人牙髓干细胞向成牙本质细胞分化的诱导及鉴定

牙髓干细胞向成牙本质细胞的分化受多种细胞分化信号的调控。其中 ,骨形成蛋白、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、多种生长因子被认为在诱导其分化中起关键作用 ;而碱性磷酸酶、牙本质涎磷蛋白和牙本质基质蛋白 - 1常被用作鉴定其分化的特异性指标     

体外持续培养对人牙髓细胞分化能力的影响

目的：探讨人牙髓细胞在体外持续培养时，其分化能力的变化趋势。方法：体外持续培养人牙髓细胞，检测不同代次细胞的碱性磷酸酶活性、钙化能力及Ⅰ型胶原表达，并对比分析。结果：随着体外培养细胞代次的增多，在同等刺激分化条件下，人牙髓细胞的碱性磷酸酶活性整体呈下降趋势，钙化结节的数目和面积逐渐减少，Ⅰ型胶原表达合成逐渐减少。结论：人牙髓细胞在体外持续培养时，分化能力逐渐下降，可能与其含有的未分化细胞（人牙髓干细胞）数目逐渐减少有直接关系。     

敲减ALPL基因对人牙髓干细胞凋亡的影响

目的:观察敲减ALPL基因对人牙髓干细胞(h DPSCs)凋亡的影响。方法:取第3代h DPSCs,将其随机分为实验组和对照组后,通过慢病毒转染法敲减实验组h DPSCs的ALPL基因,并采用Western-Blot及ALP染色法检测两组细胞中ALP蛋白的表达水平。用Western-Blot和流式细胞术分别检测各组h DPSCs的凋亡状态及凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-8的表达水平。结果:Western-Blot及ALP染色结果显示,人ALPL敲减病毒颗粒能在h DPSCs中有效敲减ALPL基因;敲减ALPL基因后,可使h DPSCs的凋亡水平及其凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-8的表达水平明显上升(P<0.05)。结论:敲减ALPL基因可促进h DPSCs的凋亡。     

人牙髓干细胞的体外分离、培养及鉴定

目的 :体外分离、培养人牙髓干细胞 ,从不同角度对其进行鉴定。方法 :采用胶原酶和Dispase酶联合消化法培养人牙髓干细胞 ,有限稀释法分离纯化 ,将克隆形成的细胞通过透射电镜观察其超微结构、流式细胞仪细胞周期分析及抗波形丝蛋白 (Vimentin)、CD44、骨粘素 (ON)、牙本质涎蛋白 (DSP)免疫组化染色方法进行鉴定。结果 :通过有限稀释法获得了人牙髓干细胞克隆 ,透射电镜下观察这种克隆形成细胞具有干细胞典型的超微结构特点 ,大多数细胞处于G0 /G1期 ,为细胞周期的静止期 ,并具有牙源性未分化间充质细胞的表型特点。结论 :克隆化培养是人牙髓干细胞较为有效的分离纯化方法 ,该方法分离的人牙髓干细胞具有干细胞的结构、细胞周期及表型特点。     

EMPs对人牙髓干细胞增殖分化影响的实验研究

目的：将人牙髓干细胞（human Dental Pulp Stem Cells,hDPSCs）与釉基质蛋白（Enamel Matrix Proteins,EMPs）按一定浓度结合,测定牙本质涎磷蛋白（dentin sialoprotein,DSPP）、波形蛋白（vimentin）、碱性磷酸酶（alkaline phophatase,ALP）的表达,阐述EMPs对人牙髓干细胞增殖分化的影响.方法：分别将浓度为100 μg/mL、200μg/mL的EMPs加入培养中的人牙髓干细胞中,分别于3d、5d、7d、9d、11d对细胞进行免疫组化染色,检测细胞爬片DSPP、vimentin、ALP的表达.结果：未经EMPs诱导的人牙髓干细胞DSPP少量细胞阳性表达,vimentin表达阴性,ALP表现低活性.经200 μg/mL的EMPs诱导5d后,人牙髓干细胞DSPP、vimentin染色呈阳性表达,ALP活性明显增加.结论：EMPs对人牙髓干细胞增殖及分化具有促进作用,200 μg/mL的浓度效果最为显著.     

Notch配体Delta1对人牙髓干细胞分化的影响

目的:探讨Notch配体Delta1对体外人牙髓干细胞(dentalpulpstemcells,DPSCs)向成牙本质细胞分化能力的影响。方法:利用逆转录病毒载体建立高表达人Delta1基因的人牙髓干细胞系;实验分三组,正常牙髓干细胞组、转导细胞组及混合组(正常与转导细胞比例为100∶1),分别进行体外分化诱导。倒置显微镜观测各组细胞各生长期出现的时间;VonKossa染色计数各组形成钙化结节数;Westernblot法检测各组细胞牙本质涎磷蛋白表达。结果:与正常牙髓干细胞相比,转导细胞各生长期出现时间明显提前,形成的钙化细胞结节数目显著增加,牙本质涎磷蛋白表达显著升高。结论:Delta1基因转导牙髓干细胞仍保持了体外向成牙本质细胞分化的能力;Notch-Delta1信号与分化诱导因子协同作用可促进人牙髓干细胞向成牙本质细胞分化。     

MEPE基因沉默对人牙髓细胞增殖与成牙本质分化的作用研究

目的：研究细胞外基质磷酸化糖蛋白（Matrix Extracellular Phosphoglycoprotein,MEPE）基因沉默对人牙髓细胞（Human Dental Pulp Cells,hDPCs）增殖和成牙本质分化能力的影响,探讨其在牙髓损伤修复中的功能.方法：酶消化组织块法分离培养hDPCs,以lipo2000介导siRNA-hMEPE转染hDPCs,以阴性对照组和未转染组设为对照,l、3、5、7d后,CCK-8法检测细胞增殖情况;转染hDPCs后以矿化诱导液培养5、7、10d后,实时荧光定量RT-PCR检测骨涎蛋白（bone sialoprotein,BSP）、牙本质涎磷蛋白（Dentin Sialophos-phoprotein,DSPP）、骨钙蛋白（osteocalcin,OCN）、Collagen I mRNA表达水平.结果：CCK-8结果显示Si-h-MEPE转染hDPCsld后OD值下降,3d时到达最低值,且均低于未转染组与阴性对照组,3d时差异有统计学差异（P＜0.05）,未转染组与阴性对照组中,OD值持续升高,7d时到达峰值,与各自组内其他时间点比较有统计学差异（P＜0.05）;ALP活性检测结果显示,Si-h-MEPE转染hDPCs3d细胞OD值最低,且明显低于未转染组与阴性对照组（P＜0.05）,未转染组与阴性对照组hDPCsOD值呈现逐渐升高趋势,在7d时达到最大值（P＜0.05）.Si-h-MEPE转染hDPCs3d时BSP、DSPP、OCN、Collagen Ⅰ mRNA的表达量均较未转染组与阴性对照组下调（P＜0.05）.在未转染组中,BSP、DSPP、OCN、Collagen Ⅰ mRNA水平持续升高,在7d时达最高值,与3d比较差异有统计学意义（P＜0.05）.结论：MEPE基因瞬时沉默抑制hDPCs增殖、使BSP、DSPP、OCN、Collagen Ⅰ基因表达下调,ALP活性降低,与未转染组与阴性对照组比较结果提示MEPE可能通过调控hDPCs的增殖和成牙本质分化能力,在牙髓损伤修复中发挥重要作用.     

人胎儿骨髓基质干细胞的分离、体外培养和鉴定

目的 分离培养并鉴定人胚胎骨髓基质干细胞。方法 抽取流产胎儿股骨骨髓，Percoll离心纯化分离，取界面有核细胞培养。不同培养基培养对比，观察细胞生长曲线，免疫细胞化学鉴定细胞膜表面分子。结果 得到纯化率较高的骨髓基质干细胞(MSCs)，用αMED比DMEM和RPM11640原代培养生长速度快，第二代MSCs在上述三种培养基中倍增时间分别为43h、54h、56h。免疫细胞化学结果99％CD4( )、98％Vim( )、所有细胞CD34(-)、CD29(-)。结论 Percoll离心法成功地分离纯度较高的MSCs。MSCs在αMEM中培养增殖率比在DMEM和M1640中培养为快。     

人年轻恒牙牙髓细胞的组织块培养法

目的探索组织块培养法在人牙髓细胞体外培养中的应用。方法选择因正畸拔除的完整无龋双尖牙，无菌条件下取出牙髓，组织块培养法进行原代培养，倒置显微镜观察细胞形态，取第4代细胞测定生长曲线并进行细胞来源鉴定。结果体外培养人牙髓细胞呈成纤维细胞样，抗波形丝蛋白染色阳性，抗角蛋白染色阴性。结论组织块法是人牙髓细胞体外培养的较为简单可行的方法。     

RA、SHH和bFGF体外诱导人牙髓干细胞向神经细胞分化的研究

从因正畸或阻生拔除的第一前磨牙或第三磨牙中提取牙髓,采用酶消化及过滤法得到单细胞悬液,有限稀释法培养分离的原代DPSCs,并进行克隆化培养,检测STRO-1的表达。将DPSCs分别接种于含有不同浓度诱导液,MTT法检测三种因子对细胞增殖能力的影响,免疫荧光法检测微管相关蛋白(microtubule-associated protein-2,MAP-2)、神经元烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein,GFAP)的表达。     

牙髓培养细胞特性与牙髓干细胞定位

目的 比较人牙根髓与冠髓培养细胞的特性，探讨牙髓干细胞在牙髓中的定位。方法：用组织块法分别培养人根髓、冠髓细胞，观察并比较两者的培养成功率、细胞贴壁率、细胞活性、增殖特性、细胞形态以及细胞诱导矿化能力，以探讨牙髓干细胞在牙髓组织中的定位。结果：培养的根髓细胞比冠髓细胞具有较高的成功率和贴壁率、较强的细胞活性以及相同的增殖活性，根髓细胞比冠髓细胞的形态更具有原始性，根髓比冠髓更易诱导矿化。结论：牙髓干细胞可能存在于全部牙髓之中，在根髓中比冠髓中具有更高的密度．     

脂多糖刺激人牙髓干细胞分泌的外泌体联合基质细胞衍生因子-1对牙髓再生的影响

目的探讨轻度炎症状态下人牙髓干细胞(human dental pulp stem cell,hDPSC)产生的外泌体与基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)联合应用对牙髓组织再生的影响。方法分离培养hDPSC,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激hDPSC,超速离心法提取hDPSC经LPS刺激后产生的外泌体(exosomes from lipopolysaccharide-stimulated hDPSC,L-EXO)和正常状态下分泌的外泌体(exosome from normal hDPSC,N-EXO),通过透射电镜和蛋白质印迹法鉴定提取物。将40只6~8周龄的SD大鼠通过随机数字表法分为S组(单独应用SDF-1)、L+S组(SDF-1与L-EXO联合应用)、N+S组(SDF-1与N-EXO联合应用)和空白对照组(根管内不植入任何物质),每组10只。以双侧下颌第一磨牙为实验牙,建立大鼠无髓根管模型,根据分组分别在根管内植入不同的内容物。植入后30 d过量麻醉处死所有大鼠,取大鼠双侧下颌骨组织,应用HE、Masson及免疫组织化学染色法进行组织学评价。结果HE染色结果显示,除空白对照组外,其他3组根管内均可见新生牙髓样组织,其中L+S组根管内新生组织的量及组织中的细胞数量最多,S组最少。Masson染色结果显示,L+S组矿化组织沿根管壁纵向排列,胶原纤维有序排列,N+S组呈无规律紊乱分布。定量分析各组新生血管面积,结果显示L+S组血管密度[(2.03±0.65)%]显著高于S组[(0.65±0.05)%]及N+S组[(1.06±0.38)%](F=5.879,P<0.05)。免疫组织化学结果显示,S组及L+S组的趋化因子受体4表达量显著低于N+S组(F=8.633,P<0.01)。结论hDPSC分泌的外泌体联合SDF-1可提高根管内新生组织的量和组织中的血管密度,L-EXO的作用较N-EXO强,并且新生组织中胶原纤维及矿化组织的排列更规律有序。     

人乳牙牙髓干细胞和恒牙牙髓干细胞的蛋白质组学比较

目的 采用蛋白质组学方法研究人乳牙牙髓干细胞（SHED）和恒牙牙髓干细胞（DPSC）中的蛋白表达差异.方法 应用双向凝胶电泳技术分离SHED和DPSC的细胞总蛋白.通过比较两种细胞的蛋白组学图谱,确定差异表达的蛋白点,而后对差异点进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析和蛋白数据库信息检索,对差异蛋白进行功能分类.结果 建立了SHED和DPSC的蛋白质组图谱,经软件分析出45个差异蛋白点,其中26个表达上调,19个表达下调,再经质谱鉴定出48种蛋白,其生物学功能涉及细胞周期、代谢等.结论 SHED与DPSC中蛋白的差异表达体现了两种细胞在结构和功能上的异同性,为进一步研究SHED和DPSC在增殖、分化中的差异,以及牙齿相关干细胞在组织工程和再生医学研究中的应用提供参考.     

大鼠牙髓干细胞与牙乳头间充质细胞成牙能力的比较研究

目的:探讨采用牙髓干细胞替代牙乳头间充质细胞进行牙齿再生研究的可行性。方法:分别分离培养6周龄SD大鼠切牙牙髓干细胞(DPSCs)和出生1d的SD仔鼠切牙牙乳头间充质细胞(DPMCs),对上述2种细胞的表面标记、增殖能力、体外矿化能力以及向成牙本质细胞分化能力进行比较。结果:DPSCs与DPMCs均具有较强的增殖能力和矿化能力,体外诱导均有成牙本质细胞特异性标记物DSPP基因表达,体内移植后均能够形成牙本质样结构。结论:DPSCs是一种较为理想的牙胚间充质细胞的替代细胞,在适宜的诱导环境中能够替代DPMCs进行牙齿的再生研究。     

无翅型MMTV整合位点家族成员10A在人牙髓组织和细胞中的表达

目的 观察无翅型MMTV整合位点家族成员10A(wingless-type MMTV integration site family,member 10A,Wnt10A)及Wnt通路相关分子在人牙髓组织和牙髓细胞中的表达特征,为进一步研究Wnt10A在人牙髓细胞增殖分化中的作用提供分子生物学依据.方法 选取因正畸或治疗原因拔除的完整离体双尖牙和第三磨牙,免疫组化法观察Wnt10A在牙髓组织中的定位表达,PCR法观察Wnt10A、Wnt通路下游分子及成牙本质细胞分化标志物(轴心抑制蛋白2、Dickkopf相关蛋白1、低密度脂蛋白受体相关蛋白4、淋巴增强因子1、骨钙蛋白、碱性磷酸酶、牙本质涎磷蛋白)在牙髓组织中的表达.采用酶组织块消化法体外培养人牙髓细胞并传代培养;PCR法分析第1～9代人牙髓细胞中Wnt10A、Wnt通路下游分子及成牙本质细胞分化标志物的表达水平.结果 免疫组化法和半定量PCR法结果显示Wnt10A和Wnt通路相关分子在牙髓组织中均有表达.体外培养的人牙髓细胞培养至第15天汇合并传代,传至第4代,细胞活跃增殖,细胞胞质清亮,伸展均一;至第9代,细胞增殖减缓,部分细胞死亡.Wnt10A和Wnt信号通路下游分子在整个牙髓细胞的体外传代培养中均有表达,牙本质涎磷蛋白在第4代牙髓细胞中表达水平最高(0.4178 ±0.0076),Wnt10A在第5、9代牙髓细胞中的表达水平[分别为(4.97 ±2.83)、(4.70±4.06)]均显著高于第2、4代[分别为(0.84 ±0.66)(0.70±0.45)](P＜0.05).结论 Wnt10A介导的Wnt信号通路在人牙髓组织和细胞中有表达激活,可能参与了成牙本质细胞的分化和牙本质的形成.     

人牙髓细胞与牙周韧带细胞多向分化能力的比较

目的 比较人牙髓细胞(dental pulp cells,DPC)和牙周韧带细胞(periodontal ligamentcells,PDLC)的多向分化能力,揭示其干细胞成分特征,为开展干细胞介导的生物牙根再生奠定实验基础.方法 酶消化法分离培养人DPC和PDLC,流式细胞术检测STRO-1的表达.诱导细胞成牙本质及成骨分化、成脂分化和成软骨分化,von Kossa染色、抗骨钙素(osteocalcin,OCN)和牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)免疫组化染色、油红O染色、阿新蓝染色、抗Ⅱ型胶原免疫组化染色以及实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)等检测DPC和PDLC的多向分化.结果 DPC和PDLC体外呈克隆样生长,STRO-1阳性率分别是(16.5%±4.2%)和(11.6%±1.1%).100%的DPC和83.3%的PDLC样本可多向分化.细胞诱导分化后,OCN、牙本质涎磷蛋白(dentinsialophosphoprotein,DSPP)、过氧化物酶体激活物增生受体2(peroxisomal proliferator activated receptorgamma 2,PPARγ2)、脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)和Ⅱ型胶原mRNA表达上调,与诱导前相比差异均有统计学意义(P<0.001),DPC和PDLC间OCN和PPARγ2基因上调倍数的差异有统计学意义(P<0.001).结论 人DPC和PDLC的间充质干细胞比例和多向分化能力相似.     

Effects of cryopreservation on the characteristics of dental pulp stem cells of intact deciduous teeth

Objectives

The aim of this study was to isolate and cultivate cells from the pulp of 7-day-cryopreserved intact deciduous human teeth and evaluate the effect of cryopreservation on dental pulp stem cell (DPSC) characteristics.

Design

Twenty-six deciduous teeth were collected and allocated in two groups: immediate cell isolation (non-cryopreserved group) and intact cryopreserved (cryopreserved group). The teeth were cryopreserved in dimethylsulfoxide solution and recovered after 7 days. The success rate of isolation, proliferation, surface markers (CD14, CD29, CD34, CD45, CD73, CD90, and HLA-DR), differentiation capacity, and morphology were evaluated.

Results

Isolation success rate was 61% and 30% for the non-cryopreserved and cryopreserved groups, respectively. There were no statistical differences between the groups for the tested surface markers. The cells in both groups were capable of differentiating into three mesenchymal lineages. No statistical differences between the groups were observed through the time course proliferation assay (0, 1, 3, 5, and 7 days); however, the mean time between isolation and the fifth passage was shorter for the non-cryopreserved group (p = 0.035). The morphology of the cells was considered altered in the cryopreserved group.

Conclusion

DPSCs were obtained from cryopreserved intact deciduous teeth without changes in the immunophenotypical characteristics and differentiation ability; however, lower culture rates, proliferation potential, and morphological alterations were observed in relation to the control group.