基因mRNA进行分析。结果：该方法标记的KAI1 RNA探针浓度?a1ng/цl时即可检测。Northern bolt分析发现25例无转移的胰腺癌中KAI1基因在2.4kb处存在明显的杂交信号，5例发生转移的晚期胰腺癌杂交信号较弱，正常胰腺组织中该基因的表达水平呈阴性或弱阳性。结论：本法标记的KAI1RNA探针灵敏度高，KAI1基因低表达与胰腺癌转移有关。     

KAI1基因对肝癌MHCC97-H细胞生长及侵袭能力的影响

KAI1基因是从前列腺癌中克隆的肿瘤转移抑制基因。用基因转染技术研究KAI1基因对肝癌细胞生长及侵袭能力的影响。     

KAI1复制缺陷型腺病毒载体抑制人胰腺癌细胞迁移实验研究

目的 构建携带人肿瘤转移抑制基因KAI1复制缺陷型腺病毒载体并初步研究其对体外肿瘤细胞迁移的影响。方法 用Ad—EasyTM系统大肠杆菌中同源重组的方法，构建Ad—KAI1腺病毒载体，并在293细胞中包装、扩增和纯化，用其感染人胰腺癌细胞并检测KAI1的表达。结果 构建的Ad—KAI1可以高效感染人胰腺癌细胞系PANCl，并检测到感染Ad-KAI1的PANCl细胞中KAI1的高表达；同时观察到Ad-KAI1可以抑制胰腺癌细胞系PANCl的迁移。结论 携带人肿瘤转移抑制基因KAI1复制缺陷型腺病毒载体可抑制人胰腺癌细胞转移，为KAI1抗胰腺癌转移基因治疗提供依据。     

KAI1基因转染对乏氧培养下胰腺癌MiaPaCa-2细胞增殖、迁移及VEGF表达的影响

目的 观察转染KAI1基因的人胰腺癌MiaPaCa-2细胞在乏氧条件下培养后细胞增殖、迁移、侵袭能力的变化,探讨其可能机制.方法 应用KAl1基因过表达质粒转染乏氧条件培养后的人胰腺癌MiaPaCa-2细胞,采用蛋白质印迹法检测转染细胞KAI1、VEGF-C、VEGF-A蛋白的表达,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测转染细胞的增殖,细胞划痕及Transwell小室实验观察转染细胞的迁移及侵袭能力,酶联免疫吸附测定法检测培养上清液中人VEGF-C、VEGF-A含量.结果 转染KAI1基因后的MiaPaCa-2-K细胞的KAI1蛋白表达量较未转染细胞显著增加[（0.549 ±0.021）比0].乏氧条件培养后转染细胞的增殖无明显变化,但它的迁移距离明显缩短,穿膜细胞数显著减少[（14.0±5.8）比（43.0±14.4）个,P＜0.05];细胞的VEGF-C表达显著降低[（0.218±0.043）比（0.745±0.069）.P＜0.05],但VEGF-A表达变化不显著;细胞培养上清液中VEGF-C含量显著减少[（1236±247）比（2045±221） pg/ml,P＜0.01].结论 转染KAl1基因的MiaPaCa-2细胞在乏氧条件下培养后的细胞迁移、侵袭能力减弱,其机制可能是通过下调VEGF-C的表达来抑制胰腺癌淋巴转移的.     

Kangai-1抑制胰腺癌细胞转移与细胞粘附分子-1和金属蛋白酶-9关系的研究

目的 研究肿瘤转移抑制基因Kangai-1(KAI1)对胰腺癌细胞增殖功能及转移潜能的影响.方法 建立经腺病毒(Ad)成功构建的重组载体(Ad-KAI1),并转染胰腺癌PANC Ⅰ细胞.用血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子(EGF)作为诱导剂,按照不同诱导时间点(3、5、7 h)将PANC Ⅰ细胞进行实验分组,比较感染前后细胞形态.采用Transwell方法 对PANC Ⅰ细胞转染Ad-KAI1前、后的迁移作用进行比较.采用免疫细胞化学法检测细胞粘附分子-1(ICAM-1)和金属蛋白酶-9(MMP-9)在PANC Ⅰ细胞转染Ad-KAI1前、后的表达水平.结果 在VEGF和EGF诱导下,转染Ad-KAI1后与转染前相比,PANC Ⅰ细胞的迁移能力明显下降(P＜0.05).免疫细胞化学研究提示,PANC Ⅰ细胞中ICAM-1、MMP-9均呈阳性表达,转染后均呈阴性表达.结论 KAI1基因抑制胰腺癌转移可能是通过抑制ICAM-1和MMP-9的表达.     

KAI1 复制缺陷型腺病毒载体抑制人胰腺癌细胞迁移实验研究

目的 构建携带人肿瘤转移抑制基因KAI1复制缺陷型腺病毒载体并初步研究其对体外肿瘤细胞迁移的影响.方法 用Ad-EasyTM系统大肠杆菌中同源重组的方法,构建Ad-KAI1腺病毒载体,并在293细胞中包装、扩增和纯化,用其感染人胰腺癌细胞并检测KAI1的表达.结果 构建的Ad-KAI1可以高效感染人胰腺癌细胞系PANC1,并检测到感染Ad-KAI1的PANC1细胞中KAI1的高表达;同时观察到Ad-KAI1可以抑制胰腺癌细胞系PANC1的迁移.结论 携带人肿瘤转移抑制基因KAI1复制缺陷型腺病毒载体可抑制人胰腺癌细胞转移,为KAI1抗胰腺癌转移基因治疗提供依据.     

KAI1基因在胰腺癌中的突变分析

目的探讨KAI1基因在胰腺癌中的突变情况.方法对17例伴有淋巴结转移的原发性胰腺癌(Ⅲ期),7例无淋巴结转移的原发性胰腺癌(2例Ⅰ期,5例Ⅱ期)和9例正常胰腺组织标本进行KAI1基因突变分析.结果24例胰腺癌标本中,7例证实有KAI1点突变.这种突变出现在886位核苷酸上,导致从A到G的转变,缬氨酸置换异亮氨酸,且有突变的癌标本均属于晚期有转移的胰腺癌(Ⅲ期).结论上述结果提示KAI1基因突变使KAI1 mRNA水平降低可能是胰腺癌转移的主要因素之一.     

KAI1基因在胰腺癌中的突变分析

目的：探讨KAI1基因在胰腺癌中的突变情况。方法：对17例伴有淋巴结转移的原发性胰腺癌（Ⅲ期），7例无淋巴结转移的原发性胰腺癌（2例I期，5例Ⅱ期）和9例正常胰腺组织标本进行KAI1基因突变分析。结果：24例胰腺癌标本中，7例证实有KAI1点突变。这种突变出现在886位核苷酸上，导致从A到G的转变，缬氨酸置换异亮氨酸，且有突变的癌标本均属于晚期有转移的胰腺癌（Ⅲ期）。结论：上述结果提示KAI1基因突变使KAI1 mRNA水平降低可能是胰腺癌转移的主要因素之一。     

KAI1基因对原发胰腺癌生长的调控作用

目的已知KAI1基因是一种肿瘤转移抑制基因,属第4家族跨膜成员,并对胰腺癌的转移有抑制作用,但其对原发胰腺癌的影响尚不清楚.     

KAI1基因对MHCC97-H肝癌细胞生物力学的影响

目的 探讨KAI1基因对MHCC97-H肝癌细胞生物力学的影响.方法 采用微管吸吮技术研究我们前已转染人类KAI1全长正、反义结构基因的人肝癌MHCC97-H细胞粘弹性以及对FN的粘附力等生物力学参数.结果 MHCC97-H肝癌细胞的粘弹性系数K1、K2、μ在转染KAI1正义基因后明显增加(P<0.05),在转染KAI1反义基因后明显降低(P<0.01),而转染空载体后则无明显变化(P>0.1).在FN裱衬表面,各组肝癌细胞的粘附力分别为MHCC97-H-S组685.4±113.6,MHCC97-H-AS组1 124.6±123.5,MHCC97-H-pCI组849.0±126.3及MHCC97-H亲本细胞组824.7±134.1(单位为10-10 N,细胞数为25).与亲本细胞组比较,MHCC97-H细胞对FN的粘附力在转染KAI1正义基因后显著下降(P<0.01),转染KAI1反义基因后显著增加(P<0.01),而转染空载体后无明显变化(P>0.1).结论 从细胞生物力学角度,KAI1基因可能增加肝癌细胞的粘弹性及降低细胞对细胞外基质FN的粘附力,从而抑制转移的初始步骤,进而抑制MHCC97-H肝癌细胞的侵袭和转移.     

KAI1 mRNA在消化道肿瘤表达的异质性与其控制转移机制不同有关

近来发现的一种肿瘤转移抑制基因——KAI1，属于细胞膜糖蛋白，研究表明该基因家族成员可能影响肿瘤细胞的转移生长，但它们的生理和病理机制仍不清楚^[1]。最近我们报道了在早期原发胰腺癌组织中KAI1 mRNA呈高表达，但     

KAI1基因抑制人胰腺癌细胞转移的体内实验

目的研究体内直接注射KAI1基因抗胰腺癌转移作用.方法 MiaPaCaⅡ胰腺癌细胞裸鼠皮下接种后,随机分为2个大组 (接种后第10天和第21天治疗组),每组再分别瘤内注射pCMV-KAI1重组质粒100 μg,pCMV-KAI1-脂质体(50μg∶50μg)和生理盐水,每7 d注射1次,共注射3次.于第50天观察KAI1对胰腺癌生长转移影响.结果接种后10 d进行基因注射组中,KAI1治疗组和脂质复合物治疗组肿瘤体积、瘤重、肺重、肝重和肺表面转移结节数均小于对照组(P < 0.05),体积抑瘤率分别为63.79%和73.51%,瘤重抑瘤率分别为77.12%和83.26%,肺重分别为(0.33 ± 0.09)g和(0.30 ± 0.09)g,肝重分别为(1.01 ± 0.27)g和(0.99 ± 0.21)g,对照组肺肝重分别为(0.45 ± 0.09)g和(1.62 ± 0.39)g,对照组肺表面转移结节数平均为(2.33 ± 1.63)个,治疗组结节数仅为(0.5 ± 0.83)个.pCMV-KAI1治疗组与脂质复合物治疗组相比差异无显著性(P > 0.05);接种后21 d进行基因注射组中,治疗组肿瘤体积、瘤重、肺重、肺转移灶和肝重与对照组相比差异无显著性(P > 0.05).结论 KAI1基因瘤内注射具有抑制MiaPaCaⅡ胰腺癌生长及转移作用,KAI1基因对已成瘤的胰腺癌生长的抑制作用与瘤内给药时间密切相关.