人survivin蛋白的原核表达、纯化及抗原活性鉴定

目的 构建人肿瘤抗原survivin的原核表达载体,优化在大肠杆菌中的表达条件,并对survivin/His融合蛋白进行纯化和抗原活性鉴定.方法 设计针对survivin基因序列的特异引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增人survivin全长基因序列(538 bp)克隆至原核表达载体pET28a(+),构建重组表达载体pET28 a-survivin,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达survivin/His融合蛋白,并采用Ni亲和层析凝胶纯化重组蛋白.纯化后的重组蛋白经Western blot法、ELISA鉴定其抗原活性.结果 重组表达载体经BamH Ⅰ和HindⅢ鉴定正确;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明获得了相对分子质量(Mr)24000大小的重组蛋白;纯化后的蛋白纯度达到90％.Western blot法和ELISA检测证实纯化的survivin蛋白能够与特异性抗体发生反应,表明其具有良好的抗原活性.结论 成功构建了原核表达载体pET28 a-survivin,利用大肠杆菌表达系统实现了融合蛋白的可溶性表达并进行纯化,纯化后survivin蛋白经鉴定具备较高的抗原活性.     

人FOXP3 cDNA的克隆及在原核细胞中的表达

目的:克隆人FOXP3cDNA,构建其原核表达载体,在大肠杆菌中表达。方法:从新生儿脐带血获得FOXP3mRNA,用巢式RT-PCR技术扩增FOXP3cDNA,产物纯化后T-A克隆连接至pMD18-T载体,构建其原核表达载体pRSET-A-FOXP3,转化大肠杆菌BL-21(DE3)pLysS,IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE及Western blot检测和鉴定。结果:获得FOXP3mRNA,并对其编码区cDNA序列进行扩增。PCR产物连接至原核表达载体pRSET,经DNA测序,证实与Gen-Bank中的人FOXP3编码序列一致。经SDS-PAGE及Western blot显示在相对分子质量(Mr)约为52000处出现融合表达条带,表达量约占菌体蛋白总量的20%。结论:成功地克隆人FOXP3cDNA,构建了其原核表达载体,并在大肠杆菌中得到有效表达。     

小鼠IL-17A-GST融合蛋白的克隆表达

目的: 构建含有小鼠IL-17A(mIL-17A)基因的重组原核表达载体,获得高效表达mIL-17A 的基因工程菌,以及较高产量的mIL-17A蛋白.方法:以PMA 活化后小鼠脾脏单个核细胞的总RNA 逆转录合成的cDNA为模板,PCR 法扩增mIL-17A的编码序列,并分别亚克隆至pMD18-T 载体和原核表达载体pGEX-4T-1 中,经酶切和DNA测序鉴定后,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果:PCR 产物大小及其双酶切鉴定均证明所克隆的基因是mIL-17A,DNA 序列测定进一步证实与GenBank 报道的序列完全一致成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1/mIL-17A,并在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约40 000的具有可溶性的融合蛋白,且Western blot证实确为目的蛋白结论: 成功构建了基因重组体pGEX-4T-1/mIL-17A;并制备出可溶性IL-17A-GST融合蛋白. E3),IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果:PCR 产物大小及其双酶 鉴定均证明所克隆的基因是mIL-17A,DNA 序列测定进一步证实与GenBank 报道的序列完全一致成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1/mIL-17A,并在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约40 000的具有可溶性的融合蛋白,且Western blot证实确为目的蛋白结论: 成功构建了基因重组体pGEX-4T-1/mIL-17A;并制备出     

人分泌型白细胞介素-16基因的克隆及其原核表达

目的:克隆人分泌型IL-6 cDNA,构建IL-16的原核表达质粒,并观察其在大肠杆菌中的表达.方法:采用PCR技术从健康成人外周血单个核细胞(PBMC)总cDNA文库中扩增人分泌型IL-16 DNA片段;PCR产物分离纯化后,将其克隆至pUC18-T载体中,经PCR、酶切鉴定及DNA测序确证后,将该基因定向插入原核表达载体pMAL-C2,获得重组质粒pMAL-IL-16,然后将其转化至E.coli DH5α,经IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE及Western blot法鉴定表达产物.结果:获得了编码人分泌型IL-16的cDNA,经测序证明其长度为393 bp,编码130个氨基酸;构建了IL-16原核表达载体,并应用E.coli DH5α表达,得到1个相对分子质量(Mr)约56000的IL-16重组融合蛋白,与理论大小相符,且经SDS-PAGE及Western blot法验证.表明人分泌型IL-16原核表达载体构建并表达成功.结论:本实验成功克隆了人分泌型IL-16 cDNA,构建了IL-16原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达,为IL-16的纯化奠定了基础.     

输血传播病毒部分基因的克隆表达及表达产物活性的初步鉴定

目的　构建含输血传播病毒(TTV)部分基因序列的原核表达载体并进行表达及产物活性的鉴定。方法　在计算机模拟基础上,采用PCR的方法　,从一名非甲～庚肝炎患者血清中,扩增编码蛋白具有抗原活性的TTVORF2部分基因片段。将该片段插入表达载体pQE-30,在大肠埃希菌中进行表达并利用酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定表达产物活性。结果　SDS-PAGE电泳后经电脑分析显示,表达产物相对分子质量与预计相同,表达量占菌体总蛋白量的22.33％。经ELISA检测表明表达产物有结合抗体活性。结论　成功构建了含TTV部分基因的原核表达载体,表达产物具有抗原活性。     

小鼠cdc25B蛋白特定序列的克隆及原核表达

目的:构建小鼠cdc25B蛋白特定序列的原核表达载体,并诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白。方法:采用PCR方法从小鼠cdc25B野生型及位点突变型蛋白编码序列中扩增出约360个碱基的片段,构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导后进行融合蛋白表达。Western blot鉴定表达产物。结果:构建出带有GST标签的原核表达载体,在大肠杆菌BL21中表达出相对分子质量(Mr)为40000的重组蛋白质,经Westernblot鉴定,可与GST单克隆抗体结合,发生特异性反应。结论:利用原核表达系统成功表达出小鼠cdc25B蛋白特定序列的蛋白质,为进一步探讨与其他蛋白相互作用提供了基础。     

SERPINA3K原核表达系统的构建及其表达

目的：通过构建丝氨酸蛋白酶抑制因子SERPINA3K的原核表达载体,并将其转化到Rosetta-g ami2感受态细胞中,表达重组SERPINA3K,从而为对其功能的深入研究奠定了基础.方法：以小鼠MS-1细胞cDNA为模板通过PCR的方法扩增Serpina 3k基因的表达全片段,再将其插入到原核表达载体pET-41a中,酶切并测序鉴定重组体.将构建好的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta-gami2感受态细胞,表达产物用Western blot鉴定.结果：原核表达载体pET-4 1a-Serpina 3k成功构建,可在大肠杆菌Rosetta-gami2中高效表达,得到重组蛋白SERPINA3K,经Western blot鉴定正确.结论：成功构建SERPINA3K原核表达载体且获得表达,为研究SERPINA3K生物学活性及产品开发提供了实验基础.     

人IL-1β的克隆及其高效可溶性表达

目的:从人淋巴细胞中克隆白介素-1β(IL-1β)cD-NA,通过原核可溶性表达纯化,获得具有生物活性的可溶性IL-1β,为深入研究和利用IL-1β基因奠定基础.方法:从人PBMC中克隆出人成熟IL-1β基因,并插人到原核表达载体pSUMO中SUMO标签的下游,构建重组表达载体pSUMO-hIL-1β.将该载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达hIL-1β/SUMO融合蛋白,经Ni-NTA Agaroae纯化后,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.用protease-1切去SUMO标签,用Real time-PCR鉴定其对人T细胞表达的细胞因子的影响.结果:SDS-PAGE分析表明表达产物的相对分子质量(Mr)为37 000,成熟蛋白Mr为17 000,与理论值相符.灰度扫描分析融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的约30%左右,主要以可溶形式存在.Western blot证实该蛋白为hIL-1β.成熟蛋白纯化产物纯度超过90%以上.通过RT-PCR检测证明其具有刺激人T细胞大量表达多种细胞因子(IL-1β,IL-4,IL-10,IL-18,IFN-γ,TGF-β,TNF-α)的活性.结论:利用大肠杆菌表达系统完全可以高效可溶性表达较高纯度的具有生物活性的hIL-1β蛋白.     

人DC-SIGN全长编码区基因的克隆及其胞外段的原核表达

目的:克隆人DC-SIGN全长编码区基因, 获得其胞外段的原核表达产物.方法:采用RT-PCR方法, 从健康产妇胎盘中克隆DC-SIGN全长cDNA, 扩增其胞外段基因并构建pET41a-sDC-SIGN重组表达质粒, 在大肠杆菌BL21(DE3)中表达, 以SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物.结果:从健康产妇胎盘总RNA中, 扩增获得约1 300 bp的DNA片段, 克隆至pGM-T载体获得重组质粒pGM-DC-SIGN.从pGM-DC-SIGN扩增DC-SIGN的胞外段基因, 构建重组表达质粒pET- 41a-sDC-SIGN;纯化表达产物sDC-SIGN-GST, 鉴定其相对分子质量( M r)为66 000, Western blot证明其可与抗DC-SIGN抗体特异性结合.结论:成功克隆DC-SIGN全长编码区基因, 并在大肠杆菌中成功表达其胞外段融合蛋白sDC-SIGN-GST, 为进一步研究DC-SIGN的功能奠定了基础.     

提高树突状细胞腺病毒感染效率的融合蛋白的表达及活性鉴定

目的构建表达靶向树突状细胞融合蛋白CT40L的原核表达载体,在大肠杆菌中表达,并对CT40L融合蛋白进行纯化鉴定及功能验证。方法从GenBank上查找柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)、T4噬菌体fibritin和小鼠CD40L的基因序列,并将其主要功能区域连接形成拼接序列;序列进行原核表达密码子优化后将其克隆至原核表达载体pET42a(+),构建重组表达载体pET42a-CT40L,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达CT40L/GST融合蛋白,并采用GST琼脂糖凝胶纯化重组蛋白。纯化后的重组蛋白经Western blot法、间接ELISA鉴定其免疫活性。结果重组表达载体经NcoⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定正确;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明获得了相对分子质量(Mr)78 000大小的重组蛋白;纯化后的蛋白纯度达到90%。Western blot法和ELISA检测证实纯化的CT40L分子能够与特异性抗体及相应受体发生反应,表明该融合蛋白具有良好的免疫学活性。结论成功构建了原核表达载体pET42a-CT40L,利用大肠杆菌表达系统实现了融合分子的可溶性表达,纯化后CT40L融合蛋白经检测具备较高的免疫学活性。     

人PD-L1 cDNA的克隆及其胞外区蛋白在大肠杆菌中的表达

目的：克隆人PD-L1基因的cDNA并构建PD-L1胞外区基因的原核表达载体，在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR法从活化的人淋巴细胞总RNA中，扩增并克隆PD-L1的cDNA，构建PD-L1胞外区基因的原核表达载体，在大肠杆菌BL21(ED3)中进行表达并鉴定。结果：克隆到PD-L1 cDNA编码区的全长序列，经DNA测序证明其与已报道的序列一致。同时构建了在羧基端带有His6标签的PD-LI胞外区基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中表达。免疫印迹分析表明，在IPTG诱导后表达的PD-L1胞外区蛋白，相对分子质量(Mr)为25000，与理论值的大小相符。该重组蛋白能与抗His6标签的单抗(mAb)特异性反应。结论：成功地克隆PD-L1基因，其胞外区蛋白在大肠杆菌中获得表达，为利用PD-L1转基因修饰移植物或以PD-L1重组蛋白抑制移植排斥反应等研究提供了条件。     

白细胞介素-24基因重组表达载体的构建及原核表达

目的：构建人白细胞介素-24(hIL-24)基因的表达载体并在大肠杆菌中表达。方法：用PCR从质粒TRAP-IL-24中扩增hIL-24 cDNA片段，并将该片段插入pGEX-KG原核表达载体中，实现插入基因的融合表达。用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。采用MTT法检测GST-IL-24融合蛋白的生物学活性。结果：酶切结果证实，成功地构建了pGEX-KG-IL-24原核表达载体，并在大肠杆菌中获得稳定的表达，表达产物的相对分子质量(M1)同预期值相-致。GST-IL-24融合蛋白能够抑制THP-1细胞的生长。结论：成功地构建了重组表达载体pGEx-KG-IL-24，并在E．coli BL21中表达了具有生物学活性的GST-IL-24融合蛋白，为下-步研究人IL-24的功能奠定了基础。     

人PD-L2基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人PD-L2基因并构建PD-L2胞外区的原核表达载体，在大肠杆菌中进行表达。方法 以RT-PCR方法从活化的人外周血单个核细胞总RNA中克隆PD-L2基因的cDNA，构建PD-L2胞外区的原核表达载体，在大肠杆菌BL21(ED3)中进行表达并鉴定。结果 克隆到PD-L2基因cDNA编码区全长序列，经DNA测序证明其与已报道的序列一致。进而构建了PD-L2胞外区的原核表达载体，并在大肠杆菌表达，免疫印迹分析表明在IPTG诱导后表达PD-L2胞外区蛋白，相对分子质量Mr为22000，与理论值大小相符。结论 成功克隆PD-L2基因，其胞外区蛋白在大肠杆菌中获得表达，为进一步研究PD-L2功能提供了条件。     

结核分枝杆菌lhp基因原核表达载体的构建和表达

目的：构建结核分枝杆菌(MTB)lhp和基因原核表达载体并进行表达。方法：用PCR扩增MTB lhp基因，并克隆入pQE30质粒。测序正确后，再亚克隆入pET32a( )质粒，构建pQE30—CFP10和pET32a( )—CFP10重组体。结果：以重组体分别转化DH5α和BL21(DE3)菌后，经IPTG诱导，pQE30—CFP10未表达目的蛋白；而pET32a( )—CFP10则表达出Mr为20000左右重组蛋白。SDS—PAGE分析显示，IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高：表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞质中，表达量占全菌蛋白质的38%，用Western blot证实其具有良好的抗原性。经Ni—NTA柱纯化，获得纯度为93%的重组蛋白。结论：成功地构建原核表达载体pET32a( )—CFP10，并获得重组CFP10蛋白，为MTB重组抗原的应用奠定了基础。     

人瘦素基因在胎盘中的分离鉴定及在大肠杆菌中的融合表达

目的 克隆人瘦素(leptin)基因,构建融合表达载体,实现在大肠杆菌中的高效表达.方法 从人胎盘中提取RNA,利用反转录聚合链式反应(RT-PCR),克隆到人的leptin基因编码序列,对该基因片段进行T载体克隆、酶切和PCR鉴定,并且对其进行序列分析.将leptin基因插入到原核表达载体PET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析,并利用脱氧胆酸钠对表达蛋白进行纯化.结果 DNA序列分析表明,从胎盘中克隆的人leptin序列与文献报道的一致,酶切鉴定证实leptin基因正确地插入到了表达载体中,经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳分析,人leptin基因在大肠杆菌中实现了高效融合表达,表达产物的分子量为20kD,经过纯化,得到了较纯的融合表达蛋白.结论 从人胎盘中成功克隆了leptin基因,构建了原核表达载体,实现了在大肠杆菌中的高效表达,为进一步研究leptin的生物学功能奠定基础.     

BirA酶基因表达载体的构建、原核表达及表达产物的活性鉴定

目的:构建生物素-蛋白连接酶(BirA酶)基因的表达载体,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中表达具有生物学活性的BirA酶。方法:用PCR法扩增BirA酶基因。将PCR产物克隆入pGEX-4T-2中构建BirA酶-GST融合蛋白基因的重组表达载体pGEX-BirA。经测序验证后,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,表达产物采用谷胱苷肽-琼脂糖层析柱进行纯化。以带有生物素酶底物肽(BirAsubstratepeptide,BSP)的HLA-A2-肽复合物为底物,用ELISA和Westernblot鉴定表达产物的生物素化活性。结果:构建了pGEX-BirA原核表达质粒,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达Mr为61300的BirA酶-GST融合蛋白,表达产物经谷胱苷肽-琼脂糖层析柱纯化后,得到N端带有GST标签的BirA酶蛋白。ELISA和Westernblot的结果显示,表达产物能使HLA-A2-肽复合物生物素化。结论:成功地制备了具有生物学活性的Bi-rA酶,为研究蛋白质分子的相互作用提供了有效的制剂。     

人CIDE-3基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的:构建人CIDE-3基因的原核表达载体,并在E.coliBL21(DE3)中表达。方法:提取人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞的总RNA,经RT-PCR扩增人CIDE-3基因片段,并将其克隆入原核表达载体pET28a( )中,构建重组质粒pET28a( )-CIDE-3。经限制性内切酶BamHI、XhoI双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果:获得全长为516bp的人CIDE-3基因片段。以构建的重组质粒pET28a( )-CIDE-3转化E.coliBL21(DE3)后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量(Mr)约为23000的重组CIDE-3蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coliBL21(DE3)的胞质中,表达量约占全菌蛋白的32%。结论:成功地构建了原核表达载体pET28a( )-CIDE-3,并表达出重组CIDE-3蛋白,为进一步多克隆抗体的制备和凋亡的相关研究奠定了实验基础。     

内皮型一氧化氮合酶运输诱导物NOSTRIN基因的克隆与表达

目的构成内皮型一氧化氮合酶运输介导物(endothelial nitric oxide synthase traffic inducer,NOSTRIN)基因的原核表达重组体,并进行初步表达.方法从人胎盘组织中提取总RNA,经反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出NOSTRIN基因;将NOSTRIN基因克隆入pGEM-T载体中,经DNA测序确认后,构建原核表达重组体pRSET-NOS,在工程菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达.结果所获得的NOSTRIN基因测序正确,并表达重组蛋白,经SDS-PAGE分析,相对分子量为58KD.结论构建的原核表达重组体pRSET-NOS能高效表达重组NOSTRIN蛋白.     

程序死亡蛋白1基因的克隆及原核表达

目的 克隆人程序死亡蛋白(PD-1)基因并构建PD-1蛋白的原核表达质粒,在大肠埃希菌中进行表达.方法 用RT-PCR的方法从慢性乙肝患者外周血淋巴细胞总RNA中逆转录得到PD-1基因的cDNA,构建PD-1基因的原核表达质粒,在大肠埃希菌BL21(DE3)中进行表达并纯化.用SDS-PAGE、DNA测序、氨基酸测序等方法对表达蛋白进行鉴定.结果 克隆到PD-1基因编码区全长序列cDNA,经DNA测序与已报道的序列同源性达99.8%.构建得到PD-1的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达,纯化获得纯度较高的PD-1蛋白.氨基酸测序证明表达蛋白的正确性.结论 成功克隆人PD-1基因,在大肠埃希菌中获得表达,得到纯化的PD-1蛋白,为进一步研究PD-1蛋白的功能及应用打下基础.